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Resumen

El protocolo presenta la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica para inducir células madre neurales por infección por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas dopaminérgicas, trasplante de precursores de DA en el unilateralmente-lesioned Modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson, y evaluación de la seguridad y eficacia de los precursores de DA derivados de iNSC para el tratamiento de la DP.

Resumen

La enfermedad de Parkinson (PD) es causada por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia nigra pars compacta (SNpc) en el mesencéfalo ventral (VM). La terapia de reemplazo celular tiene una gran promesa para el tratamiento de la DP. Recientemente, las células madre neurales inducidas (iNSC) han surgido como un candidato potencial para la terapia de reemplazo celular debido al menor riesgo de formación de tumores y la plasticidad para dar lugar a neuronas y glia específicas de la región. los iNSC se pueden reprogramar a partir de fuentes celulares somáticas autólogas, como fibroblastos, células mononucleares de sangre periférica (PMF) y varios otros tipos de células. En comparación con otros tipos de células somáticas, los PBMNAC son un tipo de celda de inicio atractivo debido a la facilidad de acceso y expansión en cultivo. El virus Sendai (SeV), un virus no integrador de ARN, que codifica factores de reprogramación como OCT3/4humano, SOX2, KLF4 y c-MYC, tiene un genoma no segmentado, de un solo cadena y de sentido negativo que no se integra en gento del huésped, pero sólo se replica en el citoplasma de las células infectadas, ofreciendo un vehículo eficiente y seguro para la reprogramación. En este estudio, describimos un protocolo en el que los iNSC se obtienen reprogramando PBX y diferenciados en neuronas DA de VM especializadas mediante un método de dos etapas. A continuación, los precursores de DA se trasplantan en modelos unilaterales de ratón PD de 6-hyroxydopamine (6-OHDA) para evaluar la seguridad y eficacia para el tratamiento de la DP. Este método proporciona una plataforma para investigar las funciones y efectos terapéuticos de las células neuronales DA específicas del paciente in vitro e in vivo.

Introducción

La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo común, causado por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia nigra pars compacta (SNpc) en el mesencéfalo ventral (VM), con una prevalencia de más del 1% en la población mayor de 60 años de edad 1 , 2. Durante la última década, la terapia celular, dirigida a sustituir las células degenerativas o dañadas, o nutrir el microambiente alrededor de las neuronas degenerativas, ha demostrado potencial en el tratamiento de la DP3. Mientras tanto, la tecnología de reprogramación ha hecho progresos significativos4, que proporciona una fuente celular prometedora para la terapia de reemplazo. Se ha demostrado que las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (iPSC) y las células madre embrionarias (ESC) son capaces de diferenciarse en células neuronales DA, que podrían sobrevivir, madurar y mejorar las funciones motoras cuando se injertan en modelos de DP de rata y primate no humano5 ,6,7,8. los iPSC representan un hito en las tecnologías de reprogramación celular y tienen un gran potencial en el trasplante de células; sin embargo, todavía existe una preocupación sobre el riesgo de formación de tumores de las células incompletamente diferenciadas. Una fuente celular alternativa para el trasplante de células es la que las células madre adultas cometidas por linajes se obtienen a través de la reprogramación directa, como las células madre neurales inducidas (iNSC), que pueden derivarse de los intermediarios inestables, evitando la pluripotencia etapa9,10,11.

Tanto los ISPC como los iNSC pueden reprogramarse a partir de fuentes celulares autólogas, como fibroblastos, células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) y varios otros tipos de células12,13,14,reduciendo así la inmunogenicidad de las células trasplantadas en gran medida. Además, en comparación con los iPSC, los iNSC son inherentes a la reducción del riesgo de formación de tumores y la plasticidad comprometida con el linaje, sólo capaces de diferenciarse en neuronas y glia11. En los estudios iniciales, se generaron iPSCs humanos o ratón e iNSC a partir de fibroblastos obtenidos a partir de biopsias cutáneas, que es un procedimiento invasivo14,15. Con este respecto, los PBMNC sson una fuente de células de inicio atractiva debido al proceso de muestreo menos invasivo, y la facilidad para obtener un gran número de células dentro de un corto período de tiempo de expansión16. Los estudios iniciales de reprogramación emplearon sistemas de administración integrador, como vectores lentivirales o retrovirales, que son eficientes y fáciles de implementar en muchos tipos de células17; sin embargo, estos sistemas de administración pueden causar mutaciones y reactivación de transgenes residuales, que presentan problemas de seguridad con fines terapéuticos clínicos12. El virus DeSendai (SeV) es un virus de ARN no integrador con un genoma de una sola cadena de sentido negativo que no se integra en el genoma del huésped, sino que sólo se replica en el citoplasma de las células infectadas, ofreciendo un vehículo eficiente y seguro para la reprogramación18 ,19. Hay disponibles vectores SeV recombinantes que contienen factores de reprogramación, incluidos los modelos humanos OCT3/4, SOX2, KLF4 y c-MYC en sus marcos de lectura abiertos. Además, los vectores virales SeV pueden mejorarse aún más mediante la introducción de mutaciones sensibles a la temperatura, de modo que podrían eliminarse rápidamente cuando la temperatura de cultivo se eleva a 39 oC20. En este artículo, se describe un protocolo para reprogramar PBX a iNSCs mediante el sistema SeV.

