JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Плотно ориентированный фемтосекундный лазер может обеспечить точную стимуляцию клеток, будучи в сочетании с конфокальной микроскопией, позволяющей в режиме реального времени наблюдения и фотостимуляции. Фотостимуляция может активировать молекулярные события клеток, включая сигнальный путь ERK и митохондриальные вспышки реактивных видов кислорода.

Аннотация

Прямой контроль клеточных молекулярных событий важен для науки о жизни. Недавно исследования показали, что фемтосекундная лазерная стимуляция может одновременно активировать несколько клеточных молекулярных сигнальных путей. В этом протоколе мы показываем, что через соединение фемтосекундного лазера в конфокальный микроскоп, клетки могут быть стимулированы именно плотно сфокусированным лазером. Некоторые молекулярные процессы, которые могут одновременно наблюдаться, впоследствии активируются. Мы представляем подробные протоколы фотостимуляции для активации внеклеточного сигнала, регулируемого киназы (ERK) сигнального пути в клетках Hela. Митохондриальные вспышки реактивных видов кислорода (ROS) и другие митохондриальные явления также могут быть стимулированы при фокусировании фемтосекундного лазерного импульса на определенной митохондриальной трубчатой структуре. Этот протокол включает в себя предварительное лечение клеток перед фотостимуляцией, доставку фотостимуляции фемтосекундной лазерной вспышкой на цель и наблюдение/идентификацию молекулярных изменений впоследствии. Этот протокол представляет собой все-оптический инструмент для соответствующих биологических исследований.

Введение

Технология управления клеточными сигнальными молекулами является важной частью развития науки о жизни. Традиционно наиболее часто используемым методом является биохимическая обработка препаратами или биологическими материалами1,2,3. За последнее десятилетие изобретение оптогенетики открывает новую эру для модуляции клеточных молекулярных сигналов. Трансфекция с светочувствительными белками с помощью генной инженерии делает свет мощным инструментом для модулирования различных белков ы в клетках-мишенях. Эта технология сделала обнадеживающие прогрессии, такие как возбуждение и ингибирование нервного сигнала, содействие экспрессии генов, манипулирование клеточными сигнальными моделями, ведущие различные судьбы клеток и патологическое исследование4,5 ,6,7,8,9. Однако свет может работать только трансфектирующие клетки с оптогенетическими белками. На современном этапе существуют редкие методы, которые позволяют свету контролировать клеточные молекулы непосредственно помимо оптогенетики.

Фемтосекундный лазер имеет передовые биологические исследования, обеспечивая эффективное многофотонее возбуждение при сохранении хорошей биологической безопасности. Развертывая различные стратегии обработки фотографий, он реализовал множество достижений, таких как мультифотонная микроскопия, микрохирургии и мультифотонные оптогенетические приложения10,11,12,13 ,14,15,16. Недавние исследования показывают, что фемтосекундная лазерная стимуляция была продемонстрирована как высокоэффективный оптический метод, чтобы непосредственно вызвать молекулярные сигнальные события. Было установлено, что плотно ориентированных фемтосекундного лазерного облучения на эндоплазмический ретикулум (ER) способен истощать кальций в ER и активировать кальций-релиз активированного кальция (CRAC) каналы для формирования сигналов кальция в клетках17. Этот фото-активированный сигнал кальция может распространяться между несколькими типами клеток18,19,20. Кроме того, он также имеет возможность активировать клеточные сигнальные пути, такие как ядерный фактор активированных Т-клеток (NFAT) и ERK сигнальный путь21,22. Регулируя интенсивность и локализацию фемтосекундного воздействия лазера в клетках, например, фокусируя лазер на митохондриях, он может влиять на митохондриальную морфологию и молекулярные события23,24, 25. В частности, всплески поколения митохондриальных ROS могут быть возбуждены фотостимуляции, которая отмечается как флуоресцентные вспышки в митохондриях (митофлэшс).

Таким образом, технология фотостимуляции имеет хороший потенциал для широкого применения в соответствующих биологических исследованиях. Это также хороший шанс расширить фемтосекундные лазерные приложения в управлении клеточных сигнальных молекул и функций, кроме микроскопии. Здесь мы предоставляем технические детали фотостимуляции. Фотостимуляция достигается путем соединения фемтосекундного лазера с конфоковым микроскопом, чтобы обеспечить одну целевую ячейку с короткой флэш-фотостимуляцией. Он может инициировать эффективную и управляемую активацию ERK в ячейке. Если фотостимуляция расположена на митохондриальной трубчатой структуре, то митохондриальный мембранный потенциал, морфология, ROS и поры перехода проницаемости могут контролироваться фотостимуляцией. Основываясь на этой схеме фотостимуляции, мы предоставляем подробный метод активации ERK сигнального пути и влияния на несколько митохондриальных событий в клетках Hela. Этот протокол разъясняет процесс доставки фемтосекундной лазерной стимуляции в клетки-мишени.

