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Resumen

El láser de femtosegundo sin enfoque puede proporcionar una estimulación precisa a las células al acoplarse en una microscopía confocal que permite la observación en tiempo real y la fotoestimulación. La fotoestimulación puede activar eventos moleculares celulares, incluyendo la vía de señalización ERK y destellos mitocondriales de especies reactivas de oxígeno.

Resumen

El control directo de los eventos moleculares definidos celulares es importante para las ciencias de la vida. Recientemente, los estudios han demostrado que la estimulación láser de femtosegundo puede activar simultáneamente múltiples vías de señalización molecular celular. En este protocolo, mostramos que a través del acoplamiento del láser de femtosegundo en un microscopio confocal, las células pueden ser estimuladas con precisión por el láser estrechamente enfocado. Algunos procesos moleculares que se pueden observar simultáneamente se activan posteriormente. Presentamos protocolos detallados de la fotoestimulación para activar la vía de señalización de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) en las células de Hela. Los destellos mitocondriales de especies reactivas de oxígeno (ROS) y otros eventos mitocondriales también se pueden estimular si se centra el pulso láser de femtosegundo en una determinada estructura tubular mitocondrial. Este protocolo incluye pretratar las células antes de la fotoestimulación, entregar la fotoestimulación mediante un destello láser de femtosegundo en el objetivo, y observar /identificar los cambios moleculares después. Este protocolo representa una herramienta totodológica para investigaciones biológicas relacionadas.

Introducción

La tecnología de control de moléculas de señalización celular es una parte importante del desarrollo de la ciencia de la vida. Tradicionalmente, el método más utilizado es el tratamiento bioquímico por fármacos o materiales biológicos1,2,3. Durante la última década, la invención de la optogenética abre una nueva era para la modulación de la señal molecular celular. La transfección con proteínas sensibles a la luz por la ingeniería génica hace que la luz se convierta en una poderosa herramienta para modular diversas actividades proteicas en la célula diana. Esta tecnología ha hecho progresos alentadores como la excitación e inhibición de la señal neuronal, la promoción de la expresión génica, la manipulación de patrones de señal celular, la conducción de diferentes destinos celulares y la investigación patológica4,5 ,6,7,8,9. Sin embargo, la luz sólo puede funcionar transfectando células con proteínas optogenéticas. En la etapa actual, existen métodos raros que permiten a la luz controlar las moléculas celulares directamente además de la optogenética.

El láser Femtosecond ha avanzado en investigaciones biológicas al proporcionar una excitación multifozona eficiente mientras mantiene una buena seguridad biológica. Mediante el despliegue de diversas estrategias de procesamiento fotográfico, ha logrado numerosos logros como microscopía multifotona, microcirugías y aplicaciones optogenéticas multifotones10,11,12,13 ,14,15,16. Investigaciones recientes muestran que la estimulación láser de femtosegundo se ha demostrado como un método óptico altamente eficiente para inducir directamente eventos de señalización molecular. Se ha encontrado que la irradiación láser de femtosegundo fuertemente enfocada en el retículo endoplasmático (ER) es capaz de agotar el calcio en ER y activar los canales de calcio activado por liberación de calcio (CRAC) para formar señales de calcio en las células17. Esta señal de calcio fotoactivada puede propagarse entre múltiples tipos de células18,19,20. Además, también tiene la capacidad de activar vías de señalización celular como el factor nuclear de las células T activadas (NFAT) y la vía de señalización ERK21,22. Al ajustar la intensidad y localización de la exposición láser de femtosegundo en las células, por ejemplo, enfocando el láser en las mitocondrias, puede influir en la morfología mitocondrial y los eventos moleculares23,24, 25. Específicamente, las ráfagas de generación de ROS mitocondrial pueden excitarse mediante la fotoestimulación, que se comenta como destellos fluorescentes en las mitocondrias (mitoflashes).

Por lo tanto, la tecnología de fotoestimulación es de buen potencial para ser ampliamente aplicada en la investigación biológica relacionada. También es una buena oportunidad para extender las aplicaciones láser de femtosegundo en el control de moléculas de señalización celular y funciones además de la microscopía. Aquí, proporcionamos los detalles técnicos de la fotoestimulación. La fotoestimulación se logra acoplando un láser de femtosegundo a un microscopio confocal para proporcionar una sola célula diana con una fotoestimulación flash corta. Puede iniciar la activación ERK eficiente y controlable en la célula. Si la fotoestimulación se encuentra en la estructura tubular mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, la morfología, el ROS y los poros de transición permeabilidad, pueden ser controlados por la fotoestimulación. Basándonos en este esquema de fotoestimulación, proporcionamos un método detallado para activar la vía de señalización ERK e influir en múltiples eventos mitocondriales en las células de Hela. Este protocolo aclara el proceso de entrega de estimulación láser de femtosegundo en las células diana.