Muchos estudios han reportado derivación de neuronas DA de ESCs humanas o iPSC utilizando varios métodos6,8,21. Sin embargo, hay una escasez de protocolos que describen la diferenciación de las neuronas DA de iNSCs en detalle. En este protocolo, describiremos la generación eficiente de neuronas DA a partir de iNSCs utilizando un método de dos etapas. Los precursores neuronales DA se pueden trasplantar al estriado de los modelos de ratón PD para evaluaciones de seguridad y eficacia. Este artículo presentará un protocolo detallado que cubre varias etapas desde la generación de células madre neurales inducidas por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas DA, establecimiento de modelos de PD de ratón, al trasplante de precursores de DA en el estriado de los modelos de PD. Usando este protocolo, uno puede generar iNSCs de pacientes y donantes sanos y derivar neuronas DA que sean seguras, estandarizadas, escalables y homogéneas para fines de trasplante celular, o para modelar PD en un plato e investigar los mecanismos enfermedad subyacente y desarrollo.

Protocolo

Todos los procedimientos deben seguir las directrices del comité institucional de ética de la investigación humana. El consentimiento informado debe obtenerse de pacientes o voluntarios sanos antes de la recolección de sangre. Este protocolo fue aprobado por el comité de ética de la investigación humana de la institución y se realizó de acuerdo con las directrices de la institución para el cuidado y uso de animales.