Система фотостимуляции установлена на конфокальном микроскопе с фемтосекундным лазерным соединением в него для одновременной стимуляции и непрерывной микроскопии. Фемтосекундный лазер (длина волны: 1040 нм, частота повторения: 50 МГц, ширина пульса: 120 fs, максимальная мощность выхода: 1 Вт) делится на два луча перед соединением. Один из них проходит через реле телескоп, состоящий из пары линз. Затем он непосредственно отражается в задней апертуре цели (60x, N.A. 1.2, погружение в воду) для формирования фокуса с ограничением дифракции (Stim-A). Другой отражается на сканирующем оптическом пути конфокального микроскопа для работы в режиме двухфотонных сканирований (Stim-B). Stim-A представляет собой фиксированную точку фокусировки в центре поля зрения (FOV). Stim-B — это заранее разработанная область частичного конфокального сканирования в FOV. Stim-A и Stim-B показаны на рисунке 1A. Камера CCD под дихроарным зеркалом (DM) обеспечивает ярко-полевую визуализацию для мониторинга фокуса фемтосекундного лазера.

Есть некоторые важные предметы первой необходимости для следующих экспериментов. В этом протоколе используется фемтосекундный источник лазерного волокна (1040 нм, 50 МГц, 120 fs). На практике, большинство коммерческих фемтосекундных осцилляторов могут быть использованы до тех пор, как ширина импульса короче, чем 200 fs и пиковая плотность мощности должна быть выше уровня 1011 и 1012 Вт / см2. Например, Ti: Сапфировый лазер обычно используется для мультифотон микроскопии способен заменить фемтосекундный лазер, показанный на рисунке 1B. Лазерная мощность и некоторые другие параметры фотостимуляции должны быть настроены, потому что оптические параметры (ширина импульса, длина волны и скорость повторения) сильно различаются в различных фемтосекундных лазеров, которые, таким образом, вызывают различные мультифотоновые эффективность возбуждения.

Наряду с фемтосекундной лазерной стимуляцией, конфокальная микроскопия обеспечивает непрерывную клеточную визуализацию для мониторинга молекулярной динамики в режиме реального времени как в режимах Stim-A, так и Stim-B. Обе схемы фотостимуляции (Stim-A и Stim-B) управляются механическим затвором с миллисекундным разрешением(рисунок1).

В режиме Stim-A положение лазерного фокуса фиксируется в центре FOV. Реле телескоп используется для обеспечения фокус фемтосекундного лазера, который будет расположен на плоскости конфокальной визуализации путем настройки расстояния между двумя линзами в вертикальном направлении (направление лазерной распространения, вертикальнокая к конфокальная плоскость изображения, как показано в Рисунок 1). С помощью ярко-поляной визуализации камеры CCD можно измерить диаметр лазерного фокуса (2 мкм, рисунок 2B). Длительность стимуляции и время экспозиции контролируются затвором во время процесса конфокальной визуализации.

В режиме Stim-B область стимуляции может быть предварительно назначена вручную в программном обеспечении для управления изображениями в любой форме, как линия, полигон или круг. Затвор синхронизируется с процессом конфокального сканирования. Он открывается в заранее разработанное время, которое устанавливается через конфокальные изображения управления программным обеспечением. Затем область стимуляции сканируется фемтосекундным лазером в виде конфокальной микроскопии. Таким образом, образец стимулируется только фемтосекундным лазером, когда процесс конфокального сканирования входит в заданную раму изображения.

Система фотостимуляции может быть установлена как на перевернутых, так и на вертикальном металлургическом микроскопе в соответствии с объектами эксперимента. Клетки in vitro, культивированные в чашках Петри, лучше работать с перевернутыми микроскопами. С вертикальноговорями микроскопами больше подходят животные, особенно мозги живых животных. В этом исследовании мы берем в качестве примера перевернутый микроскоп. Следует отметить, что обложка блюда Петри не открывается в течение всего эксперимента.

протокол

ПРЕДЕКТО: Протокол, представленный ниже, включает в себя использование NIR фемтосекундных лазеров и токсичных химических веществ. Пожалуйста, обратите внимание на все возможные повреждения, вызванные экспериментальными процедурами. Пожалуйста, ознакомьтесь с листами данных о безопасности всех соответствующих химических веществ или других материалов перед использованием. Пожалуйста, следуйте инструкциям по безопасности лазерных установок или проконсультируйтесь с профессионалами для руководства, прежде чем работать лазерный источник.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Настройка системы фотостимуляции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Система состоит из фемтосекундного лазера и лазера (при видимом диапазоне для флуоресценции возбуждения) сканирования конфокального микроскопа. На рисунке 1для соединения используется волокно фемтосекундный лазер (1040 Нм, 50 МГц, 120 fs, 1 Вт). Параметры не являются фиксированными или необходимыми. Его можно заменить ti: Сапфировым лазером или другими коммерческими фемтосекундными осцилляторами в диапазоне NIR.
    1. Настройтесь на фемтосекундный лазер и конфокальный микроскоп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, установите фемтосекундную лазерную мощность на низком уровне (50 мВт) в процессе регулировки оптического пути.
    2. Используйте светоотражающие зеркала (RM1 и RM2, показанные на рисунке 1B)для прямого фемтосекундного лазерного луча через механический затвор. Откройте затвор.
    3. Установите 50/50 пучка сплиттер (BS, Рисунок 1B), чтобы разделить фемтосекундный лазерный луч на два отдельных луча (передача пучка и отражения пучка). Управляйте RM2 и BS, чтобы фемтосекундный лазерный луч совпал с сканирующим лазерным лучом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Ссылка радужной оболочки (Iris 1, Рисунок 1B) за длинным проходом дихроического зеркала (DM, 700 нм вырезать на длину волны, Рисунок 1B) используется для позиционирования сканирования лазерного пути. (2) Система может работать только в режиме Stim-A или Stim-B, соответственно. Для режима Stim-A BS может быть удален. Для Stim-B BS может быть заменен RM.
    4. Установите реле телескоп, состоящий из пары линз, чтобы расширить ширину луча передачи, которая состоит из задней диафрагмы цели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Ссылка радужной оболочки 2 и 3 (Рисунок 1B) установлены для коллимата фемтосекундный лазерный луч (рисунок1B). (2) Увеличение реле телескопа зависит от первоначального диаметра фемтосекундного лазерного луча и диаметра задней диафрагмы цели.
    5. Управляйте RMs (RM 3-5, Рисунок 1B) для выравнивания расширенного луча в микроскоп. Управляйте RM 4 и RM 5, чтобы настроить фокус фемтосекундного лазера к центру FOV.
    6. Измерьте эффективность передачи цели фемтосекундного лазера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, измерьте мощность лазера на Stim-A и Stim-B соответственно из-за различных путей проникновения лазера в этих двух режимах. Он будет использовать власть на образец, чтобы проиллюстрировать соответствующие процедуры эксперимента ниже.
    7. Настройтесь на затвор, фемтосекундный лазер и конфокальный микроскоп до начала экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих экспериментах Stim-A и Stim-B не работают вместе. При использовании Stim-A фемтосекундный лазерный луч Стим-В должен быть заблокирован. С другой стороны, пучок Stim-A должен быть заблокирован, если система работает в режиме Stim-B.
  2. Подготовка среды культуры: Dulbecco в модифицированных Eagle в среде (DMEM) высокой глюкозы с 10% плода бычьей сыворотки (FBS).
  3. Подготовьте плазмид ДНК ERK2-GFP, плазмид ДНК Mito-GFP и митохондриальную матрицу-таргетинг круговой пермутированный желтый флуоресцентный белок (mt-cpYFP) ДНК плазмида. Держите плазмиды при -20 градусов до использования.
  4. Приготовить тетраметилродамин (TMRM, 100 мкм) и полиэтиленина (PEI 1 мг/мл). Держите их при -20 градусах Цельсия до использования.
  5. Подготовка 5% параформальдегида, 0,5% Triton X-100, анти-eIF4E (эукариотический фактор инициации перевода 4E), антитела (фосфор S209, 1 мг/мл), анти-Бакс антитела (1 мг/мл), антицитохром C антитела (1 мг/мл), антитела (анти-IgG Кролик Alexa Fluor 488, 1 мг/мл) и 1% BSA с 0,1% Tween20. Держите эти реагенты при 4 градусах Цельсия до использования.
  6. Подготовка стерильных материалов: бутылки клеточной культуры, петри блюда со стеклянным дном слайда(рисунок 3A), блюда со стеклянным дном, отпечатанная сетка расположения 500 мкм (рисунок3B, для локализации фотостимулированных клеток), 1,5 мл и 10 мл труб, и 1 мл, 100 л и 10 л пипетки и советы.
  7. Подготовка стандартного лабораторного оборудования клеточной культуры: инкубатор культуры клеток, установленный при 5% CO2 и 37 градусов по Цельсию, и шкаф биологической безопасности.

2. Культура клеток и трансфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетка Hela (клеточная линия, полученная из раковых клеток шейки матки, взятых 8 февраля 1951 года у Генриетты Лакс)26 используется в качестве примера в этом протоколе.

  1. Проход клетки
    1. Удалите среду культуры из бутылки клеточной культуры, содержащей достаточное количество клеток.
    2. Вымойте бутылку с 2 мл фосфат-буферного солья (PBS). Удалите PBS.
    3. Добавить 1 мл трипсина медленно и нажмите бутылку немного. Положите бутылку обратно в инкубатор и инкубировать клетки 3 мин при 37 градусах Цельсия.
    4. Удалите трипсин. Добавьте 2-3 мл культуры среды. Пипетка среды несколько раз, чтобы помочь клеткам отделиться. Перенесите среду с клетками в трубку 10 мл.
    5. Возьмите 10 зл и образца из трубки для подсчета клеток.
    6. Семя 25 000 клеток в чашку Петри(рисунок 3A)и добавьте среду культуры до 1 мл.
    7. Положите блюдо, содержащее клетки обратно в инкубатор. Инкубировать клетки 24 ч при 37 градусах Цельсия перед трансфекцией.
  2. Перетекция клеток
    1. Используйте 0,5 мкг плазмида ДНК (ERK2-GFP, Mito-GFP или mt-cpYFP) для трансфекции на блюдо. Добавьте 0,5 мкг плазмиды и 2,5 мкг ПЭИ в 50 л DMEM в трубке 1,5 мл. Инкубировать смешанные носители 10 мин при комнатной температуре.
    2. Возьмите блюдо с клетками из инкубатора. Замените культурную среду 1 мл DMEM.
    3. Добавить ДНК / PEI смешанных носителей в клетки капля за каплей. Поместите клетки обратно в инкубатор.
    4. Инкубировать клетки 3 ч при 37 градусах Цельсия и заменить DMEM ДНК / PEI смешанных носителей с 1 мл культуры среды.
    5. Инкубировать трансинфицированные клетки 24 ч при 37 градусах Цельсия перед фотостимуляционными экспериментами.

3. Активация ERK2 с помощью фотостимуляции фемтосекундного лазера

  1. Включите фемтосекундный лазер и убедитесь, что затвор закрыт.
  2. Включите лазерный конфокальный микроскоп и откройте программное обеспечение для микроскопа. Установите возбуждая лазер на 488 nm. Установите уровень мощности 488 нм лазера на 0,1 мВт. Установите размер изображения как 512 x 512 пикселей. Установите интерваловое время каждого пикселя в 2,4 х. Установите интервал времени между двумя кадрами на 6 с, чтобы свести к минимуму фотоотбеление и фотоповреждения клеток. Установите общий объем изображений на уровне около 300 кадров, чтобы обеспечить непрерывную микроскопию в 30 минутах в индивидуальном эксперименте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал двух смежных кадров, общий объем изображений и время визуализации непрерывной микроскопии могут быть скорректированы в соответствии с экспериментальными требованиями. Если индивидуальный эксперимент длится более 2 ч, пожалуйста, установите систему инкубации CO2 (показано на рисунке 4)для микроскопа, присутствующей в шаге 3.3, чтобы обеспечить среду 5% CO2 и 37 градусов по Цельсию для поддержания жизнеспособности клеток. Если индивидуальный эксперимент ограничен в пределах 2 ч, инкубационная система CO2 не является необходимой.
  3. Включите инкубационную систему CO 2, включите весь обогреватель и установите рабочую температуру на уровне 37 градусов по Цельсию. Подождите, пока температура не поднимися до 37 градусов по Цельсию и концентрация CO2 до 5%. Поместите инкубатор этапе на стадии микроскопа, как показано на рисунке 4A.
  4. Подготовка клеток Hela трансфицировать с ERK2-GFP, как описано в шаге 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В индивидуальном эксперименте применяется схема Stim-A или Stim-B для доставки фотостимуляции в клетки. Шаг 3.5 и 3.6 содержат подробные шаги под Stim-A и Stim-B соответственно.
  5. Доставка фемтосекундной лазерной стимуляции в клетки-мишени с помощью режима Stim-A
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед процедурой фотостимуляции, пожалуйста, убедитесь, что диаметр фокуса составляет около 2 мкм. Этот процесс описан в шаге 3.5.1 и 3.5.2.
    1. Возьмите блюдо, содержащее клетки, трансфицируемые ERK2-GFP, из инкубатора и поставьте блюдо на сцену микроскопа.
    2. Начните режим быстрого сканирования с помощью программного обеспечения для работы с микроскопом. Настройте цель для того чтобы приобрести ясные флуоресцентные изображения клеток. Прекратите быстрое сканирование. Переключитесь на режим ярко-поляизображения камерой CCD(рисунок 2A). Откройте затвор и отрегулируйте расстояние между двумя линзами реле-телескопа, чтобы обеспечить диаметр фемтосекундного лазерного фокуса, который будет 2 мкм(рисунок 2B). Закройте затвор для полной регулировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Справочная стрелка может быть помечена, чтобы указать лазерный фокус (Рисунок 2). В то же время, эталонная стрелка может также установить в центре флуоресцентного окна изображения, чтобы указать положение фокуса фемтосекундного лазера.
    3. Установите мощность фемтосекундного лазера на уровне 15-40 мВт (810 Нм, 65 л.с., 80 МГц) или 20-60 МВт (1040 Нм, 120 fs, 50 МГц) на образец. Установите время открытия затвора на 0,05-0,2 с.
    4. Используйте режим быстрого сканирования, чтобы выбрать целевую ячейку, хорошо выраженную ERK2-GFP.
    5. Перемещение этапе для того, чтобы локализовать область цитозола выбранной целевой ячейки в центре FOV под ярко-поле изображения камеры CCD (Рисунок 2A).
    6. Нажмите на стартовое дно, чтобы начать непрерывный прогресс микроскопии изображений.
    7. Откройте затвор в любой заранее определенный временной интервал, чтобы доставить фемтосекундную лазерную стимуляцию, разработанную в шаге 3.5.3 в целевую ячейку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Фотостимуляция может быть выполнена в любое время в последовательности конфокальной микроскопии, контролируемой затвором. (2) Фотостимуляция может быть доставлена в течение нескольких раз в одном и том же положении во время последовательности конфокальной микроскопии.
    8. Подождите, пока процесс визуализации не будет завершен. Сохраните данные изображений для дальнейшего анализа данных.
  6. Доставка фемтосекундной лазерной стимуляции в клетки-мишени с помощью режима Stim-B
    1. Установите мощность фемтосекундного лазера на уровне 15-40 мВт (810 Нм), 20-60 мВт (1040 Нм) на образец.
    2. Возьмите блюдо, содержащее клетки, трансфицируемые ERK2-GFP из инкубатора и поставьте его на сцену микроскопа.
    3. Используйте режим быстрого сканирования, чтобы выбрать целевую ячейку, хорошо выраженную ERK2-GFP.
    4. Установите процесс конфокальной визуализации в качестве шага 3.2. Определите специальную сканирующую рамку в качестве системы стимуляции в процессе визуализации. Определите параметр кадра моделирования.
      1. Установите область сканирования (2 х 2-3 х 3 мкм2) в области цитозола, близкого к ядру в целевой ячейке.
      2. Установите общее время сканирования на уровне 0,1-0,2 с. Синхронизируйте затвор фемтосекундного лазера с конфокальной областью фотостимуляции, которая открыта только тогда, когда лазерное сканирование падает в раме стимуляции и немедленно закрывается, когда она выходит.
        ПРИМЕЧАНИЕ: (1) область фототимуляции может быть установлена в любом размере. (2) Фотостимуляция может быть выполнена в любой заранее определенный временной интервал в последовательности конфокальной микроскопии. (3) Фотостимуляция может быть выполнена в течение нескольких раз на тех же или различных заранее определенных областях в FOV в этой последовательности конфокальной микроскопии.
    5. Нажмите на стартовое дно, чтобы начать непрерывный прогресс микроскопии изображений.
    6. Подождите, пока процесс визуализации не будет завершен. Сохраните данные изображений для дальнейшего анализа данных.
  7. Выключите фемтосекундный лазер и конфокальный микроскоп после эксперимента.

4. Активация eIF4E (субстрат ERK) фемтосекундным лазерным моделированием

  1. Подготовка клеток Хела
    1. Выполните шаги 2.1.1.1.1.5.
    2. Семя 20000 клеток в чашку Петри с сетками расположения клеток(рисунок 3B) для локализации фотостимулированных клеток. Добавьте среду культуры до 1 мл.
    3. Положите блюдо с клетками обратно в инкубатор. Инкубировать клетки 24 ч при 37 градусах Цельсия перед фемтосекундным лазерным лечением.
  2. Включите фемтосекундный лазер и убедитесь, что затвор закрыт.
  3. Включите лазерный конфокальный микроскоп и откройте программное обеспечение для микроскопа.
  4. Подготовьте инкубационную систему CO2 в виде заявления в шаге 3.3.
  5. Доставка фемтосекундной лазерной стимуляции в клетки-мишени с помощью режима Stim-A
    1. Установите мощность фемтосекундного лазера на уровне 15-40 мВт (810 Нм), 20-60 МВт (1040 Нм) на образец. Установите время открытия затвора на 0,05-0,2 с.
    2. Возьмите блюдо с клетками из инкубатора и смонтировать его в инкубатор CO2 на стадии микроскопа.
    3. Перемещение цели в вертикальном направлении, чтобы найти плоскость изображения под ярким полем изображения камеры CCD. Переместите сцену образца в горизонтальное направление, чтобы убедиться, что ни одна ячейка не находится в центре FOV. Откройте затвор и отрегулируйте расстояние между двумя линзами реле-телескопа, чтобы обеспечить диаметр фемтосекундного лазерного фокуса на уровне 2 мкм. Закройте затвор для полной регулировки.
    4. Переместите сцену микроскопа, чтобы случайным образом выбрать сетки 5 х 10. Он может быть указан и локализован сетками в нижней части посуды Петри под ярко-поле изображения камеры CCD. Отметьте/запишите координаты выбранных сеток в блюде.
    5. Стимулировать все ячейки, расположенные в выбранных сетках, один за другим вручную под ярко-полевую визуализацию камеры CCD.
  6. Положите блюдо обратно в инкубатор. Инкубировать клетки 24 ч при 37 градусах Цельсия перед иммунофлуоресценцией микроскопии. Выключите фемтосекундный лазер и конфокальный микроскоп после процедуры фототимификации.
  7. Иммунофлуоресцентная микроскопия фосфорилированного eIF4E в клетках с фотостимуляцией для подтверждения активации ЭРК
    1. Возьмите блюдо, содержащее клетки с фотостимуляцией лечения в шаге 4.5 из инкубатора. Удалите среду культуры. Вымойте клетки с PBS один раз. Удалите PBS.
    2. Добавьте в блюдо 1 мл 5% параформальдегида (4 кв.кв.) Зафиксировать клетки с 5% параформальдегида в течение 10 мин. Удалить параформальдегид буфера. Вымойте клетки с PBS в течение 5 минут в два раза. Удалите PBS.
    3. Добавить 1 мл 0,5% Тритон X-100 в блюдо. Инкубировать клетки 15 мин при комнатной температуре. Удалите буфер Triton X-100. Вымойте клетки с PBS в течение 5 минут в два раза. Удалите PBS.
    4. Добавить 1 мл 1% буфера BSA в блюдо. Инкубировать клетки 30 мин при комнатной температуре. Удалите буфер BSA.
    5. Разбавить анти-eIF4E антитела (фосфор S209) в 1 мл PBS с 1% BSA до конечной концентрации 1 мкг/мл. Добавьте буфер в тарелку. Инкубировать клетки для 10-12 ч при 4 градусах Цельсия. Удалите буфер.
    6. Вымойте клетки с PBS в течение 5 минут в два раза. Удалите PBS.
    7. Разбавить вторичное антитело анти-Rabbit IgG H и L в 1 мл PBS с 1% BSA до конечной концентрации 2 мкг/мл. Добавьте буфер в тарелку. Инкубировать клетки 2 ч при комнатной температуре. Удалите буфер.
    8. Вымойте клетки с помощью PBS. Удалите PBS.
    9. Добавить 1 мл PBS в блюдо.
    10. Включите лазерный сканирующий конфокальный микроскоп. Откройте программное обеспечение для микроскопа. Установите возбуждая лазер на 488 nm. Установите уровень мощности 488 нм лазера на 0,1 мВт. Установите размер изображения как 512 x 512 пикселей. Установите интерваловое время каждого пикселя в 2,4 х.
    11. Положите блюдо с иммунофлуоресцентными окрашивания клеток на стадии микроскопа. Найдите выбранные коробки под ярко-полеизображения камеры CCD.
    12. Начало одного кадра конфокального сканирования. Сохранить флуоресцентные фотографии фотостимуляционных клеток.
    13. Перемещение этапе случайным образом, чтобы найти области без фемтосекундной лазерной стимуляции. Начало одного кадра конфокального сканирования. Сохранить флуоресцентные фотографии не стимуляции клеток, как контроль ные данные.
  8. Выключите конфокальный микроскоп после эксперимента.

5. Активация митофлаков и других митохондриальных событий с помощью фотостимуляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Для наблюдения за митохондриальной морфологической динамикой клетки Хела трансфицируются мито-ГФП в шаге 5.1, чтобы флуоресцентно указать митохондрии. Для наблюдения за митофлэшами клетки Хела трансфицируются mt-cpYFP в шаге 5.1.

  1. Подготовьте клетки Hela, трансфицируемые С помощью Mito-GFP или mt-cpYFP после внеся 2-й шаг.
  2. Включите фемтосекундный лазер и убедитесь, что затвор закрыт.
  3. Включите лазерный конфокальный микроскоп. Установите возбуждая лазер на 488 nm. Установите уровень мощности 488 нм лазера на 0,1 мВт. Установите размер изображения как 512 x 512 пикселей. Установите общее время изображения каждого кадра в 2,2 с. Установите интерваловое время между двумя кадрами на уровне 0 с. Установите общие рамки изображения в 200 кадров, чтобы обеспечить непрерывную микроскопию в индивидуальном эксперименте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал двух смежных кадров, общий объем изображений и время визуализации непрерывной микроскопии могут быть скорректированы в соответствии с экспериментальными требованиями.
  4. При необходимости подготовьте инкубационную систему CO2, описанную в шаге 3.3.
  5. Доставка фемтосекундной лазерной стимуляции в митохондрион цели с помощью режима Stim-A
    1. Возьмите блюдо, содержащее клетки, трансфицируемые Mito-GFP или mt-cpYFP из инкубатора и поставьте блюдо на сцену микроскопа.
    2. Проверьте состояние фемтосекундного лазера как шаг 3.5.2. Убедитесь, что фокус фемтосекундного лазера находится в центре FOV. Установите эталонную стрелку в центре флуоресцентного окна изображения, чтобы указать положение фокуса.
    3. Установите мощность фемтосекундного лазера на уровне 5-30 мВт (810 Нм), 10-40 мВт (1040 Нм) на образец. Установите время открытия затвора на 0,05-0,1 с.
    4. Используйте режим быстрого сканирования, чтобы выбрать целевую ячейку, хорошо выраженную Mito-GFP или mt-cpYFP.
    5. Выберите один митохондрион случайным образом в целевой ячейке в качестве экспериментального субъекта. Переместите стадию микроскопа, чтобы локализовать целевую митохондриальную трубчатую структуру в центре FOV (указано на эталонную стрелку) с помощью режима быстрого сканирования.
    6. Нажмите на стартовое дно, чтобы начать непрерывный прогресс микроскопии изображений.
    7. Откройте затвор в любое заранее определенное время, чтобы доставить фемтосекундную лазерную стимуляцию, разработанную в шаге 5.5.3 в целевую митохондриальную трубчатую структуру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Фемтосекундное воздействие лазера на митохондриальную трубчатую структуру может контролироваться затвором в любое время во время конфокальной микроскопии. (2) Выполните только один фемтосекундно-лазерный воздействия в одном эксперименте, потому что одна фемтосекундная лазерная стимуляция может возпевать митохондриальный статус в течение длительного периода.
    8. Подождите, пока процесс визуализации не будет завершен. Сохраните данные изображений для дальнейшего анализа данных.
  6. Выключите фемтосекундный лазер и конфокальный микроскоп после эксперимента.

6. Колебание митохондриальной Мембранной Потенциал на целевых митохондрий в клетках Хела фемтосекундной лазерной стимуляции

  1. Подготовьте клетки Hela после шагов 2.1.1-2.1.6.
  2. Инкубировать клетки в течение 24 ч при 37 градусах Цельсия перед экспериментом.
  3. Подготовьте окрашивающий раствор TMRM: разбавить TMRM в 1 мл DMEM 10% FBS до конечной концентрации 100 НМ.
  4. Возьмите блюдо с клетками, приготовленными в шаге 5.2.1 и 5.2.2 из инкубатора. Удалите среду культуры. Добавьте в блюдо окрашивающий раствор TMRM, приготовленный в шаге 6.3. Пятно в течение 15-20 мин при 37 градусах По Цельсию в инкубаторе. Удалите окрашивающий раствор. Вымойте клетки с PBS один раз. Добавить 1 мл культуры среды в блюдо.
  5. Включите фемтосекундный лазер и убедитесь, что затвор закрыт.
  6. Включите лазерный конфокальный микроскоп. Откройте программное обеспечение для микроскопа. Установите возбуждая лазер на 532 nm. Установите уровень мощности 532 нм лазера на 0,1 мВт. Установите размер изображения как 512 x 512 пикселей, а время генерации кадров - 2,2 с. Установите интервал времени между двумя кадрами на 0 с. Установите общие рамки изображения в 200 кадров, чтобы обеспечить непрерывную микроскопию в индивидуальном эксперименте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал двух смежных кадров, общий объем изображений и время визуализации непрерывной микроскопии могут быть скорректированы в соответствии с экспериментальными требованиями.
  7. При необходимости подготовьте инкубационную систему CO2, описанную в шаге 3.3.
  8. Используйте режим Stim-A для доставки фемтосекундной лазерной стимуляции в митохондрион цели. Выполните шаги 5.5.1-5.5.8 для завершения эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В шаге 6.8, выберите митохондрион, который хорошо окрашены TMRM в качестве митохондриона цели.
  9. Выключите фемтосекундный лазер и конфокальный микроскоп после эксперимента.

7. Изменения Бакса и Цитохрома C на целевых митохондриях в клетках Хела фемтосекундной лазерной стимуляции

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте, семена клеток в чашках Петри с сетками расположения клеток(Рисунок 3B) для локализации клетки, которая обрабатывается фемтосекундным лазером. Пятно клетки с TMRM для локализации митохондриона, который выбран для стимулирования фемтосекундного лазера.

  1. Подготовка Hela клетки в чашку Петри с сетки расположения клеток(Рисунок 3B), как описано в шаге 4.1.
  2. Пятно клетки с TMRM, как описано в шагах 6.3 и 6.4.
  3. Включите фемтосекундный лазер и убедитесь, что затвор закрыт.
  4. Включите лазерный конфокальный микроскоп. Откройте программное обеспечение для микроскопа. Установите возбуждая лазер на 532 nm. Установите уровень мощности 532 нм лазера на 0,1 мВт. Установите размер изображения как 512 x 512 пикселей, а время генерации кадров - 2,2 с. Установите интервал времени между двумя кадрами на 0 с. Установите общие рамки изображения в виде 50 кадров, чтобы обеспечить непрерывную микроскопию в индивидуальном эксперименте.
  5. Доставка фемтосекундной лазерной стимуляции в митохондрион цели с помощью режима Stim-A
    1. Установите мощность фемтосекундного лазера на уровне 5-30 мВт (810 Нм), 10-40 мВт (1040 Нм) на образец. Установите время открытия затвора на 0,05-0,1 с.
    2. Возьмите блюдо, содержащее клетки, окрашенные из инкубатора и положите блюдо на сцену микроскопа.
    3. Используйте режим быстрого сканирования, чтобы выбрать целевую ячейку, которая хорошо окрашена TMRM.
    4. Переместите сцену, чтобы локализовать целевую митохондриальную трубчатую структуру в центре FOV с помощью режима быстрого сканирования. Отметьте координаты сетки, в которой находится выбранная ячейка при ярко-полевом изображении.
    5. Нажмите на стартовое дно, чтобы начать непрерывный прогресс микроскопии изображений.
    6. Откройте затвор в любое заранее определенное время микроскопии изображения прогресса вручную, чтобы доставить фемтосекундной лазерной стимуляции, разработанной в шаге 7.5.1 в целевой митохондриальной трубчатой структуры.
    7. Подождите, пока процесс визуализации не будет завершен. Отметьте выбранный митохондрион, который моделируется фемтосекундным лазером. Сохраните данные изображений для дальнейшего анализа данных.
    8. Выключите фемтосекундный лазер и конфокальный микроскоп после эксперимента. Подготовка иммунофлуоресценции микроскопии Bax или цитохром C на экспериментальных клетках.
  6. Иммунофлуоресцентная микроскопия Бакса или цитохром C на фемтосекундный лазер лечение митохондриона.
    1. Возьмите блюдо из микроскопа этапе.
    2. Полное иммунофлуоресцентное окрашивание Бакса или цитохрома С следует шагам 4.7.1-4.7.9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте анти-Бакс или анти-цитохром C вместо anti-eIF4E в шаге 4.7.5, чтобы закончить иммунофлуоресцентное окрашивание Бакса или цитохрома C в шаге 7.6.2.
    3. Включите лазерный конфокальный микроскоп и откройте программное обеспечение для микроскопа. Установите возбуждая лазер на 488 nm и 532 nm. Установите уровень мощности 488 нм и 532 нм лазера на 0,1 мВт. Установите размер изображения как 512 x 512 пикселей, а время генерации кадров — 2,2 с.
    4. Положите блюдо с иммунофлуоресцентными окрашивания клеток на стадии микроскопа. Найдите выбранную сетку под ярко-полевую визуализацию камеры CCD. Найдите клетку, которая лечится фемтосекундным лазером.
    5. Начало одного кадра конфокального сканирования. Найдите митохондрион, который стимулируется фемтосекундным лазером. Сохранить флуоресцентное изображение фотостимуляции ячейки для дальнейшего анализа данных.
  7. Выключите конфокальный микроскоп после эксперимента.

Результаты

Фотостимуляция может быть выполнена одновременно вместе с непрерывной конфокальной микроскопией сканирования. Фотостимуляция может начинаться в любой заранее определенный временной интервал в последовательности конфокальной микроскопии. Конфокальная микроскопи...

Обсуждение

Мы демонстрируем стратегию фотостимуляции, сочетая фемтосекундный лазер с системой лазерного сканирования конфокального микроскопа. Фотостимуляция может работать непосредственно как двухфотоническая микроскопия, определяя Stim-B соответствующим образом. Мы предоставляем подробный ?...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.

Благодарности

Работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81571719 и 81661168014, 81673014 и 81870055), Шанхайским муниципальным комитетом по науке и технике (18-A1402300 и 16XD1403100), а также Национальным ключевым планом r'amp;D (20170).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Inverted microscopeOlympus
Femtosecond laserFianium
CO2 incubation systemOlympusMIU-IBC
Petri dishNEST801002
Petri dish with imprinted gridIbidi81148
ERK-GFPaddgene37145A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFPA gift from Heping Cheng's lab
mito-GFPInvitrogenC10508
Tetramethylrhodamine (TMRM)InvitrogenT668Dilute in DMSO
Polyethylenimine (PEI)Sigma-Aldrich9002-98-6Dilute in PBS
ParaformaldehydeSolarbioP8430Dilute in PBS
Triton X-100SolarbioT8200Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8Dilute in PBS
Tween20Sigma-Aldrich9005-64-5
anti-eIF4E antibodyabcamab76256
anti-Bax antibodyabcamab53154
anti-cytochrome C antibodyabcamab90529
Secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488)abcamab150077

Ссылки

  1. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  2. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
  3. Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
  4. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  6. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  7. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  8. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
  9. Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson's disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
  10. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  11. Hoover, E. E., Squier, J. A. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).
  12. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
  13. Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
  14. Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
  15. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  16. Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
  17. He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
  18. Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
  19. Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
  20. He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
  21. Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
  22. Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
  23. Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
  24. Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
  25. Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
  26. Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
  27. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
  28. Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
  29. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134 (2), 279-290 (2008).
  30. Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).
  31. Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
  32. Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

149ERK

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены