JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол представляет перепрограммирование периферических моноядерных клеток крови, чтобы вызвать нервные стволовые клетки путем инфекции вируса Сендай, дифференциация iNSCs в дофаминергические нейроны, трансплантация прекурсоров DA в одностороннем-пораженных Болезнь Паркинсона мыши модели, и оценка безопасности и эффективности iNSC полученных dA предшественников для лечения PD.

Аннотация

Болезнь Паркинсона (PD) вызвана дегенерацией дофаминергических (DA) нейронов на substantia nigra pars compacta (SNpc) в брюшной мезенцефалон (VM). Клеточная заместительная терапия имеет большие перспективы для лечения PD. В последнее время, индуцированных нервных стволовых клеток (iNSCs) стали потенциальным кандидатом на клеточной заместительной терапии из-за снижения риска образования опухоли и пластичности, чтобы привести к региона конкретных нейронов и глии. iNSCs могут быть перепрограммированы из аутологических соматических клеточных источников, таких как фибробласты, периферийные моноядерные клетки крови (ПБМНК) и различные другие типы клеток. По сравнению с другими типами соматических клеток, PBMNCs являются привлекательным типом стартерных клеток из-за легкости доступа и расширения в культуре. Сендай вирус (SeV), РНК неинтегративного вируса, кодирование факторов перепрограммирования, включая человека OCT3/4, SOX2, KLF4 и c-MYC, имеет отрицательный смысл, одноцепочечный, несегментированный геном, который не интегрируется в геном хозяина, но только реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток, предлагая эффективный и безопасный инструмент для перепрограммирования. В этом исследовании мы описываем протокол, в котором iNSCs получают путем перепрограммирования PBMNCs, и дифференцированы в специализированные нейроны VM DA двухступенчатым методом. Затем прекурсоры DA пересаживаются в одностороннем порядке 6-hyroxydopamine (6-OHDA) -пораженные модели мыши PD для оценки безопасности и эффективности для лечения PD. Этот метод предоставляет платформу для изучения функций и терапевтических эффектов пациентов конкретных DA нейронных клеток in vitro и in vivo.

Введение

Болезнь Паркинсона (PD) является распространенным нейродегенеративным расстройством, вызванным дегенерацией дофаминергических (DA) нейронов на substantia nigra pars compacta (SNpc) в вентральном мезенефалионе (VM), с преобладанием более 1% у населения старше 60 лет 1 , 2. За последнее десятилетие, клеточная терапия, направленная либо на замену дегенеративных или поврежденных клеток, или питание микросреды вокруг вырождающихся нейронов, показал потенциал в лечении PD3. Между тем, технология перепрограммирования добилась значительного прогресса4, который обеспечивает перспективный клеточный источник для заместительной терапии. Было доказано, что индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) и эмбриональные стволовые клетки (ESCs) способны дифференцироваться в нервные клетки DA, которые могут выживать, maturate и улучшать двигательные функции при привитом крысиных и нечеловеческих моделей PD ,6,7,8. iPSCs представляют собой веху в клеточных технологиях перепрограммирования и имеют большой потенциал в трансплантации клеток; однако, все еще забота о риске образования тумора от неполно дифференцированных клеток. Альтернативным клеточным источником для трансплантации клеток является линия- совершенных взрослых стволовых клеток, полученных путем прямого перепрограммирования, таких как индуцированные нервные стволовые клетки (iNSCs), которые могут быть получены из нестабильных промежуточных, в обход плюрипотентности этап9,10,11.