1. Recogida, aislamiento y expansión de los PBMN

  1. Colección de PBMNCs
    1. Recoger 10-20 ml de sangre venosa periférica del donante por venopunción con un vial conservante de heparina sódica.
      NOTA: Las muestras de sangre deben almacenarse o enviarse a temperatura ambiente (RT). Procesar las muestras de sangre en un plazo de 24 h.
  2. Preparación del medio de cultivo
    1. Preparar el medio libre de suero (SFM) combinando los siguientes componentes: 245 ml del medio Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), 240 ml de F-12 de Ham, 5 ml de suplemento de insulina-transferrina-selenio-X (ITS-X), 5 ml de solución de material de glutamina 100x (Tablade Materiales),5 ml de concentrado lipídico definido químicamente, 2,5 g de suero bovino fetal, 0,025 g de ácido ascórbico y 9 ml de 1-tioglicerol. Filtrar el medio y guardarlo a 4oC.
      ADVERTENCIA: El ácido ascórbico y el 1-tioglicerol son tóxicos por contacto con la piel e inhalación.
    2. Para preparar el medio de célula mononuclear (MNC), complementar el medio SFM con 10 ng/ml de interleucina humana 3 (IL-3), 2 U/ml de eritropoyetina (EPO), factor de células madre humanas de 100 ng/ml (SCF), factor de crecimiento insulina humana de 40 ng/ml 1 (IGF-1), 100 g/ml holo-transferina y 1 Dexametasona M. Filtrar el medio y guardarlo a 4oC.
      NOTA: Prepare el medio inmediatamente antes de usarlo.
  3. Aislamiento de PBMNCs
    1. Esterilizar con ultravioleta un banco limpio antes de su uso. Esterilice todas las superficies y equipos con un 75% de alcohol. Esterilice todas las puntas mediante el uso de un autoclave.
    2. Transfiera la sangre periférica (PB) a un tubo cónico de 50 ml y diluya el PB con un volumen igual de solución salina estéril de Dulbecco con búfer de fosfato (D-PBS).
    3. Preparar 15 ml de medio de gradiente de densidad esterilizado(Tablas de Materiales)en otro tubo cónico de 50 ml.
      NOTA: Mantenga el medio de gradiente de densidad y PB en RT para permitir un mejor aislamiento de PBX.
    4. Incline el tubo cónico que contiene el medio de gradiente de densidad en un ángulo de 45o, y luego coloque lenta y cuidadosamente 30 ml de PB diluido en el medio de gradiente de densidad.
      NOTA: Tenga cuidado y permita que el PB corra lentamente por el lado del tubo cónico sobre la capa media de gradiente de densidad. Los glóbulos rojos se depositarán en la parte inferior del tubo. Incline el tubo con cuidado para minimizar la interrupción de la interfaz de capa.
    5. Centrifugar los tubos a 800 x g durante 15 minutos en RT con el freno centrífugo en posición "apagado". Aspira la capa de plasma superior amarilla y deséchala. A continuación, transfiera la capa de película delgada nublada blanca que contiene MNCs con una pipeta de 10 ml a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
      NOTA: La desactivación del freno de centrífuga es importante para el aislamiento de las MNC.
    6. Añadir 30 ml de D-PBS al tubo con MNCs y centrifugar a 600 x g durante 10 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y, a continuación, agregue 45 ml de D-PBS para volver a suspender las celdas. Centrífuga a 400 x g durante 10 min a 4oC.
      NOTA: El freno de centrífuga debe estar encendido para este y los siguientes pasos de centrifugación. Como los pellets celulares son densos, agregue 1-2 ml de D-PBS para volver a suspender suavemente los pellets, y luego agregue D-PBS a 45 mL.
    7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las celdas con 5 ml de D-PBS y cuente las celdas vivas con el método de exclusión azul trypan.
    8. Después de dejar a un lado los MNC necesarios para la expansión, congele las celdas restantes para su uso futuro.
      NOTA: Se pueden congelar al menos 5 x 106 MNC en un vial con 1 ml de medio de congelación (Tablade materiales). El protocolo se puede pausar aquí.
  4. Expansión de las MNC
    1. En el día -14, las semillas de MNC a una densidad de 2-3 x 106 células por mililitro en un pozo de placas de seis pocillos con 1,5 ml de medio MNC precalentado (37 oC). Incubar a 37oC, 5% CO2 durante 2 días.
    2. En el día -11, recoger las células y el medio con una pipeta esterilizada y transferir a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células a 250 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de medio MNC precalentado (37 oC).
    3. Cuente las celdas viables con trippan azul. Sembrar los MNC a una densidad de 1 x 106 células por mililitro en medio MNC precalentado e incubar a 37 oC, 5% CO2 durante 3 días.
      NOTA: Se espera que el número total de celdas puede disminuir en el día -11.
    4. En el día -8, repita los pasos 1.4.2-1.4.3 y el cultivo de las celdas durante 3 días.
    5. En el día -4, repita los pasos 1.4.2-1.4.3 y el cultivo de las celdas durante 3 días.
      NOTA: Después de 14 días de cultivo, un número igual o mayor de MNCs debe permanecer en la cultura.

2. Reprogramación de PBMNCs a iNSCs por infección SeV

  1. Preparación del medio de solución y cultura
    1. Preparar una solución de stock de poli-d-lisina (PDL) disolviendo 100 mg de PDL con 100 ml de H2O a una concentración de 1 mg/ml. Conservar a -20oC en alícuotas de 1 ml.
    2. Preparar una solución de insulina en sumos mediante la disolución de 100 mg de insulina en 20 ml de 0,01 N HCl a una concentración de 5 mg/ml. Conservar a -20oC en alícuotas de 1 ml.
    3. Para preparar 200 ml de medio basal iNSC, combinar 96 ml de DMEM-F12 y 96 ml de medio básico (Tablade Materiales)con 2 ml de solución de glutamina de 100x, 2 ml de aminoácido no esencial (NEAA), 2 ml de suplemento N2 y 2 ml de suplemento de B27. Añadir 10 ng/ml de factor inhibitorio de leucemia humana recombinante, 3 m chir99021 y 2 m SB431542 antes de su uso. Filtrar el medio y guardarlo a 4oC.
      NOTA: Utilice el medio en un plazo de 2 semanas. Añadir factor inhibitorio de leucemia humana recombinante, CHIR99021 y SB431542 inmediatamente antes de su uso.
  2. Reprogramación de PBX a iNSCs por infección Por SeV
    1. Esterilizar con ultravioleta un banco limpio antes de su uso. Esterilice todas las superficies y equipos con un 75% de alcohol. Esterilice todos los consejos usando un autoclave.
    2. En el día 0, recoger las células en el medio MNC y transferir a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células con 1 ml de medio MNC precalentado.
    3. Cuente las celdas viables con trippan azul. Vuelva a suspender las células con medio MNC precalentado (37 oC) a una concentración de 2 x 105 células por poca en placas de 24 pocillos.
    4. Después de retirar los tubos SeV de un almacenamiento de -80 oC, descongelar los tubos que contienen SeV en un baño de agua de 37 oC durante 5-10 s, y luego permitir que se descongelen en RT. Una vez desconwemadas, colóquelas en hielo inmediatamente.
    5. Añadir el Humano de codificación SeV Klf4, Oct3/4, SOX2 y c-MyC a los pozos, a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Células centrífugas con placas a 1.000 x g durante 30 min para facilitar la unión de las células. Deje las células y el sobrenadante en las placas. Colocar las placas en la incubadora a 37oC, 5%CO2.
      ADVERTENCIA: Todos los procedimientos relacionados con SeV deben realizarse en un armario de seguridad, y todas las puntas y tubos deben tratarse con etanol o lejía antes de su eliminación.
    6. En el día 1, transfiera el medio y las células a un tubo centrífugo de 15 ml. Enjuagar el pozo con 1 ml de medio MNC. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células con 500 s l de medio Fresco de MNC precalentado en placas de 24 pocillos.
      NOTA: Utilice una placa de 24 pocillos de fijación baja para evitar la fijación de cualquier celda antes de enchapar en PDL/laminin.
    7. En el día 2, diluir 1 ml de 1 mg/ml de PDL con 19 ml de D-PBS a una concentración de 50 g/ml. Cubra placas de 6 pocillos con 50 g/ml PDL durante al menos 2 h a RT.
    8. Diluir 200 l de 0,5 mg/ml de laminin a 20 ml de D-PBS a una concentración de 5 g/ml. Aspirar PDL en las placas de 6 pocillos, y secar en el banco vertical limpio.
    9. Recubrir placas de 6 pocillos con 5 g/ml de laminina e incubar durante 4-6 h a 37oC. Lavar con D-PBS antes de usar.
    10. En el día 3, placa las células transducidas obtenidas en el paso 2.2.6 en el medio iNSC en placas de 6 pocillos recubiertas de PDL/laminin.
      NOTA: Mueva las placas suavemente si es necesario después de colocar las células en placas recubiertas de PDL/laminina, tratando de no perturbar la unión de las células.
    11. En el día 5, añadir 1 ml de medio iNSC precalentado (37 oC) en cada pocal en placas de 6 pocillos con suavidad.
      NOTA: Se espera que las células se sometan a una muerte drástica (>60%).
    12. En el día 7, añadir 1 ml de medio iNSC precalentado (37 oC) en cada pocal en placas de 6 pocillos con suavidad.
    13. Desde el día 9 hasta el día 28, sustituya el medio gastado por un medio iNSC fresco precalentado (37 oC) todos los días. Monitorear la aparición de las colonias de iNSC. Elija y transfiera clones de iNSC para su expansión en aproximadamente 2-3 semanas. Recoger colonias con morfología apropiada utilizando pipetas de vidrio quemado, excluyendo cualquier célula posiblemente contaminante, y aspirar a las colonias con puntas de 200 l.
      NOTA: Los iNSC caracterizados se pueden congelar para su uso futuro con 2-5 colonias en un vial. El medio de congelación incluye medio basal libre de suero (Tabla de materiales) y dimetilsulfóxido mezclado en una proporción de 9:1, que debe prepararse inmediatamente antes de su uso. El protocolo se puede pausar aquí.

3. Diferenciación de iNSCs a neuronas dopaminérgicas

  1. Preparación del medio de solución y cultura
    1. Preparar 200 ml de medio basal de diferenciación iNSC combinando 192 ml de DMEM-F12 con 2 ml de solución de stock de glutamina 100x, 2 ml de NEAA, 2 mL de suplemento N2 y 2 ml de suplemento B27.
      NOTA: Utilice el medio en un plazo de 2 semanas.
    2. Preparar el medio de diferenciación iNSC I complementando el medio basal de diferenciación iNSC con 1 M SAG1 y 100 ng /mL FGF8b.
      NOTA: Utilice el medio en un plazo de 2 semanas.
    3. Preparar el medio de la etapa II de diferenciación iNSC complementando el medio basal de diferenciación iNSC con 0,5 mM de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), ácido ascórbico de 0,2 mM, 10 M DAPT, factor neurotrófico derivado del cerebro de 10 ng/ml (BDNF), derivado del glial de 10 ng/ml factor neutrofés (GDNF) y 1 ng/ml de factor de crecimiento transformador -III (TGF-III).
      NOTA: Utilice el medio en un plazo de 2 semanas.
  2. Recubrimiento de los platos de la cultura
    1. Esterilizar con ultravioleta un banco limpio antes de su uso. Esterilice todas las superficies y equipos con un 75% de alcohol. Esterilice todos los consejos usando un autoclave.
    2. Para el recubrimiento PDL, al menos un día antes de volver a chapar las células, diluir 1 ml de 1 mg/ml de PDL con 19 ml de D-PBS a una concentración de 50 g/ml. Recubrir los revestimientos de vidrio de 12 mm que han sido esterilizados con 75% de alcohol en las placas de 24 pocillos con 50 g/ml PDL a RT durante al menos 2 h.
    3. Para el recubrimiento de laminina, diluir 200 ml de 0,5 mg/ml de laminin a 20 ml de D-PBS a una concentración de 5 g/ml. Aspirar PDL y secar los pozos en el banco limpio. Recubrir los labios de las cubiertas de 12 mm con 5 g/ml de laminina e incubar durante 4-6 h a 37 oC. Lavar con D-PBS antes de usar.
  3. Células de paso para diferenciación.
    1. Cuando la confluencia de iNSCs cultivados alcanza el 70-90%, aspirar el medio de la placa de cultivo, y añadir 1 mL de D-PBS para lavar las células. Añadir 1 mL de reactivo de disociación celular precalentado (37 oC) (Tablade materiales)por pozo e incubar a 37 oC durante 3 min para disociar las células.
    2. Después de la incubación durante 3 minutos, las células se han vuelto semiflotantes; añadir 3 ml de medio DMEM-F12 precalentado (37 oC) por pocido, y pipetear las células hacia arriba y hacia abajo para disociar los gránulos celulares en células individuales.
    3. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 250 x g durante 3 min. Aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender las células con el volumen adecuado de medio iNSC precalentado (37 oC) según el número de células.
    4. Cuente las celdas mediante el método de exclusión azul trypan. Placa 5 x 103 células por encubrimiento de vidrio de 12 mm en placas de 24 pocillos e incubar a 37oC, 5% CO2.
  4. Diferenciar iNSCs en neuronas dopaminérgicas.
    1. Iniciar la diferenciación 24 h después de volver a enchapar las células en los cubredes recubiertos con PDL/laminina. Aspirar el medio de cultivo, lavar las células una vez con D-PBS, y luego añadir 600 éL de medio de diferenciación precalentado Etapa I por pozo en placas de 24 pocillos e incubar a 37 oC, 5% CO2.
    2. Cambiar el medio todos los días desde el día 1 hasta el día 10 durante la primera etapa de diferenciación.
    3. En el día 10, aspirar el medio de cultivo y lavar las células una vez con D-PBS. Añadir 600 ml de medio de diferenciación precalentado (37 oC) II por pocido en placas de 24 pocillos e incubar a 37oC, 5% CO2.
    4. Cambiar el medio cada dos días desde el día 11 hasta el día 25 durante la segunda etapa de diferenciación. Las celdas diferenciadas se pueden fijar mediante paraformaldehído en diferentes puntos de tiempo para el análisis.
    5. Para la tinción inmunofluorescente, lave las células con D-PBS tres veces suavemente en los momentos elegidos dentro del día de diferenciación 11 a 25.
    6. Pipetear 300 l de tensioactivo no iónico (Tablade materiales)en 100 ml de PBS para hacer un tensioactivo no iónico al 0,3% en PBS.
      ADVERTENCIA: El tensioactivo no iónico es tóxico por contacto con la piel e inhalación.
    7. Fijar las celdas con 4% de paraformaldehído durante 10 min en RT. Luego lave con 0.3% en PBS tres veces.
      ADVERTENCIA: Paraformaldehído es tóxico por contacto con la piel e inhalación.
    8. Bloquee las células en un 3% de suero de burro durante 2 h en RT.
    9. Diluir el anticuerpo primario en un 1% de suero de burro a una concentración adecuada y triturar suavemente para mezclar. Añadir 300 l de la solución de anticuerpos primarios a cada pocal de la placa de 24 pocillos. Incubar las células a 4oC durante la noche. Lave las células con un tensioactivo no iónico al 0,3% en PBS tres veces.
    10. Diluir el anticuerpo secundario en un 1% de suero de burro a una concentración adecuada y triturar suavemente para mezclar. Añadir 300 l de la solución de anticuerpos secundarias a cada pocal de la placa de 24 pocillos. Incubar las células a RT durante 2 h, protegidas de la luz.
    11. Lave las células con un tensioactivo no iónico al 0,3% en PBS tres veces. Diluir 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) con PBS con 1:500 dilución. Incubar las células en cada pocal de la placa de 24 pocillos con 300 ml de DAPI diluido durante 15 minutos a RT, protegido de la luz. Lave las células con un tensioactivo no iónico al 0,3% en PBS tres veces.
    12. Saque suavemente los labios de las cubiertas de los pozos de las placas con fórceps. Secar en la oscuridad durante la noche en RT. Montar bajo un microscopio de fluorescencia.

4. Establecimiento de modelos unilaterales de ratón PD de 6-hiroxidopamina (6-OHDA)

  1. Para generar modelos de ratón PD para trasplante de células, utilice ratones machos adultos SCID-beige que pesen 20-25 g para la inyección de 6-OHDA.
  2. Preparación de medicamentos para la cirugía
    1. Preparar una solución de ácido ascórbico al 0,2% disolviendo 0,2 g de ácido ascórbico en 100 ml de solución salina esterilizada (0,9%) y almacenar a -80 oC hasta su uso. El día de la cirugía, diluir 0.2% solución de ácido ascórbico por 10 veces para obtener una solución de ácido ascórbico 0.02%.
      NOTA: Se añade ácido ascórbico para evitar la oxidación de 6-OHDA a una forma inactiva.
    2. Para preparar una solución de 6-OHDA, pese la cantidad adecuada de 6-OHDA en un tubo esterilizado de 1 ml, y luego agregue un poco de volumen de ácido ascórbico al 0,02% para hacer una solución de 5 g/L 6-OHDA. Vórtice la mezcla hasta que se disuelva. Coloque el 6-OHDA sobre hielo hasta su uso.
      NOTA: 6-OHDA es sensible a la temperatura y a la luz. Tenga cuidado de proteger la solución de la luz y mantenerla en hielo antes de su uso.
  3. Preparar el equipo quirúrgico esterilizado mediante autoclave antes de la cirugía. Limpie todas las áreas de equipos y superficies con etanol al configurar el marco estereotaxico. Configure una jaula de recuperación del ratón debajo de una lámpara de calefacción.
  4. Llevar a cabo la cirugía para establecer modelos unilaterales de ratón 6-OHDA-lesioned.
    1. Pesar cada ratón, registrar el peso y calcular la cantidad de medicamento que necesita ser administrado. Cada ratón recibe 0,5 mg/kg de atropina 20 minutos antes de las operaciones. Anestetizar el ratón con 80 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina.
    2. Administrar 0,5 mg/kg de atropina mediante inyección intraperitoneal.
    3. Anestetizar el ratón con 80 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina por inyección intraperitoneal 20 min después de la administración de atropina.
    4. Ponga el ratón en una cámara cerrada. Después de 3-5 minutos, el ratón será profundamente anestesiado sin respuesta al pellizco de la pata trasera.
      NOTA: Se espera que el ratón que ha recibido anestesia experimente un período de excitación.
    5. Afeitar la cabeza del ratón y aplicar un gesto ocular de eritromicina en los ojos del ratón para protegerse del desarrollo de úlceras corneales.
    6. Coloque el ratón sobre el aparato estereotaxico. Fije el ratón con barras incisivas en primer lugar. Inserte los auriculares correctamente para hacer que la cabeza del ratón esté en una posición plana y segura.
    7. Esterilice la cabeza del ratón con yodo de povidona y alcohol isopropílico. Corta una incisión sagital (1,5 cm) en la piel de la cabeza con una cuchilla de bisturí, y expone el cráneo. Ajuste la barra incisiva y las barras de los oídos para reducir la diferencia de altura entre bregma y lambda a menos de 0,1 mm.
      NOTA: El bregma de ratón se encuentra en la intersección de suturas coronales y sagitales, y lambda está en la intersección de suturas lambdoidas y sagitales.
    8. Mueva lentamente y baje la punta de la aguja hacia bregma y trate el bregma como un punto cero. Mueva la punta a una posición con coordenadas de A/P +0,5 mm, M/L -2,1 mm en relación con bregma. Retirar la punta y marcar el punto. Encaja un pequeño agujero en el cráneo.
    9. Extraer 2 solución de 5 g/L 6-OHDA en la microjeringa (Tablade materiales). Vuelva a colocar la aguja en el punto marcado e inserte la aguja en D/V -3,2 mm.
    10. Inyectar 2 sL de 5 g/L 6-OHDA solución (10 g en total) a una velocidad de 1 l/min. Después de la inyección de 6-OHDA se ha completado, dejar la aguja en su lugar durante otros 5 minutos. A continuación, retraiga lentamente la aguja de inyección.
    11. Cierre la incisión con suturas y aplique un ungón ocular de eritromicina en los ojos del ratón. Entregar 0,5 ml de salina por vía subcutánea para prevenir la deshidratación, y aplicar un ung ánta antibiótico directamente sobre la piel suturada.
    12. Retire el ratón del aparato estereofómico y colóquelo en la jaula de recuperación. Vuelva a colocar el ratón y permita el acceso a la comida y al agua hasta que recupere la conciencia. Tratar el ratón con analgésico en agua potable diaria post-cirugía durante 2-3 días, y una dosis recomendada de ibuprofeno es 0.03 mg/g de peso corporal por día.
    13. Inspeccione el ratón diariamente después de la cirugía.

5. Evaluación del comportamiento después de lesiones unilaterales 6-OHDA

  1. De dos a tres semanas después de la cirugía, realice una evaluación del comportamiento para estimar los síntomas de la DP. Pesar cada ratón, registrar su peso y calcular la cantidad de medicamento que se debe administrar (0,5 mg/kg de apomorfina antes de la evaluación).
  2. Administrar 0,5 mg/kg de apomorfina mediante inyección subcutánea antes de la evaluación y colocar el ratón en un cilindro de vidrio.
  3. Después de un período de habituación de 5 minutos, cuente el número de rotaciones contralaterales e ipsilaterales en relación con el lado de la lesión por minuto y registre su actividad con una cámara de video.
  4. Los ratones con rotaciones contralaterales menos ipsilaterales >7 rpm/min se consideran lesionados con éxito y seleccionados como candidatos para experimentos de trasplante de células. Devuelva a los ratones a las jaulas de la vivienda después de un descanso de 30 minutos.
    NOTA: Si el ratón se lesionó con éxito, el ratón inyectado 6-OHDA mostrará un mayor sesgo en girar hacia el lado contralateral ya que el agonista DA activa el estriado denervado supersensible del lado lesionado predominantemente.
  5. Realizar la evaluación del comportamiento una semana antes y 2, 4, 6, 8, 12, 16 semanas después del trasplante de células.

6. Trasplante celular de precursores de DA

  1. Preparar la suspensión celular para el trasplante. Para el injerto celular, suspenda 2 x 105 precursores DA mezclados por precursores D10 y D13 DA en una proporción de 1:7 en 4 s l de 5 g L-1 glucosa en solución salina equilibrada (Tablade materiales)de tampón de trasplante.
  2. Realizar cirugía de trasplante celular siguiendo los procedimientos descritos en la sección 4.4, excepto que 6-OHDA es reemplazado por la suspensión o tampón de células precursor del DA.
  3. Realizar la evaluación del comportamiento 2, 4, 6, 8, 12, 16 semanas después del trasplante de células de precursores de DA siguiendo los procedimientos descritos en la sección 5. Cuente el número de rotaciones contralaterales inducidas por apomorfina en relación con el lado de la lesión por minuto y registre su actividad con una cámara de video.
    NOTA: Después del trasplante, una tasa reducida de rotaciones contralaterales sugiere una función motora mejorada.
  4. A las 4, 8 ,12 y 16 semanas después del trasplante celular, perfumar el ratón bajo anestesia profunda con 4% de paraformaldehído hasta que el cuerpo del ratón se vuelve rígido y el hígado del ratón se vuelve pálido.
  5. Separa suavemente el cerebro del ratón y coloca el cerebro en un 4% de paraformaldehído a 4oC durante la noche.
  6. En el segundo día, poner el cerebro en 30% sacarosa para la deshidratación hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo.
  7. Corta el cerebro a 40 m de espesor usando un microtome de congelación.
  8. Realice la inmunomancha como se describió anteriormente en los pasos 3.4.5-3.4.12.

Resultados

Aquí, informamos de un protocolo que cubre diferentes etapas de la terapia celular iNSC-DA para tratar modelos de DP. En primer lugar, los PBMNAC fueron aislados y ampliados, y reprogramados en iNSCs por infección por SeV. En la Figura 1se muestra una representación esquemática de los procedimientos con expansión PBMNC e inducción de iNSC. El día -14, los PBMNAC se aislaron utilizando un medio de gradiente de densidad (Tablade materiales). Antes de la centrifugación,...

Discusión

Aquí presentamos un protocolo que cubrió diferentes etapas de la terapia celular iNSC-DA para modelos de DP. Los aspectos críticos de este protocolo incluyen: (1) aislamiento y expansión de PBMNCs y reprogramación de PBMNCs en iNSCs por infección SeV, (2) diferenciación de iNSCs a las neuronas DA, (3) establecimiento de modelos unilaterales de ratón PD 6-OHDA-lesioned y comportamiento evaluación, y (4) trasplante de células de precursores de la DA y evaluación del comportamiento.

En...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 81561138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Proyecto de Apoyo a Profesores de Alto Nivel en las Universidades Municipales de Beijing en el Período de 13o Plan Quinquenal (CIT & TCD20180333), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Beijing Beijing Fondo Municipal de la Comisión de Salud (PXM 2018_026283_000002), Beijing Cien, Mil y Diez Mil Talentos (2018A03), Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support (ZYLX201706), y el Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
15-ml conical tubeCorning430052
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145Toxic for inhalation and skin contact
24-well plateCorning3337
50-ml conical tube Corning430828
6-OHDASigma-AldrichH4381
6-well plateCorning3516
AccutaseInvitrogenA11105-01Cell dissociation reagent
ApomorphineSigma-AldrichA4393
Ascorbic acidSigma-AldrichA92902Toxic with skin contact 
B27 supplement Invitrogen17504044
BDNFPeprotech450-02Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparinBD367871
BSAyisheng36106es60Fetal bovine serum
cAMPSigma-AldrichD0627Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2ZENOAQ100mlUsed as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrateInvitrogen11905031
CHIR99021Gene Operation04-0004
CoverslipFisher25*25-2
DAPISigma-AldrichD8417-10mg
DAPTSigma-AldrichD5942
DexamethasoneSigma-AldrichD2915-100MG
DMEM-F12Gibco11330
DMEM-F12Gibco11320
Donkey serumJackson017-000-121
EPOPeprotech100-64-50UGHuman Erythropoietin
FGF8bPeprotech100-25
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02P=1.077, density gradient medium
GDNFPeprotech450-10Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAXInvitrogen21051024100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12Gibco11765-054
HBSSInvitrogen14175079Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factorMillporeLIF1010
Human recombinant SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1Peprotech100-11-100UGHuman insulin-like growth factor 
IL-3Peprotech200-03-10UGHuman interleukin 3
IMDMGibco215056-023Iscove's modified Dulbecco's medium
InsulinRoche 12585014
ITS-XInvitrogen51500-056Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacementGibco10828028Serum free basal medium
LamininRoche 11243217001
MicrosyringeHamilton7653-01
N2 supplement Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050Non-essential amino acid
NeurobasalGibco10888Basic medium
PDLSigma-AldrichP7280Poly-D-lysine
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542Gene Operation04-0010-10mgStore from light at -20?
Sendai virusLife TechnologiesMAN0009378
Sucrosebaiaoshengke
TGFβ?Peprotech100-36ETransforming growth factor  β?
TransferrinR&D Systems2914-HT-100G
Triton X 100baiaoshengkeNonionic surfactant
Trypan blueGibcoT10282
XylazineSigma-AldrichX1126

Referencias

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