El sistema de fotoestimulación se establece en un microscopio confocal con un acoplamiento láser de femtosegundo en él para la estimulación simultánea y la microscopía continua. El láser de femtosegundo (longitud de onda: 1.040 nm, velocidad de repetición: 50 MHz, ancho de pulso: 120 fs, potencia media de salida máxima: 1 W) se divide en dos haces antes del acoplamiento. Uno es guiado a través de un telescopio de relé que consiste en un par de lentes. A continuación, se refleja directamente en la apertura posterior de un objetivo (60x, N.A. a 1.2, inmersión en agua) para formar un enfoque de límite de difracción (Stim-A). El otro se refleja en la trayectoria óptica de escaneo del microscopio confocal para funcionar como un modo de escaneo de dos fotones (Stim-B). Stim-A presenta un punto de enfoque fijo en el centro del campo de visión (FOV). Stim-B es un área de escaneo confocal parcial prediseñada en el FOV. Stim-A y Stim-B se muestran en la Figura 1A. Una cámara CCD bajo el espejo dicroico (DM) proporciona imágenes de campo brillante para monitorear el enfoque del láser de femtosegundo.

Hay algunos elementos esenciales cruciales para los siguientes experimentos. En este protocolo, se utiliza como ejemplo una fuente láser de fibra de femtosegundo (1040 nm, 50 MHz, 120 fs). En la práctica, la mayoría de los osciladores de femtosegundos comerciales se pueden utilizar siempre y cuando el ancho del pulso sea inferior a 200 fs y la densidad de potencia máxima debe estar por encima del nivel de 1011 x 1012 W/cm2. Por ejemplo, un láser Ti: Sapphire que se utiliza generalmente para la microscopía multifotón es capaz de reemplazar el láser de femtosegundo mostrado en la Figura 1B. La potencia del láser y algunos otros parámetros de fotoestimulación necesitan ser ajustados porque los parámetros ópticos (ancho de pulso, longitud de onda y tasa de repetición) varían mucho en diferentes láseres de femtosegundos que por lo tanto inducen diferentes eficiencias de excitación multifotón.

Junto con la estimulación láser de femtosegundo, la microscopía confocal proporciona imágenes celulares continuas para monitorear la dinámica molecular en tiempo real en los modos Stim-A y Stim-B. Ambos esquemas de fotoestimulación (Stim-A y Stim-B) son controlados por un obturador mecánico con resolución de milisegundos (Figura1).

En el modo Stim-A, la posición del enfoque láser se fija en el centro de FOV. Un telescopio de relé se utiliza para asegurar el enfoque del láser de femtosegundo que se ubicará en el plano de imagen confocal ajustando la distancia entre dos lentes en la dirección vertical (la dirección de propagación láser, vertical al plano de imagen confocal, como se muestra en Figura 1). Por las imágenes de campo brillante de la cámara CCD, se puede medir el diámetro del enfoque láser (2 m, Figura 2B). Las duraciones de estimulación y los tiempos de exposición son controlados por un obturador durante el proceso de imagen confocal.

En el modo Stim-B, el área de estimulación se puede preasignar manualmente en el software de control de imágenes confocales a cualquier forma como línea, polígono o círculo. El obturador se sincroniza con el proceso de escaneo confocal. Se abre a la hora prediseñada que se establece a través del software de control de imágenes confocales. A continuación, el área de estimulación es escaneada por láser de femtosegundo como microscopía confocal. Por lo tanto, la muestra sólo es estimulada por láser de femtosegundo cuando el proceso de escaneo confocal entra en un marco de imagen dado.

El sistema de fotoestimulación se puede establecer en microscopios metalúrgicos invertidos y verticales según los sujetos del experimento. Las células in vitro cultivadas en platos Petri son mejores para trabajar con microscopios invertidos. Los animales, especialmente los cerebros de animales vivos, son más adecuados con microscopios verticales. En este estudio, tomamos el microscopio invertido como ejemplo. Cabe señalar que la cubierta de la placa Petri no se abre durante todos los experimentos.

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Protocolo

PRECAUCION: El protocolo que se presenta a continuación implica el uso de láser de femtosegundo NIR y productos químicos tóxicos. Por favor, preste atención a todos los posibles daños inducidos por los procedimientos del experimento. Lea las fichas de datos de seguridad de todos los productos químicos u otros materiales pertinentes antes de su uso. Siga las instrucciones de seguridad de las instalaciones láser o consulte a los profesionales para obtener orientación antes de operar la fuente láser.