Как iPSCs, так и iNSCs могут быть перепрограммированы из аутологичных клеточных источников, таких как фибробласты, периферийные моноядерные клетки крови (ПБМНК) и различные другие типы клеток12,13,14, тем самым уменьшая иммуногенности пересаженных клеток в значительной степени. Кроме того, по сравнению с iPSCs, iNSCs присущи снижение риска образования опухоли и линии, совершенные пластичности, только в состоянии дифференцировать в нейроны и глия11. В первоначальных исследованиях, человека или мыши iPSCs и iNSCs были созданы из фибробластов, полученных из биопсии кожи, которая является инвазивной процедурой14,15. С этим уважением, PBMNCs являются привлекательным источником стартер ячейки из-за менее инвазивного процесса отбора проб, и легкость для получения большого количества клеток в течение короткого периода времени расширения16. Первоначальные исследования перепрограммирования использовали интегративные системы доставки, такие как лентивирусные или ретровирусные векторы, которые являются эффективными и простыми в реализации во многих типах клеток17; однако, эти системы доставки могут вызвать мутации и реактивацию остаточных трансгенов, которые представляют проблемы безопасности для клинических терапевтических целей12. Вирус Сендай (SeV) является неинтегративным РНК-вирус омовением с отрицательным смыслом, одноцепочечным геномом, который не интегрируется в геном хозяина, а только размножается в цитоплазме инфицированных клеток, предлагая эффективный и безопасный инструмент для перепрограммирования18 ,19. Рекомбинантные векторы SeV доступны, которые содержат факторы перепрограммирования, включая человека OCT3/4, SOX2, KLF4 и c-MYC в их открытых кадрах чтения. Кроме того, seV вирусные векторы могут быть дополнительно улучшены путем введения чувствительных к температуре мутаций, так что они могут быть быстро удалены, когда температура культуры поднимается до 39 градусов по Цельсию20. В этой статье мы описываем протокол перепрограммирования PBMNCs на iNSCs с помощью системы SeV.

Многие исследования сообщили вывод dA нейронов от человека ESCs илиiPSCs с использованием различных методов 6,8,21. Тем не менее, существует нехватка протоколов, описывающих дифференциацию нейронов DA от iNSCs в деталях. В этом протоколе мы опишите эффективное генерирующее нейроны DA из iNSCs с помощью двухэтапного метода. Предшественники нейронов DA могут быть пересажены в стриатум моделей PD мыши для оценки безопасности и эффективности. В этой статье будет представлен подробный протокол, который охватывает различные этапы от генерации индуцированных нервных стволовых клеток вирусом Сендай, дифференциация iNSCs в DA нейронов, создание мыши PD модели, для трансплантации прекурсоров DA в стриатума моделей PD. Используя этот протокол, можно генерировать iNSCs от пациентов и здоровых доноров и получить DA нейронов, которые являются безопасными, стандартизируемыми, масштабируемыми и однородными для клеточной трансплантации целей, или для моделирования PD в тарелке и исследования механизмов основного заболевания и развития.

протокол

Все процедуры должны следовать руководящим принципам институционального комитета по этике исследований человека. Информированное согласие должно быть получено от пациентов или здоровых добровольцев до сбора крови. Этот протокол был одобрен комитетом по этике исследований человека и выполнен в соответствии с руководящими принципами учреждения по уходу и использованию животных.

1. Сбор, изоляция и расширение ПБМНК

  1. Коллекция PBMNCs
    1. Соберите 10-20 мл периферической венозной крови донора путем веникунктуры с консервантом натрия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы крови должны храниться или отправляться при комнатной температуре (RT). Обработка образцов крови в течение 24 ч.
  2. Подготовка культуры среды
    1. Подготовка сыворотки свободной среде (SFM) путем объединения следующих компонентов: 245 мл iscove модифицированных Dulbecco в среднем (IMDM), 240 мл ветчины F-12, 5 мл инсулина-трансферрин-селена X дополнение (ITS-X), 5 мл 100x глутаминового склада раствора ( Таблица из 100x глутаминового запаса раствора ( Таблица из 100x глутаминового запаса раствора ( Таблица из 100x глутаминового запасного раствора ( Таблица из 100x глутаминового запаса ( Таблица раствора запаса клетока 100x ( Таблица из таблицы раствора запаса клебетамина 100x Материалы),5 мл химически определенного липидного концентрата, 2,5 г сыворотки крупного рогатого скота плода, 0,025 г аскорбиновой кислоты и 9 л 1 тиоглицерола. Фильтр среды и хранить его при 4 градусах Цельсия.
      ВНИМАНИЕ: Аскорбиновая кислота и 1 тиоглицерол токсичны при контакте с кожей и ингаляции.
    2. Для подготовки моноядерной клетки (MNC) среды, дополнить SFM среды с 10 нг /мл человека интерлейкин 3 (IL-3), 2 U/mL эритропоэтин (EPO), 100 нг/мл человека фактор стволовых клеток (SCF), 40 нг/мл человека инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), 100 мкг/мго-передачи 1 ММ дексаметазон. Фильтр среды и хранить его при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте среду непосредственно перед использованием.
  3. Изоляция ПБМНК
    1. Ультрафиолет-стерилизовать чистую скамейку перед использованием. Стерилизовать все поверхности и оборудование с 75% алкоголя. Стерилизовать все советы с помощью автоклава.
    2. Перенесите периферическую кровь (ПБ) в коническую трубку 50 мл и разбавьте ПБ с равным объемом стерильного софтато-буферного солей Дульбекко (D-PBS).
    3. Приготовьте 15 мл стерилизованной среды градиента плотности(ТаблицыМатериалов) в другой конической трубке 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите градиент плотности среды и ПБ на RT, чтобы обеспечить лучшую изоляцию PBMNCs.
    4. Наклоните коническую трубку, содержащую среду градиента плотности под углом 45 градусов, а затем медленно и осторожно положите 30 мл разбавленного ПБ на среду градиента плотности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь и позвольте ПБ медленно бежать вниз по стороне конической трубки на плотность градиент среднего слоя. Красные кровяные тельца будут откладываться на дно трубки. Тщательно наклоните трубку, чтобы свести к минимуму нарушение интерфейса слоя.
    5. Центрифуга труб на 800 х г в течение 15 минут на RT с центрифугой тормоза установить на "выключен" позиции. Приажьте желтый, верхний слой плазмы и отбросьте его. Затем перенесите белый облачный тонкий слой пленки, содержащий МНК с пипеткой 10 мл, в новую коническую трубку 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выключение центрифугного тормоза важно для изоляции МНК.
    6. Добавьте 30 мл D-PBS в трубку с МНК и центрифугу при 600 х г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта, а затем добавьте 45 мл D-PBS, чтобы повторно приостановить клетки. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при 4 градусах По цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифуга тормоз должен быть включен для этого и следующие шаги центрифуги. Поскольку клеточные гранулы плотные, добавьте 1-2 мл D-PBS, чтобы аккуратно повторно приостановить гранулы, а затем добавить D-PBS до 45 мл.
    7. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановить клетки с 5 мл D-PBS и рассчитывать живые клетки с методом трипан синий исключения.
    8. После отмены МНК, необходимых для расширения, заморозьте оставшиеся ячейки для использования в будущем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере 5 х 106 МНК могут быть заморожены в одном флаконе с 1 мл замораживания среды (Таблица материалов). Протокол можно приложить здесь.
  4. Расширение МНК
    1. В день -14, семена MNCs при плотности 2-3 х 106 ячеек на миллилитр в одной скважине из шести колодцев пластин с 1,5 мл предварительно подогретого (37 градусов по Цельсию) MNC среды. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение 2 дней.
    2. В день -11 соберите клетки и средние со стерилизованной пипеткой и перенесите на новую коническую трубку 15 мл. Центрифуги клетки на 250 х г в течение 5 мин на RT. Отбросьте супернатант и повторно приостановить клетки в 1 мл предварительно нагревается (37 градусов по Цельсию) MNC среды.
    3. Подсчитайте жизнеспособные клетки с трипан синим. Семена MNCs при плотности 1 х 106 ячеек на миллилитр в предварительно разогретой среде MNC и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что общее количество клеток может уменьшиться в день -11.
    4. В день -8 повторите шаги 1.4.2-1.4.3 и культивизируйте клетки в течение 3 дней.
    5. В день -4 повторите шаги 1.4.2-1.4.3 и культивизируйте клетки в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После 14 дней культуры, равное или большее число МНК должны оставаться в культуре.

2. Перепрограммирование ПБМНК на iNSCs с помощью инфекции SeV

  1. Подготовка решения и культуры среды
    1. Приготовьте раствор запаса поли-D-лизин (PDL), растворив 100 мг PDL с 100 мл H2O до концентрации 1 мг/мл. Хранить при -20 градусах по Цельсию в 1 мл aliquots.
    2. Подготовьте раствор инсулина путем растворения 100 мг инсулина в 20 мл 0,01 N HCl до концентрации 5 мг/мл. Хранить при -20 градусах по Цельсию в 1 мл aliquots.
    3. Для подготовки 200 мл базальной среды iNSC смешайте 96 мл DMEM-F12 и 96 мл базовой среды(Таблицаматериалов) с 2 мл раствора запаса 100x глутамина, 2 мл несущественных аминокислот (NEAA), 2 мл дополнения N2 и 2 мл дополнения B27. Добавьте 10 нг/мл рекомбинантного фактора ингибирующего лейкоза человека, 3 мкм CHIR99021 и 2 мкм SB431542 до использования. Фильтр среды и хранить его при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте среду в течение 2 недель. Добавить рекомбинантный фактор ингибирования лейкемии человека, CHIR99021 и SB431542 непосредственно перед использованием.
  2. Перепрограммирование PBMNCs на iNSCs с помощью SeV Инфекция
    1. Ультрафиолет-стерилизовать чистую скамейку перед использованием. Стерилизовать все поверхности и оборудование с 75% алкоголя. Стерилизовать все советы с помощью автоклава.
    2. На день 0, собрать клетки в MNC среды и передачи на 15 мл конической трубки. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и повторно приостановить клетки с 1 мл предварительно подогретого mNC среды.
    3. Подсчитайте жизнеспособные клетки с трипан синим. Повторно приостановить клетки с предварительно подогретых (37 градусов по Цельсию) MNC среды до концентрации 2 х 105 клеток на хорошо в 24-колодцев пластин.
    4. После удаления труб SeV из -80 градусов по Цельсию, разморозить трубки, содержащие SeV в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 5-10 с, а затем дать им таять на RT. После того, как оттаяли, поместите их на лед немедленно.
    5. Добавьте SeV кодируя людские Klf4, Oct3/4, SOX2 и c-MyC к скважинам, на разносторонности инфекции (MOI) 10. Центрифуги клетки с пластинами на 1000 х г в течение 30 минут, чтобы облегчить вложение клеток. Оставьте клетки и супернатант в пластинах. Поместите пластины в инкубатор на 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
      ВНИМАНИЕ: Все процедуры, связанные с SeV должны быть выполнены в шкаф безопасности, и все советы и трубки должны рассматриваться с этанолом или отбеливателем перед удалением.
    6. На 1-й день перенесите среду и клетки в центрифугу 15 мл. Промыть скважину 1 мл среднего MNC. Centrifuge подвески клетки на 200 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и повторно приостановить клетки с 500 зл и л свежей предварительно подогретой MNC среды в 24-колодцевых пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте низкое вложение 24-ну хорошо пластины для предотвращения крепления любых клеток, прежде чем покрытие на PDL / ламинин.
    7. На второй день разбавить 1 мл/мл PDL с 19 мл D-PBS до концентрации 50 мкг/мл. Пальто 6-колодись пластины с 50 мкг /мЛ PDL, по крайней мере 2 ч на RT.
    8. Разбавить 200 л 0,5 мг/мл ламинина с 20 мл D-PBS до концентрации 5 мкг/мл. Аспирир PDL в 6-колодных пластин, и сухой на вертикальной чистой скамейке.
    9. Пальто 6-колодись с ламинином 5 мкг/мл и инкубировать по 4-6 ч при 37 градусах Цельсия. Промойте с D-PBS перед использованием.
    10. На 3-й день пластины трансиндуцированных клеток, полученных в шаге 2.2.6 в среде iNSC на PDL/ламинин покрытием 6-колодские пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перемещение пластины осторожно, если это необходимо после того, как клетки помещаются на PDL / ламинин покрытием пластин, стараясь не нарушать крепление клеток.
    11. На день 5, добавить 1 мл предварительно подогретого (37 градусов по Цельсию) iNSC среды в каждом колодце в 6-хорошо пластины мягко.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что клетки претертят резкую смерть (60%).
    12. На 7-й день, добавить 1 мл предварительно подогретого (37 градусов по Цельсию) iNSC среды в каждом колодце в 6-хорошо пластины мягко.
    13. С 9-го дня на 28-й день замените отработанное средство свежим предварительно подогретым (37 градусов по Цельсию) iNSC-средой каждый день. Мониторинг появления колоний INSC. Выберите и перенесите клоны iNSC для расширения примерно через 2-3 недели. Возьмите колоний с соответствующей морфологии с использованием сожгли стеклянные пипетки, за исключением любых возможно загрязняющих клеток, и аспирить колонии с 200 наконечниками Л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Характерные iNSCs могут быть заморожены для использования в будущем с 2-5 колониями в одном флаконе. Замораживающая среда включает в себя сыворотку свободной базальной среды (Таблица материалов) и диметилсульфодсида смешанные в соотношении 9:1, которые должны быть подготовлены непосредственно перед использованием. Протокол можно приложить здесь.