1. Preparación experimental

  1. Configuración del sistema de fotoestimulación
    NOTA: El sistema consiste en un láser de femtosegundo y un microscopio confocal de escaneo láser (a alcance visible para excitación de fluorescencia). En la Figura1, se utiliza un láser de femtosegundo de fibra (1.040 nm, 50 MHz, 120 fs, 1 W) para el acoplamiento. Los parámetros no son fijos ni necesarios. Puede ser reemplazado por un láser Ti: Sapphire u otros osciladores comerciales de femtosegundoen en la gama NIR.
    1. Sintonice el láser de femtosegundo y el microscopio confocal.
      NOTA: Por favor, ajuste la potencia del láser de femtosegundo a un nivel bajo (50 mW) en el proceso de ajuste de la trayectoria óptica.
    2. Utilice espejos reflectantes (RM1 y RM2 mostrados en la Figura 1B)para dirigir el rayo láser de femtosegundo a través de un obturador mecánico. Abre el obturador.
    3. Ajuste un divisor de haz 50/50 (BS, Figura 1B)para dividir el haz láser de femtosegundo en dos haces separados (haz de transmisión y haz de reflexión). Dirija RM2 y BS para hacer que el rayo láser de femtosegundo coincida con el rayo láser de escaneo.
      NOTA: (1) Un iris de referencia (Iris 1, Figura 1B)detrás del espejo dicroico de paso largo (DM, longitud de onda de corte de 700 nm, Figura 1B)se utiliza para posicionar la trayectoria láser de escaneo. (2) El sistema solo puede funcionar en modo Stim-A o Stim-B, respectivamente. Para el modo Stim-A, la EB se puede quitar. Para Stim-B, la EB se puede reemplazar por un RM.
    4. Establecer un telescopio de relé que consiste en un par de lentes para ampliar el ancho del haz de transmisión, que consiste en la apertura posterior del objetivo.
      NOTA: (1) El iris de referencia 2 y 3 (Figura1B)se establecen para colimar el rayo láser de femtosegundo (Figura1B). (2) El aumento del telescopio de relé depende del diámetro original del rayo láser de femtosegundo y del diámetro de la apertura posterior del objetivo.
    5. Dirija los RM (RM 3-5, Figura 1B)para alinear el haz expandido en el microscopio. Dirija RM 4 y RM 5 para ajustar el enfoque del láser de femtosegundo al centro de FOV.
    6. Medir la eficiencia de transmisión del objetivo del láser de femtosegundo.
      NOTA: Por favor, mida la potencia del láser en Stim-A y Stim-B respectivamente debido a las diferentes trayectorias de penetración del láser en esos dos modos. Utilizará la potencia de la muestra para ilustrar los procedimientos de experimento relacionados a continuación.
    7. Sintonice el obturador, el láser de femtosegundo y el microscopio confocal hasta que comiencen los experimentos.
      NOTA: En los siguientes experimentos, Stim-A y Stim-B no funcionan juntos. Si se utiliza Stim-A, es necesario bloquear el rayo láser de femtosegundo de Stim-B. Por otro lado, el haz de Stim-A debe bloquearse si el sistema funciona en modo Stim-B.
  2. Preparar el medio de cultivo: La glucosa alta del medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco con un 10% de suero bovino fetal (FBS).
  3. Preparar el plásmido de ADN ERK2-GFP, el plásmido de ADN Mito-GFP y el plásmido de ADN circularmente permutado de proteína fluorescente amarilla (mt-cpYFP). Mantener los plásmidos a -20 oC hasta su uso.
  4. Preparar la tetrametilrepodmina (TMRM, 100 m) y la polietilenimina (PEI 1 mg/ml). Mantenerlos a -20 oC hasta su uso.
  5. Preparar 5% paraformaldehído, 0,5% Triton X-100, anti-eIF4E (factor de inicio de traducción eucariota 4E), anticuerpos (fósforo S209, 1 mg/ml), anticuerpo anti-Bax (1 mg/ml), anticuerpo anticitocromo C (1 mg/ml), anticuerpo secundario (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488, 1 mg/ml) y 1% BSA con 0.1% Tween20. Conservar estos reactivos a 4oC hasta su uso.
  6. Preparar materiales estériles: botellas de cultivo celular, platos Petri con fondo de diapositivas de vidrio (Figura3A),platos con fondo de vidrio, una cuadrícula de ubicación celular impresa de 500 m (Figura3B,para localizar las células fotoestimuladas), tubos de 1,5 ml y 10 ml, y 1 mL, pipetas y puntas de 100 oL y 10 l.
  7. Preparar el equipo de laboratorio de cultivo celular estándar: una incubadora de cultivo celular establecida en 5% de CO2 y 37 oC, y un gabinete de seguridad biológica.

2. Cultivo celular y transfección

NOTA: La célula de Hela (línea celular derivada de células de cáncer de cuello uterino tomadas el 8 de febrero de 1951 de Henrietta Lacks)26 se utiliza como ejemplo en este protocolo.

  1. Paso de celda
    1. Retire el medio de cultivo de la botella de cultivo celular que contiene suficientes células.
    2. Lavar el frasco con 2 ml de solución salina con fosfato (PBS). Quite el PBS.
    3. Añadir 1 ml de trippsina lentamente y tocar ligeramente la botella. Vuelva a colocar el frasco en la incubadora e incubar las células 3 min a 37oC.
    4. Retire la trippsina. Añadir 2-3 mL de medio de cultivo. Pipetear el medio varias veces para ayudar a las células a separarse. Transfiera el medio con células a un tubo de 10 ml.
    5. Tomar 10 l de la muestra del tubo para el recuento celular.
    6. Semilla de 25.000 células en un plato de Petri (Figura3A)y añadir medio de cultivo de hasta 1 ml.
    7. Vuelva a colocar las células contenidas en la incubadora. Incubar las células 24 h a 37oC antes de la transfección.
  2. Transfección celular
    1. Utilice 0,5 g de plásmido de ADN (ERK2-GFP, Mito-GFP o mt-cpYFP) para la transfección por plato. Añadir 0,5 g de plásmido y 2,5 g de PEI a 50 ml de DMEM en un tubo de 1,5 ml. Incubar medios mixtos 10 min a temperatura ambiente.
    2. Tome el plato con las células de la incubadora. Reemplace el medio de cultivo por 1 ml de DMEM.
    3. Agregue medios mixtos de ADN/PEI en las células gota a gota. Vuelva a colocar las células en la incubadora.
    4. Incubar las células 3 h a 37oC y sustituir los medios mixtos DMEM DNA/PEI por 1 ml de medio de cultivo.
    5. Incubar células transinfectadas 24 h a 37 oC antes de los experimentos de fotoestimulación.

3. Activación de ERK2 por fotoestimulación del láser de femtosegundo

  1. Encienda el láser de femtosegundo y asegúrese de que el obturador esté cerrado.
  2. Encienda el microscopio confocal de escaneo láser y abra el software del microscopio. Ajuste el láser de excitación a 488 nm. Ajuste el nivel de potencia del láser de 488 nm a 0,1 mW. Establezca el tamaño de la imagen como 512 x 512 píxeles. Establezca el tiempo de intervalo de cada píxel como 2,4 s. Establezca el tiempo de intervalo entre dos fotogramas a 6 s para minimizar el fotoblanqueo y el fotodaño a las celdas. Establezca marcos de imagen totales en alrededor de 300 fotogramas para proporcionar una microscopía continua de 30 minutos en un experimento individual.
    NOTA: El intervalo de dos marcos adyacentes, los marcos de imagen total y el tiempo de imagen de la microscopía continua se pueden ajustar de acuerdo con los requisitos experimentales. Si un experimento individual dura más de 2 h, configure el sistema de incubación de CO2 (que se muestra en la Figura4) para el microscopio como está presente en el paso 3.3 para proporcionar el entorno de 5% CO2 y 37 oC para mantener la viabilidad celular. Si un experimento individual está limitado dentro de 2 h, el sistema de incubación de CO2 no es necesario.
  3. Encienda el sistema de incubación CO 2, encienda todo el calentador y ajuste la temperatura de trabajo a 37 oC. Espere hasta que la temperatura suba a 37 oC y la concentración de CO2 hasta un 5%. Coloque la etapa de incubadora en la etapa del microscopio como se muestra en la Figura 4A.
  4. Prepare las células de Hela transfectó con ERK2-GFP como se describe en el paso 2.
    NOTA: En un experimento individual, el esquema Stim-A o Stim-B se aplica para entregar fotoestimulación a las células. Los pasos 3.5 y 3.6 presentan pasos detallados bajo Stim-A y Stim-B respectivamente.
  5. Entrega de estimulación láser de femtosegundo en las células diana utilizando el modo Stim-A
    NOTA: Antes del procedimiento de fotoestimulación, asegúrese de que el diámetro del foco es de alrededor de 2 m. Este proceso se describe en los pasos 3.5.1 y 3.5.2.
    1. Tome el plato que contiene células transllenatorias con ERK2-GFP de la incubadora y coloque el plato en la etapa del microscopio.
    2. Inicie el modo de escaneo rápido a través del software operativo del microscopio. Sintonice el objetivo para obtener imágenes fluorescentes claras de las células. Deje de escanear rápidamente. Cambie al modo de imagen de campo brillante por la cámara CCD (Figura2A). Abra el obturador y ajuste la distancia entre dos lentes del telescopio de relé para garantizar que el diámetro del enfoque láser de femtosegundo sea de 2 m (Figura2B). Cierre el obturador para completar el ajuste.
      NOTA: Se puede etiquetar una flecha de referencia para indicar el enfoque láser (Figura2). Mientras tanto, una flecha de referencia también se puede establecer en el centro de la ventana de imágenes fluorescentes para indicar la posición del foco del láser de femtosegundo.
    3. Ajuste la potencia del láser de femtosegundo a 15-40 mW (810 nm, 65 fs, 80 MHz), o 20-60 mW (1040 nm, 120 fs, 50 MHz) en la muestra. Ajuste la hora de apertura del obturador a 0.05-0.2 s.
    4. Utilice el modo de escaneo rápido para seleccionar una celda de destino bien expresada ERK2-GFP.
    5. Mueva la etapa para localizar el área del citosol de la celda de destino seleccionada en el centro del FOV bajo imágenes de campo brillante de la cámara CCD (Figura2A).
    6. Haga clic en la parte inferior Inicio para iniciar el progreso continuo de la imagen por microscopía.
    7. Abra el obturador en cualquier intervalo de tiempo predefinido para entregar la estimulación láser de femtosegundo diseñada en el paso 3.5.3 en la celda de destino.
      NOTA: (1) La fotoestimulación se puede realizar en cualquier momento en la secuencia de microscopía confocal controlada por el obturador. (2) La fotoestimulación se puede entregar varias veces en la misma posición durante la secuencia de microscopía confocal.
    8. Espere hasta que se complete el proceso de creación de imágenes. Guarde los datos de imagen para un análisis de datos más afondo.
  6. Entrega de estimulación láser de femtosegundo en las células diana utilizando el modo Stim-B
    1. Ajuste la potencia del láser de femtosegundo en 15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1040 nm) en la muestra.
    2. Tome el plato que contiene células transllenatorias con ERK2-GFP de la incubadora y colóquelo en la etapa del microscopio.
    3. Utilice el modo de escaneo rápido para seleccionar una celda de destino bien expresada ERK2-GFP.
    4. Establezca el proceso de imagen confocal como paso 3.2. Defina un marco de escaneo especial como marco de estimulación en el proceso de toma de imágenes. Defina el parámetro del marco de simulación.
      1. Establezca una región de escaneo (2 x 2-3 x 3 ám2) en el área del citosol cerca del núcleo en la celda de destino.
      2. Ajuste el tiempo total de escaneo en 0.1-0.2 s. Sincronice el obturador del láser de femtosegundo con el escaneo confocal de acuerdo con el área de fotoestimulación predefinida, que sólo está abierta cuando el escaneo láser cae en el marco de estimulación y cierre inmediatamente cuando se sale.
        NOTA: (1) La región de photostimulaion se puede ajustar a cualquier tamaño. (2) La fotoestimulación se puede realizar en cualquier intervalo de tiempo predefinido en la secuencia de microscopía confocal. (3) La fotoestimulación se puede realizar varias veces en las mismas o diferentes áreas predefinidas en el FOV en esa secuencia de microscopía confocal.
    5. Haga clic en la parte inferior Inicio para iniciar el progreso continuo de la imagen por microscopía.
    6. Espere hasta que se complete el proceso de creación de imágenes. Guarde los datos de imagen para un análisis de datos más afondo.
  7. Apague el láser de femtosegundo y el microscopio confocal después del experimento.

4. Activación de eIF4E (Sustrato de ERK) por Simulación Láser Femtosecond

  1. Preparación de células de Hela
    1. Siga los pasos 2.1.1-2.1.5.
    2. Semilla de 20.000 células en una placa Petri con cuadrículas de ubicación celular (Figura3B)para localizar las células fotoestimuladas. Añadir medio de cultivo de hasta 1 ml.
    3. Ponga el plato con las células de nuevo en la incubadora. Incubar las células 24 h a 37oC antes del tratamiento con láser de femtosegundo.
  2. Encienda el láser de femtosegundo y asegúrese de que el obturador esté cerrado.
  3. Encienda el microscopio confocal de escaneo láser y abra el software del microscopio.
  4. Prepare el sistema de incubación de CO2 como declaración en el paso 3.3.
  5. Entrega de estimulación láser de femtosegundo en las células diana utilizando el modo Stim-A
    1. Ajuste la potencia del láser de femtosegundo en 15-40 mW (810 nm), 20-60 mW (1.040 nm) en la muestra. Ajuste la hora de apertura del obturador a 0.05-0.2 s.
    2. Tome el plato con las células de la incubadora y montarlo en la incubadora de CO2 en el escenario del microscopio.
    3. Mueva el objetivo en dirección vertical para localizar el plano de imagen bajo imágenes de campo brillante de la cámara CCD. Mueva la etapa de la muestra en dirección horizontal para asegurarse de que ninguna célula se ubique en el centro del FOV. Abra el obturador y ajuste la distancia entre dos lentes del telescopio de relé para asegurar el diámetro del enfoque láser de femtosegundo a 2 m. Cierre el obturador para completar el ajuste.
    4. Mueva la etapa del microscopio para seleccionar aleatoriamente cuadrículas de 5 a 10. Puede ser indicado y localizado por las rejillas en la parte inferior de los platos Petri bajo imágenes de campo brillante de la cámara CCD. Marque/registre las coordenadas de las rejillas seleccionadas en el plato.
    5. Estimule todas las celdas ubicadas en las cuadrículas seleccionadas una por una manualmente bajo imágenes de campo brillante de la cámara CCD.
  6. Vuelva a poner el plato en la incubadora. Incubar las células 24 h a 37oC antes de la microscopía de inmunofluorescencia. Apague el láser de femtosegundo y el microscopio confocal después del procedimiento de fototimualción.
  7. Microscopía de inmunofluorescencia de eIF4E fosforilado en células con fotoestimulación para la confirmación de la activación de ERK
    1. Saque el plato que contiene células con tratamiento de fotoestimulación en el paso 4.5 de la incubadora. Retire el medio de referencia cultural. Lave las células con PBS una vez. Retire PBS.
    2. Añadir 1 mL de 5% de paraformaldehído (4oC) en el plato. Fijar las celdas con 5% de paraformaldehído durante 10 min. Retire el búfer de paraformaldehído. Lave las células con PBS durante 5 min dos veces. Retire PBS.
    3. Añadir 1 mL de 0.5% Triton X-100 en el plato. Incubar las células 15 min a temperatura ambiente. Retire el búfer Triton X-100. Lave las células con PBS durante 5 min dos veces. Retire PBS.
    4. Agregue 1 ml de 1% de tampón BSA en el plato. Incubar las células 30 min a temperatura ambiente. Quite el búfer BSA.
    5. Diluir el anticuerpo anti-eIF4E (fósforo S209) en 1 ml de PBS con 1% de BSA a una concentración final de 1 g/ml. Agregue el tampón en el plato. Incubar las células durante 10-12 h a 4oC. Quite el búfer.
    6. Lave las células con PBS durante 5 min dos veces. Retire PBS.
    7. Diluir el anticuerpo secundario anti-Rabbit IgG H&L en 1 ml de PBS con 1% de BSA a una concentración final de 2 g/ml. Agregue el tampón en el plato. Incubar las células 2 h a temperatura ambiente. Quite el búfer.
    8. Lave las células con PBS. Retire PBS.
    9. Agregue 1 ml de PBS en el plato.
    10. Encienda el microscopio confocal de escaneo láser. Abra el software del microscopio. Ajuste el láser de excitación a 488 nm. Ajuste el nivel de potencia del láser de 488 nm a 0,1 mW. Establezca el tamaño de la imagen como 512 x 512 píxeles. Establezca el tiempo de intervalo de cada píxel como 2,4 s.
    11. Coloque el plato con células de tinción inmunofluorescentes en la etapa del microscopio. Localice las casillas seleccionadas bajo imágenes de campo brillante de la cámara CCD.
    12. Inicie el escaneo confocal de un solo fotograma. Guarde las imágenes fluorescentes de las células de fotoestimulación.
    13. Mueva la etapa aleatoriamente para localizar áreas sin estimulación láser de femtosegundo. Inicie el escaneo confocal de un solo fotograma. Guarde las imágenes fluorescentes de ninguna célula de estimulación como datos de control.
  8. Apague el microscopio confocal después del experimento.

5. Activación de Mitoflashes y Otros Eventos Mitocondriales por Fotoestimulación

NOTA: Para observar la dinámica morfológica mitocondrial, las células de Hela se transinfectan con Mito-GFP en el paso 5.1 para indicar fluorescentemente las mitocondrias. Para observar los mitoflashes, las células de Hela están infectadas con mt-cpYFP en el paso 5.1.

  1. Prepare las células de Hela transcturidas con Mito-GFP o mt-cpYFP siguiendo el paso 2.
  2. Encienda el láser de femtosegundo y asegúrese de que el obturador esté cerrado.
  3. Encienda el microscopio confocal de escaneo láser. Ajuste el láser de excitación a 488 nm. Ajuste el nivel de potencia del láser de 488 nm a 0,1 mW. Establezca el tamaño de la imagen como 512 x 512 píxeles. Establezca el tiempo total de imagen de cada fotograma como 2,2 s. Establezca el tiempo de intervalo entre dos fotogramas en 0 s. Establezca el total de fotogramas de imagen como 200 fotogramas para proporcionar una microscopía continua de 440 s en un experimento individual.
    NOTA: El intervalo de dos marcos adyacentes, los marcos de imagen total y el tiempo de imagen de la microscopía continua se pueden ajustar de acuerdo con los requisitos experimentales.
  4. Prepare el sistema de incubación de CO2 como se describe en el paso 3.3 si es necesario.
  5. Entrega de estimulación láser de femtosegundo en el mitocondrion objetivo utilizando el modo Stim-A
    1. Tome el plato que contiene células transllenatorias con Mito-GFP o mt-cpYFP de la incubadora y coloque el plato en la etapa del microscopio.
    2. Compruebe el estado del láser de femtosegundo como paso 3.5.2. Asegúrese de que el enfoque del láser de femtosegundo se encuentra en el centro de FOV. Establezca una flecha de referencia en el centro de la ventana de imágenes fluorescentes para indicar la posición del foco.
    3. Ajuste la potencia del láser de femtosegundo en 5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) en la muestra. Ajuste la hora de apertura del obturador a 0.05-0.1 s.
    4. Utilice el modo de escaneo rápido para seleccionar una celda de destino bien expresada Mito-GFP o mt-cpYFP.
    5. Seleccione una mitocondrion aleatoriamente en la célula objetivo como sujeto experimental. Mueva la etapa del microscopio para localizar la estructura tubular mitocondrial objetivo en el centro del FOV (indicar por la flecha de referencia) mediante el modo de escaneo rápido.
    6. Haga clic en la parte inferior Inicio para iniciar el progreso continuo de la imagen por microscopía.
    7. Abra el obturador en cualquier momento predefinido para entregar la estimulación láser de femtosegundo diseñada en el paso 5.5.3 en la estructura tubular mitocondrial objetivo.
      NOTA: (1) La exposición láser de femtosegundo en la estructura tubular mitocondrial puede ser controlada por el obturador en cualquier momento durante la microscopía confocal. (2) Realizar sólo una exposición femtosegundo-láser en un experimento porque una estimulación láser femtosegundo puede perturbar el estado mitocondrial durante un largo período.
    8. Espere hasta que se complete el proceso de creación de imágenes. Guarde los datos de imagen para un análisis de datos más afondo.
  6. Apague el láser de femtosegundo y el microscopio confocal después del experimento.

6. Oscilación del potencial de la membrana mitocondrial en las mitocondrias objetivo en células Hela por estimulación láser Femtosegundo

  1. Prepare las células de Hela siguiendo los pasos 2.1.1-2.1.6.
  2. Incubar las células durante 24 h a 37 oC antes del experimento.
  3. Preparar la solución de tinción TMRM: diluir el TMRM en 1 ml de DMEM con un 10% de FBS a una concentración final de 100 nM.
  4. Saque el plato con las células preparadas en los pasos 5.2.1 y 5.2.2 de la incubadora. Retire el medio de referencia cultural. Agregue la solución de tinción TMRM preparada en el paso 6.3 en el plato. Mancha durante 15-20 min a 37oC en la incubadora. Retire la solución de tinción. Lave las células con PBS una vez. Añadir 1 ml de medio de cultivo en el plato.
  5. Encienda el láser de femtosegundo y asegúrese de que el obturador esté cerrado.
  6. Encienda el microscopio confocal de escaneo láser. Abra el software del microscopio. Ajuste el láser de excitación a 532 nm. Ajuste el nivel de potencia del láser de 532 nm a 0,1 mW. Establezca el tamaño de la imagen como 512 x 512 píxeles y el tiempo de generación de fotogramas en 2,2 s. Establezca el tiempo de intervalo entre dos fotogramas a 0 s. Establezca los fotogramas de imagen totales como 200 fotogramas para proporcionar una microscopía continua de 440 s en un experimento individual.
    NOTA: El intervalo de dos marcos adyacentes, los marcos de imagen total y el tiempo de imagen de la microscopía continua se pueden ajustar de acuerdo con los requisitos experimentales.
  7. Prepare el sistema de incubación de CO2 descrito en el paso 3.3 si es necesario.
  8. Utilice el modo Stim-A para entregar estimulación láser de femtosegundo en el mitocondrion objetivo. Siga los pasos 5.5.1-5.5.8 para completar el experimento.
    NOTA: En el paso 6.8, seleccione una mitocondrion que esté bien manchada con TMRM como mitocondrion objetivo.
  9. Apague el láser de femtosegundo y el microscopio confocal después del experimento.

7. Cambios de Bax y el citocromo C en las mitocondrias objetivo en células Hela por estimulación láser femtosegundo

NOTA: En este experimento, sembrar las células en platos Petri con cuadrículas de ubicación celular (Figura 3B) para localizar la célula que es tratada por láser de femtosegundo. Mancha las células con TMRM para localizar el mitocondrion que se selecciona para ser estimulado por láser de femtosegundo.

  1. Prepare las células de Hela en una placa Petri con cuadrículas de ubicación celular (Figura3B)como se describe en el paso 4.1.
  2. Mancha las células con TMRM como se describe en los pasos 6.3 y 6.4.
  3. Encienda el láser de femtosegundo y asegúrese de que el obturador esté cerrado.
  4. Encienda el microscopio confocal de escaneo láser. Abra el software del microscopio. Ajuste el láser de excitación a 532 nm. Ajuste el nivel de potencia del láser de 532 nm a 0,1 mW. Establezca el tamaño de la imagen como 512 x 512 píxeles y el tiempo de generación de fotogramas en 2,2 s. Establezca el tiempo de intervalo entre dos fotogramas en 0 s. Establezca los fotogramas de imagen totales como 50 fotogramas para proporcionar una microscopía continua de 110 s en un experimento individual.
  5. Entrega de estimulación láser de femtosegundo en el mitocondrion objetivo utilizando el modo Stim-A
    1. Ajuste la potencia del láser de femtosegundo en 5-30 mW (810 nm), 10-40 mW (1040 nm) en la muestra. Ajuste la hora de apertura del obturador a 0.05-0.1 s.
    2. Tome el plato que contiene las células teñidas de la incubadora y coloque el plato en la etapa del microscopio.
    3. Utilice el modo de escaneo rápido para seleccionar la celda de destino que está bien manchada con TMRM.
    4. Mueva la etapa para localizar la estructura tubular mitocondrial objetivo en el centro del FOV mediante el modo de escaneo rápido. Marque la coordenada de la cuadrícula en la que se encuentra la celda seleccionada bajo imágenes de campo brillante.
    5. Haga clic en la parte inferior Inicio para iniciar el progreso continuo de la imagen por microscopía.
    6. Abra el obturador en cualquier momento predefinido de progreso de imágenes por microscopía manualmente para entregar la estimulación láser de femtosegundo diseñada en el paso 7.5.1 en la estructura tubular mitocondrial objetivo.
    7. Espere hasta que se complete el proceso de creación de imágenes. Marque el mitocondrion seleccionado que es simulado por láser de femtosegundo. Guarde los datos de imagen para un análisis de datos más afondo.
    8. Apague el láser de femtosegundo y el microscopio confocal después del experimento. Preparar la microscopía de inmunofluorescencia de Bax o citocromo C en las células del experimento.
  6. Microscopía de inmunofluorescencia de Bax o citocromo C en el láser de femtosegundo mitocondrion tratado.
    1. Tome el plato de la etapa del microscopio.
    2. La tinción inmunofluorescente completa de Bax o del citocromo C sigue los pasos 4.7.1-4.7.9.
      NOTA: Utilice anti-Bax o anticitocromo C en lugar de anti-eIF4E en el paso 4.7.5 para terminar la tinción inmunofluorescente de Bax o citocromo C en el paso 7.6.2.
    3. Encienda el microscopio confocal de escaneo láser y abra el software del microscopio. Ajuste el láser de excitación a 488 nm y 532 nm. Ajuste el nivel de potencia del láser de 488 nm y 532 nm a 0,1 mW. Establezca el tamaño de la imagen como 512 x 512 píxeles y el tiempo de generación de fotogramas a 2,2 s.
    4. Coloque el plato con células de tinción inmunofluorescentes en la etapa del microscopio. Localice la cuadrícula seleccionada bajo imágenes de campo brillante de la cámara CCD. Localice la célula tratada por láser de femtosegundo.
    5. Inicie el escaneo confocal de un solo fotograma. Localice el mitocondrion que es estimulado por el láser de femtosegundo. Guarde la imagen fluorescente de la célula de fotoestimulación para un análisis de datos más diferidos.
  7. Apague el microscopio confocal después del experimento.

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Resultados

La fotoestimulación se puede realizar simultáneamente junto con la microscopía de escaneo confocal continuo. La fotoestimulación puede comenzar en cualquier intervalo de tiempo predefinido en la secuencia de microscopía confocal de lapso de tiempo. La microscopía confocal puede monitorear moléculas celulares por imágenes fluorescentes. Las respuestas moleculares a la fotoestimulación y otras dinámicas se pueden identificar de esta manera. Teóricamente, si ERK está activado, se...

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Discusión

Demostramos una estrategia de fotoestimulación combinando un láser de femtosegundo con un sistema de microscopio confocal de escaneo láser. La fotoestimulación puede funcionar directamente como una microscopía de dos fotones definiendo Stim-B en consecuencia. Proporcionamos un protocolo detallado para utilizar un breve flash de láser de femtosegundo para activar la señalización ERK o mitoflashes en las células objetivo. Los diferentes modos de estimulación se pueden realizar de acuerdo con diferentes propósito...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

El trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81571719 y 81661168014, 81673014 y 81870055), el Comité Municipal de Ciencia y Tecnología de Shanghái (18QA1402300 y 16XD1403100), y el Plan Nacional de I+D clave (2017YFA0100).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Inverted microscopeOlympus
Femtosecond laserFianium
CO2 incubation systemOlympusMIU-IBC
Petri dishNEST801002
Petri dish with imprinted gridIbidi81148
ERK-GFPaddgene37145A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFPA gift from Heping Cheng's lab
mito-GFPInvitrogenC10508
Tetramethylrhodamine (TMRM)InvitrogenT668Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI)Sigma-Aldrich9002-98-6Dilute in PBS
ParaformaldehydeSolarbioP8430Dilute in PBS
Triton X-100SolarbioT8200Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8Dilute in PBS
Tween20Sigma-Aldrich9005-64-5
anti-eIF4E antibodyabcamab76256
anti-Bax antibodyabcamab53154
anti-cytochrome C antibodyabcamab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488)abcamab150077

Referencias

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