3. Дифференциация iNSCs к дофаминергическим нейронам

  1. Подготовка решения и культуры среды
    1. Подготовьте 200 мл базальной среды дифференциации iNSC, объединив 192 мл DMEM-F12 с 2 мл раствора запаса 100x, 2 мл NEAA, 2 мл дополнения N2 и 2 мл дополнения B27.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте среду в течение 2 недель.
    2. Подготовка iNSC дифференциации этапе I среды путем дополнения iNSC дифференциации базальной среде с 1 мКМ SAG1 и 100 нг /мЛ FGF8b.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте среду в течение 2 недель.
    3. Подготовка iNSC дифференциации этап II среды путем дополнения iNSC дифференциации базальной среде с 0,5 мМ циклический аденозин монофосфат (cAMP), 0,2 мМ аскорбиновой кислоты, 10 ММ DAPT, 10 нг/мл мозга производные нейротрофический фактор (BDNF), 10 нг/мл глил произвешения производных нейтрофический фактор (GDNF) и 1 нг/мл, трансформирующий фактор роста ЗIII (TGF-III).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте среду в течение 2 недель.
  2. Покрытие культурных блюд
    1. Ультрафиолет-стерилизовать чистую скамейку перед использованием. Стерилизовать все поверхности и оборудование с 75% алкоголя. Стерилизовать все советы с помощью автоклава.
    2. Для покрытия PDL, по крайней мере за один день до повторного покрытия клеток, разбавить 1 мл 1 мг / мл PDL с 19 мл D-PBS в концентрации 50 мкг/мл. Пальто 12 мм стекла охватывает, которые были стерилизованы с 75% алкоголя в 24-колодец пластин ы с 50 мкг /мЛ PDL на RT, по крайней мере 2 ч.
    3. Для ламинина покрытие разбавить 200 л 0,5 мг/мл ламинина с 20 мл D-PBS до концентрации 5 мкг/мл. Аспирир PDL и высушить колодцы в чистой скамейке. Пальто 12 мм охватывает с 5 мкг /мл ламинина и инкубировать для 4-6 ч при 37 градусах Цельсия. Промойте с D-PBS перед использованием.
  3. Проходные ячейки для дифференциации.
    1. Когда слияние культивированных iNSCs достигает 70-90%, аспирировать среду от плиты культуры, и добавить 1 мл D-PBS для мытья клеток. Добавьте 1 мл предварительно разогретого (37 градусов по Цельсию) реагента диссоциации клеток(Таблицаматериалов) на скважину и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 3 мин, чтобы разъединить клетки.
    2. После инкубации в течение 3 мин, клетки стали полуплавающими; добавьте 3 мл предварительно разогретых (37 градусов по Цельсию) среднего DMEM-F12 на скважину, а клетки пипетки вверх и вниз, чтобы разъединить клеточные гранулы в одиночные клетки.
    3. Перенесите клетки в коническую трубку 15 мл, а центрифугу при 250 х г в течение 3 мин. Аспирировать супернатант, повторно приостановить клетки с соответствующим объемом предварительно подогретого (37 градусов По Цельсию) iNSC среды в зависимости от количества клеток.
    4. Подсчитайте клетки с помощью метода исключения trypan blue. Плита 5 х 103 ячеек на 12 мм стекла крышкой в 24-колодцев ы в 24-колодце в пластинах и инкубировать при 37 кв с, 5% CO2.
  4. Дифференцировать iNSCs в дофаминергических нейронов.
    1. Начните дифференциацию 24 ч после повторного покрытия клеток на PDL /ламинин покрытием крышки. Аспир наячона, мыть клетки один раз с D-PBS, а затем добавить 600 л предварительно разогретой стадии дифференциации я среды в хорошо в 24-колодцпластины и инкубировать при 37 КС, 5% CO2.
    2. Изменение среды каждый день с 1-го дня на день 10 на первом этапе дифференциации.
    3. На 10 день, аспирируют среду культуры, и мыть клетки раз с D-PBS. Добавить 600 кЛ предварительно разогретого (37 градусов по Цельсию) стадии дифференциации II средней в скважине в 24-колодцах пластин и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.
    4. Изменение среды через день с 11-го дня на 25 день во время второго этапа дифференциации. Дифференцированные клетки могут быть исправлены параформальдегидом в разные временные моменты для анализа.
    5. Для иммунофлуоресцентного окрашивания, мыть клетки с D-PBS три раза осторожно в выбранных точках времени в течение дня дифференциации 11 до 25.
    6. Пипетка 300 л ненионического сурфактанта(Таблицаматериалов) в 100 мл PBS, чтобы сделать 0,3% неионический сурфактант в PBS.
      ВНИМАНИЕ: Нонионический сурфактант токсичен при контакте с кожей и вдыхании.
    7. Исправить клетки с 4% параформальдегида в течение 10 мин на RT. Затем мыть с 0,3% в PBS три раза.
      ВНИМАНИЕ: Параформалдегид токсичен при контакте с кожей и вдыхании.
    8. Заблокируйте клетки на 3% осла сыворотки для 2 ч на RT.
    9. Разбавить первичное антитело в 1% ослиной сыворотки при соответствующей концентрации и аккуратно triturate перемешать. Добавьте 300 л первичного раствора антитела к каждой скважине 24-хорошо пластины. Инкубировать клетки при 4 градусах Цельсия в течение ночи. Вымойте клетки с 0,3% неионический сурфактант в PBS три раза.
    10. Разбавить вторичное антитело в 1% ослиной сыворотки при соответствующей концентрации и аккуратно triturate для смешивания. Добавьте 300 qL вторичного раствора антитела к каждому колодцу 24-хорошо пластины. Инкубировать клетки на RT в течение 2 ч, защищенных от света.
    11. Вымойте клетки с 0,3% неионический сурфактант в PBS три раза. Разбавить 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) с PBS с 1:500 разбавления. Инкубировать клетки в каждой скважине из 24-колодца пластины с 300 л разбавленного DAPI в течение 15 минут на RT, защищены от света. Вымойте клетки с 0,3% неионический сурфактант в PBS три раза.
    12. Аккуратно выняйте крышки из колодцев пластин с щипками. Сухой в темноте ночь на RT. Гора под флуоресцентным микроскопом.

4. Создание односторонних 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-пораженные модели мыши PD

  1. Для создания моделей PD мыши для трансплантации клеток, используйте взрослых мужчин SCID-бежевых мышей весом 20-25 г для инъекции 6-OHDA.
  2. Препарат препаратов для операции
    1. Приготовьте раствор аскорбиновой кислоты 0,2%, растворив 0,2 г аскорбиновой кислоты в 100 мл стерилизованного солей (0,9%) и хранить при -80 градусах по Цельсию до использования. В день операции разбавить 0,2% раствором аскорбиновой кислоты в 10 раз, чтобы получить раствор аскорбиновой кислоты 0,02%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аскорбиновая кислота добавляется для предотвращения окисления 6-OHDA в неактивной форме.
    2. Чтобы подготовить раствор 6-OHDA, взвесьте соответствующее количество 6-OHDA в стерилизованные трубки 1 мл, а затем добавить некоторый объем 0,02% аскорбиновой кислоты, чтобы сделать 5 мкг / Л 6-OHDA раствор. Vortex смесь, пока она не растворяется. Поместите 6-OHDA на лед до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 6-OHDA является температура и светочувствительным. Будьте осторожны, чтобы защитить раствор от света и держать его на льду перед использованием.
  3. Подготовка стерилизованного хирургического оборудования путем автоклавирования перед операцией. Очистите все оборудование и поверхностные участки с этанолом при настройке стереотаксической рамы. Настройка клетки восстановления мыши под нагревательной лампой.
  4. Проведите операцию по созданию односторонних моделей мыши с 6-OHDA.
    1. Взвесьте каждую мышь, запишите вес и вычислить количество препарата, который необходимо вводить. Каждая мышь получает 0,5 мг/кг атропина 20 мин до операции. Анестезируйте мышь 80 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина.
    2. Администрирование 0,5 мг/кг атропина путем интраперитонеальной инъекции.
    3. Анестезия мыши с 80 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазин путем интраперитонеальной инъекции 20 мин после введения атропина.
    4. Положите мышь в закрытую камеру. После 3-5 мин, мышь будет глубоко анестезируется без ответа на заднюю ногу щепотку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что мышь, получившую анестезию, будет испытывать период возбуждения.
    5. Бритье головы мыши и применять эритромицин глаз мазь на глазах мыши для защиты от развития язвы роговицы.
    6. Поместите мышь на стереотаксический аппарат. Сначала исправьте мышь резницами. Вставьте чашки уха правильно, чтобы сделать голову мыши в плоском и безопасном положении.
    7. Стерилизовать голову мыши с помощью повидона йода и изопропилового спирта. Вырежьте сагитальный разрез (1,5 см) на кожу головы скальпелем и разоблачите череп. Отрегулируйте резец и ушные прутья, чтобы уменьшить разницу в высоте между брегмой и лямбдой до менее 0,1 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: мышь bregma находится на пересечении корональных и сагиттальных швов, и лямбда находится на пересечении лямбдоид ныхидовых и сагиттальных швов.
    8. Медленно двигаться и опускать кончик иглы к bregma и относиться к bregma как нулевая точка. Переместите кончик в положение с координатами A/P 0,5 мм, М/Л -2,1 мм относительно брегмы. Удалите кончик и отметьте точку. Берр маленькое отверстие в черепе.
    9. Извлеките 2 зЛ 5 мкг/Л 6-OHDA раствор в микросиринг (Таблица материалов). Верните иглу в отмеченную точку и вставьте иглу в D/V -3,2 мм.
    10. Вводят 2 л из 5 мкг/Л 6-OHDA раствор (10 мкг общего) в размере 1 л/мин. После инъекции 6-OHDA завершена, оставьте иглу на месте еще на 5 минут. Затем медленно вводят иглу для инъекций.
    11. Закройте разрез швами и нанесите эритромицин глазную мазь на глаза мыши. Доставьте 0,5 мл солей подкожно для предотвращения обезвоживания, и применять мазь антибиотика непосредственно на зашиваев кожу.
    12. Удалите мышь из стереотаксического аппарата и поместите ее в клетку восстановления. Положите мышь обратно и позволить доступ к пище и воде, пока он не приходит в сознание. Лечить мышь с анальгетиком в питьевой воде ежедневно после операции в течение 2-3 дней, и рекомендуемая доза ибупрофена составляет 0,03 мг/г массы тела в день.
    13. Осматривайте мышь ежедневно после операции.

5. Поведенческая оценка после одностороннего 6-OHDA поражения

  1. Через две-три недели после операции, проводить поведенческую оценку для оценки симптомов PD. Взвесьте каждую мышь, запишите их вес и вычислите количество препарата, который следует вводить (0,5 мг/кг апоморфина до оценки).
  2. Администрирование 0,5 мг/кг апоморфина путем подкожной инъекции перед оценкой и поместите мышь в стеклянный цилиндр.
  3. После 5 мин периода привыкания подсчитайте количество контралатеральных и ипсилатеральных вращений относительно стороны поражения в минуту и запишите их активность с помощью видеокамеры.
  4. Мыши с контралатеральным минус ипсилатеральные вращения йgt;7 об /мин считаются успешно поражены и выбраны в качестве кандидатов для клеточных экспериментов по трансплантации. Верните мышей в жилищные клетки после 30-минутного отдыха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь были успешно поражены, 6-OHDA вводили мышь покажет большую предвзятость в повороте к контралатеральной стороне, так как агонист DA активирует сверхчувствительный denervated striatum пораженной стороны преимущественно.
  5. Проведите поведенческую оценку за неделю до и 2, 4, 6, 8, 12, 16 недель после пересадки клеток.

6. Трансплантация клеток прекурсоров DA

  1. Подготовка клеточной подвески для трансплантации. Для клеточной трансплантации, приостановить 2 х 105 DA прекурсоры, смешанные D10 и D13 DA прекурсоров в соотношении 1:7 в 4 Л 5 г L-1 глюкозы в сбалансированном растворе соли (Таблица материалов) трансплантации буфера.
  2. Выполните операцию по пересадке клеток после процедур, описанных в разделе 4.4, за исключением того, что 6-OHDA заменяется суспензией или буфером клеток-предшественников DA.
  3. Выполните поведенческую оценку 2, 4, 6, 8, 12, 16 недель после пересадки клеток прекурсоров DA после процедур, описанных в разделе 5. Подсчитайте количество апоморфина индуцированных контралатеральных вращений по отношению к стороне поражения в минуту и записывать их активность с помощью видеокамеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После трансплантации, снижение скорости контралатеральных вращений предполагает улучшение двигательной функции.
  4. В 4, 8,12, и 16 недель после пересадки клеток, наполнить мышь под глубокой анестезией с 4% параформальдегида, пока тело мыши становится жесткой и печень мыши становится бледным.
  5. Отделить мозг мыши мягко и положить мозг в 4% параформальдегида на 4 градуса Цельсия в одночасье.
  6. На второй день, положить мозг в 30% сахарозы для обезвоживания, пока мозг не опускается на дно.
  7. Нарежьте мозги толщиной 40 мкм с помощью замораживания микротома.
  8. Выполните иммуностогирование, как описано в шагах 3.4.5-3.4.12.

Результаты

Здесь мы сообщаем протокол, который охватывает различные этапы клеточной терапии iNSC-DA для лечения моделей PD. Во-первых, ПБМНК были изолированы и расширены, и перепрограммированы в iNSCs инфекцией SeV. Схематическое представление процедур с расширением PBMNC и индукцией iNSC показано на рисунке...

Обсуждение

Здесь мы представили протокол, который охватывает различные этапы iNSC-DA клеточной терапии для моделей PD. Критические аспекты этого протокола включают: (1) изоляция и расширение ПБМНК и перепрограммирование ПБМНК в iNSCs с помощью инфекции SeV, (2) дифференциация iNSCs для нейронов DA, (3) создание ?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа была поддержана следующими грантами: Проект стволовых клеток и переводов (2016YFA0101403), Национальный фонд естественных наук Китая (81661130160, 81422014, 81561138004), Пекинский муниципальный фонд естественных наук (5142005), Пекин таланты Фонда (20170000212223TD03), Поддержка проекта высокого уровня учителей в Пекинских муниципальных университетов в период 13-й пятилетний план (CIT и TCD20180333), Пекинская медицинская система высокого уровня талант премии (2015-3-063), Пекин Муниципальный фонд Комиссии по здравоохранению (PXM 2018-026283-000002), Пекин Сто, тысяча и десять тысяч талантов фонда (2018A03), Пекинское муниципальное управление больниц клинической медицины Развития специальной финансовой поддержки (YLX201706), и Королевское общество-Ньютон Расширенный стипендий (NA150482).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
15-ml conical tubeCorning430052
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145Toxic for inhalation and skin contact
24-well plateCorning3337
50-ml conical tube Corning430828
6-OHDASigma-AldrichH4381
6-well plateCorning3516
AccutaseInvitrogenA11105-01Cell dissociation reagent
ApomorphineSigma-AldrichA4393
Ascorbic acidSigma-AldrichA92902Toxic with skin contact 
B27 supplement Invitrogen17504044
BDNFPeprotech450-02Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparinBD367871
BSAyisheng36106es60Fetal bovine serum
cAMPSigma-AldrichD0627Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2ZENOAQ100mlUsed as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrateInvitrogen11905031
CHIR99021Gene Operation04-0004
CoverslipFisher25*25-2
DAPISigma-AldrichD8417-10mg
DAPTSigma-AldrichD5942
DexamethasoneSigma-AldrichD2915-100MG
DMEM-F12Gibco11330
DMEM-F12Gibco11320
Donkey serumJackson017-000-121
EPOPeprotech100-64-50UGHuman Erythropoietin
FGF8bPeprotech100-25
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02P=1.077, density gradient medium
GDNFPeprotech450-10Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAXInvitrogen21051024100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12Gibco11765-054
HBSSInvitrogen14175079Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factorMillporeLIF1010
Human recombinant SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1Peprotech100-11-100UGHuman insulin-like growth factor 
IL-3Peprotech200-03-10UGHuman interleukin 3
IMDMGibco215056-023Iscove's modified Dulbecco's medium
InsulinRoche 12585014
ITS-XInvitrogen51500-056Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacementGibco10828028Serum free basal medium
LamininRoche 11243217001
MicrosyringeHamilton7653-01
N2 supplement Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050Non-essential amino acid
NeurobasalGibco10888Basic medium
PDLSigma-AldrichP7280Poly-D-lysine
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542Gene Operation04-0010-10mgStore from light at -20?
Sendai virusLife TechnologiesMAN0009378
Sucrosebaiaoshengke
TGFβ?Peprotech100-36ETransforming growth factor  β?
TransferrinR&D Systems2914-HT-100G
Triton X 100baiaoshengkeNonionic surfactant
Trypan blueGibcoT10282
XylazineSigma-AldrichX1126

Ссылки

  1. Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, 2958-2969 (2009).
  2. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
  3. Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  6. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  7. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
  10. Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
  11. Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
  12. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  13. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  14. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  15. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  16. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
  17. Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
  18. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
  19. Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
  24. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  25. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
  26. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  27. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
  28. Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
  29. Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
  30. Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1496 OHDA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены