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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Describimos un método novedoso para generar ratones BLT dobles humanizados que cuentan con un sistema inmune humano funcional y un microbioma intestinal estable injertado similar al humano. Este protocolo se puede seguir sin necesidad de ratones libres de gérmenes o instalaciones gnotobióticas.

Resumen

Los ratones humanizados (hu-mice) que cuentan con un sistema inmunitario humano funcional han cambiado fundamentalmente el estudio de patógenos humanos y enfermedades. Se pueden utilizar para modelar enfermedades que de otro modo son difíciles o imposibles de estudiar en seres humanos u otros modelos animales. El microbioma intestinal puede tener un profundo impacto en la salud y la enfermedad humanas. Sin embargo, el microbioma intestinal murino es muy diferente al que se encuentra en los seres humanos.  Hay una necesidad de modelos preclínicos de hu-mice mejorados que tengan un microbioma intestinal humano injertado. Por lo tanto, creamos doble hu-mice que cuentan con un sistema inmunológico humano y microbioma intestinal humano estable. Cabeceo. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ratones son uno de los mejores animales para la humanización debido a su alto nivel de inmunodeficiencia. Sin embargo, los ratones NSG libres de gérmenes y varios otros modelos importantes de ratones libres de gérmenes no están disponibles comercialmente. Además, muchos entornos de investigación no tienen acceso a instalaciones gnotobióticas, y trabajar en condiciones gnotobióticas a menudo puede ser costoso y lento. Es importante destacar que los ratones libres de gérmenes tienen varias deficiencias inmunitarias que existen incluso después del injerto de microbios. Por lo tanto, desarrollamos un protocolo que no requiere animales libres de gérmenes o instalaciones gnotobióticas. Para generar ratones de doble hu, los ratones NSG fueron tratados con radiación antes de la cirugía para crear ratones de médula ósea, hígado, timo humanizados (hu-BLT). Los ratones fueron tratados con antibióticos de amplio espectro para agotar el microbioma intestinal murino preexistente. Después del tratamiento con antibióticos, los ratones recibieron trasplantes fecales con muestras de donantes humanos sanos a través de gavage oral. Los ratones de doble hu-BLT tenían perfiles únicos del gen rRNA 16S basados en la muestra de donante humano individual que fue trasplantada. Es importante destacar que el microbioma trasplantado similar al humano se mantuvo estable en los ratones de doble hu-BLT durante la duración del estudio hasta 14,5 semanas después del trasplante.

Introducción

Los ratones humanizados (hu-mice) han transformado el estudio de muchos aspectos de la salud humana y la enfermedad, incluyendo hematopoyesis, inmunidad, cáncer, enfermedad autoinmune y enfermedad infecciosa1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Estos hu-mice tienen la clara ventaja sobre otros modelos de ratón en que tienen un sistema inmunológico humano funcional y pueden ser infectados con patógenos específicos humanos. Sin embargo, la importancia del microbioma intestinal ha quedado demostrada por su papel en muchas enfermedades humanas como la obesidad, el síndrome metabólico, las enfermedades inflamatorias y el cáncer10,11,12, 13. El sistema inmunitario mucoso y el microbioma intestinal están regulados recíprocamente para mantener la homeostasis intestinal y sistémica. El sistema inmunitario está formado por antígenos presentados por el microbioma intestinal y recíprocamente el sistema inmunitario desempeña un importante papel regulador en la promoción de bacterias intestinales comensales y la eliminación de patógenos14,15, 16. Sin embargo, el microbioma intestinal de hu-mice no se ha caracterizado bien y el microbioma intestinal murino difiere sustancialmente en composición y función de los seres humanos17. Esto se debe a diferencias evolutivas, fisiológicas y anatómicas entre el intestino murino y humano, así como otros factores importantes como la dieta, que pueden influir en los resultados experimentales de los modelos18de la enfermedad de hu-mice. Por lo tanto, más allá de la clasificación del microbioma intestinal murino de hu-mice, se necesita un modelo animal con un sistema inmune humano y microbioma intestinal humano para estudiar las complejas interacciones de la enfermedad humana in vivo.

El estudio de las enfermedades humanas directamente en seres humanos es a menudo poco práctico o poco ético. Muchos modelos animales no se pueden utilizar para estudiar patógenos humanos como el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Los modelos de primates no humanos son genéticamente endogámicos, muy caros y no son susceptibles a muchos patógenos humanos. Los ratones que se han derivado como libres de gérmenes (GF) y reconstituidos con microbiomas intestinales similares al humano se han utilizado ampliamente para estudiar la salud humana y la enfermedad19,20. Sin embargo, estos animales no tienen un sistema inmunológico humano y trabajar con animales GF requiere instalaciones especializadas, procedimientos y experiencia. Por lo tanto, hay una necesidad de modelos preclínicos mejorados para estudiar la compleja relación del microbioma intestinal y el sistema inmunitario humano. Muchas cepas de ratones, como NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), no están disponibles comercialmente como GF. Los animales GF también pueden sufrir de deficiencias inmunitarias duraderas que no se invierten completamente por el injerto de microbios21. Por lo tanto, creamos un doble hu-mice con un sistema inmune humano funcional y microbioma intestinal estable similar al humano bajo condiciones específicas libres de patógenos (SPF). Para generar doble hu-mice, se realizó una cirugía en ratones NSG para crear ratones de médula ósea, hígado, timo humanizados (hu-BLT). Los ratones hu-BLT fueron tratados con antibióticos de amplio espectro y luego se les administraron trasplantes fecales con una muestra de donante humano saludable. Caracterizamos el microbioma intestinal bacteriano de 173 muestras fecales de 45 ratones dobles hu-BLT y 4 muestras de donantes fecales humanos. Los ratones de doble hu-BLT tienen perfiles únicos del gen rRNA 16S basados en la muestra de donante humano individual que se trasplanta. Es importante destacar que el microbioma trasplantado similar al humano se mantuvo estable en ratones durante la duración del estudio hasta 14,5 semanas después del trasplante. Además, los metagenomas pronosticados mostraron que los ratones de doble hu-BLT tienen diferente capacidad funcional pronosticada que los ratones de hu que es más similar a las muestras de donantes humanos.

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Protocolo

Todos los métodos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado e Investigación de Animales (IACUC) en la Universidad de Nebraska-Lincoln (UNL). La IACUC de la UNL ha aprobado dos protocolos relacionados con la generación y el uso de ratones hu-BLT, incluyendo doble hu-mice. Además, el Comité de Supervisión de la Investigación Científica (SROC) de la UNL también ha aprobado el uso de células madre embrionarias humanas y tejidos fetales, que se obtienen de los Recursos Avanzados de Biociencia para estudios de ratones humanizados (SROC-2016-1-002).

1. Alojamiento y mantenimiento de ratones

  1. Comprar ratones NSG de 6-8 semanas de edad (NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
  2. Auna los ratones en condiciones de SPF con intercambio de aire, prefiltros y filtros HEPA (0,22 m) en una habitación con temperatura, humedad y presión controladas.
    1. Casa y mantiene los ratones en jaulas de microisolator individuales autoclavedas en un sistema de rack capaz de gestionar el intercambio de aire con prefiltros y filtros HEPA (0,22 m).
  3. Realizar todos los procedimientos y manipulaciones de los ratones en una campana de humo de seguridad biológica Tipo A2 de Clase II que ha sido pretratada con 70% de etanol. Antes de trabajar en la sala de animales, ducharse y cambiarse a exfoliantes limpios, traje de tyvek, fundas de botas, gorra para el cabello, máscara facial y guantes. Use una bata de cirugía sobre el traje de tyvek durante los procedimientos quirúrgicos.
    NOTA: La descontaminación de la luz ultravioleta (UV) también se prefiere antes de los procedimientos.
    1. Autoclave todos los instrumentos y reactivos si es posible y luego desinfectar antes de transferir a la campana de humos.
    2. Durante los procedimientos, retire las jaulas ventiladas individualmente de los animales del estante y desinfecte antes de transferirlas a la campana de humos.
  4. Alimentar a los ratones con una dieta irradiada y proporcionar agua autoclave. Proporcione alimentos irradiados ab libitum y complemente con alimentos irradiados adicionales según sea necesario. Cambie el agua autoclave semanalmente o según sea necesario.
    NOTA: También se puede utilizar agua acidificada autoclave. La dieta irradiada proporcionada tuvo una vida útil de 6 meses después de la fabricación.

2. Generación de ratones BLT humanizados

NOTA: La generación de ratones hu-BLT se ha descrito anteriormente22,23,24.

  1. El día de la cirugía, dar a los ratones irradiación de todo el cuerpo a una dosis de 12 cGy/g de peso corporal.
  2. Prepare a los ratones para la cirugía.
    1. Dar a cada ratón irradiado una mezcla de ketamina a la concentración de trabajo de 100 mg/kg y xilazina a la concentración de 12 mg/kg, que osciló entre 130-170 l por ratón en función del peso corporal mediante inyección intraperitoneal (IP) para anestesia. Para preparar 3 ml de la mezcla de ketamina y xilazina, añadir 0,27 ml de ketamina a la concentración de stock de 100 mg/ml y 0,03 ml de xilazina a la concentración de 100 mg/ml a 2,7 ml de solución salina estéril y mezclar bien. Desinfectar la piel con 70% isopropanol antes de la inyección.
    2. Dar a cada ratón irradiado Buprenorfina 1 mg/kg de peso corporal (media vida 72 h, SR-LAB) mediante inyección subcutánea para el manejo del dolor de larga duración.
    3. Entregar a cada ratón irradiado 100 l (858 g) de Cefazolin mediante inyección de IP para la profilaxis antibiótica preoperatoria.
    4. Afeitar el cabello de los ratones usando cortapelos eléctricos alrededor del lado lateral izquierdo y medial del ratón en el sitio quirúrgico posterior utilizado para exponer el riñón izquierdo.
    5. Verifique el nivel adecuado de anestesia por reflejo de pedal (pellizco firme del dedo del pecho).
    6. Dar gas isoflurano al 3-5% si se necesita anestesia adicional en cualquier momento durante la cirugía.
    7. Aplique pomada oftálmica en ambos ojos para prevenir la desecación corneal. Aplique la etiqueta de la oreja si es necesario.
  3. Realice una cirugía para implantar los tejidos hepáticos y del timo en la cápsula renal izquierda.
    1. Desinfectar la piel en el sitio quirúrgico mediante la aplicación de exfoliación de yodo a partir del centro del sitio quirúrgico y moverse hacia el exterior de una manera circular. Repita este proceso con 70% isopropanol y una tercera vez con yodo.
    2. Usando fórceps, primero cargue un fragmento de tejido hepático fetal humano en un trocar. Luego, usando fórceps, cargue un fragmento de tejido del timo fetal humano en el trocar. Luego, usando fórceps, cargue otro fragmento de tejido hepático fetal humano en el trocar. Los tejidos deben cortarse a 1-1,6 mm3 para adaptarse a las dimensiones internas del trocar.
    3. Usa fórceps para levantar la piel y tijeras para hacer un corte pequeño longitudinalmente. Extienda el corte a 1,5-2 cm en el lado izquierdo del ratón.
    4. Usa fórceps para levantar la capa muscular y tijeras para hacer un pequeño corte longitudinalmente. Extienda el corte según sea necesario para exponer el riñón.
    5. Exponga el riñón agarrando suavemente el tejido graso que rodea el riñón. No toque directamente el parénquima renal.
    6. Haga una incisión de 1-2 mm en el extremo posterior de la cápsula renal usando un bisturí.
    7. Inserte lentamente el trocar precargado a través de la incisión paralela al eje largo del riñón y libere los tejidos entre la cápsula renal y el riñón.
    8. Devuelva cuidadosamente el riñón y el intestino a su posición normal. Utilice suturas absorbibles 5/0 P-3 (P-13) con aguja circular de 13 mm 3/8 para cerrar la capa muscular y grapas quirúrgicas para cerrar la piel.
  4. Después de la cirugía, coloque el ratón en una jaula de microisolator autoclave limpia para su recuperación.
    1. Para minimizar la pérdida de calor durante la recuperación postquirúrgica, coloque la jaula que contiene los ratones en una almohadilla de calentamiento que esté conectada a una bomba de agua que caliente y circule el agua.
    2. Monitoree a los ratones hasta que hayan recuperado suficiente conciencia para mantener la recumbencia esternal.
  5. Dentro de las 6 h de la finalización de la cirugía, a través de la vena de cola, inyectar CD34+ células madre hematopoyéticas aisladas del tejido hepático fetal humano.
    1. Calienta a los ratones con una lámpara de calor. Desinfectar la cola con 70% de isopropanol y luego inyectar de 1,5 a 5 x 105 células madre/200 l en la vena de la cola.
    2. Detenga cualquier sangrado de la inyección y devuelva los ratones a la jaula del microisolator y a la jaula del microisolator al estante de la jaula.
      NOTA: Los ratones post-cirugía suelen estar alojados juntos, cinco por jaula de microisolator, durante y después de la recuperación. Sin embargo, los ratones solo se alojan juntos si todos recibieron cirugía el mismo día.
  6. Revisa los ratones todos los días. Supervise cuidadosamente las grapas quirúrgicas y reemplácelas según sea necesario. Controle de cerca a los ratones en busca de cualquier signo de infección o malestar. Suministre alimentos autoclavedos en el suelo de la jaula del microisolator durante unos días después de la cirugía.
  7. Retire las grapas quirúrgicas 7-10 días después de la cirugía. Dar gas isoflurano al 3-5% para anestesiar a los ratones. Retire cuidadosamente las grapas y luego aplique antibióticos y pomada para aliviar el dolor en el sitio.
  8. Permita 9-12 semanas para la reconstitución de las células inmunitarias humanas, luego recoja sangre periférica de la vena safenosa medial de cada uno de los ratones humanizados.
    1. Sujete a los ratones conscientes usando un sistema de cono de plástico de tamaño adecuado con una abertura cerca de la cabeza del ratón para respirar y una abertura cerca de la parte posterior del ratón para aislar una pierna. Coloque primero los ratones en la cabeza del cono de sujeción y luego tire suavemente de una pierna a través de la abertura de la pierna.
    2. Rocíe el lado medial de la pierna aislada con 70% de isopropanol, luego propague antibióticos y pomada para aliviar el dolor en el mismo sitio.
      NOTA: La pomada ayuda a revelar la ubicación de la vena sin necesidad de depilación y también ayuda en la formación de gotas de sangre.
    3. Usando una aguja de calibre 25 en un ángulo de 90o, perforar la vena y recoger 50-100 l de sangre usando un tubo de recolección de sangre recubierto con EDTA. Detenga el sangrado aplicando presión en el sitio con gasa estéril. Una vez que el sangrado se haya detenido, devuelva a los ratones a su jaula.
      NOTA: Los volúmenes máximos de sangre recogidos suelen ser de 50 ml por semana o de 100 litros cada dos semanas.
    4. Utilice la sangre periférica recogida para analizar el nivel de reconstitución de células inmunitarias humanas utilizando citometría de flujo con anticuerpos para hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.

3. Tratamiento antibiótico

  1. Antes del tratamiento con antibióticos, recoja muestras fecales previas al tratamiento. Mueva los ratones a una nueva jaula de microisolator autoclave.
  2. Prepare un cóctel fresco de antibióticos de amplio espectro todos los días.
    1. Preparar 250 ml de agua que contenga Metronidazol recién preparado (1 g/L), Neomicina (1 g/L), Vancomicina (0,5 g/L) y Ampicilina (1 g/L) para cada jaula de microisolator de ratones.
      NOTA: Utilice agua autoclave o estéril para el agua potable suplementada con antibióticos.
    2. Añadir 9,2 g de mezcla de bebida endulzada con azúcar de uva a 250 ml de agua suplementada con antibióticos.
      NOTA: El uso de la mezcla de bebidas edulcoradas de azúcar de uva enmascara el sabor amargo de los antibióticos y ayuda a prevenir la deshidratación en ratones.
    3. Cambiar el antibiótico y azúcar de uva mezcla de bebida endulzada agua suplementada y colocar los ratones en una nueva jaula autoclaved todos los días.
      NOTA: Los ratones son coprofágicos y cambiar las jaulas diariamente evita que los ratones se vuelvan a inocular con bacterias intestinales.
    4. Para el injerto máximo del microbioma intestinal similar al humano, proporcione antibióticos durante 14 días. Durante el tratamiento con antibióticos, monitoriza a los ratones para ver si hay pérdida de peso y deshidratación. Se espera pérdida de peso durante los primeros 3-4 días y mesetas después de eso durante la duración del tratamiento. Si se produce deshidratación, administrar a los ratones solución salina o ringers a través de inyección intraperitoneal.
      NOTA: Otros protocolos de humanización del microbioma intestinal requieren gavage oral de antibióticos. Si bien es eficaz para agotar las bacterias intestinales murinas, encontramos que el método menos invasivo de agregar antibióticos al agua potable puso menos estrés en nuestros ratones humanizados y condujo a mejores resultados.

4. Muestras de donantes y trasplante fecal

  1. Preparar muestras fecales de donantes humanos.
    1. Utilizar fuentes adecuadamente preparadas de material de trasplante de microbiota fecal (FMT) para el trasplante fecal en ratones humanizados.
    2. Descongelar las preparaciones de FMT y alícuotas en condiciones anaeróbicas en una cámara anaeróbica.
    3. Si se desea, en este paso mezcle partes iguales de las muestras fecales para crear una muestra "humana" imparcial.
    4. Mantenga la congelación y descongelación del material FMT al mínimo, si no es necesario alícuota o mezcla de muestras, sólo descongelar inmediatamente antes del procedimiento.
  2. Trasplante fecal humano
    1. Después de completar 14 días de tratamiento antibiótico, cambie el agua potable a agua autoclave y mueva a los ratones a una nueva jaula autoclave. Detenga los cambios diarios de jaula e implemente un horario de cambio de jaula una vez cada 1-2 semanas.
    2. Dar dos trasplantes fecales a 24 y 48 h después del cese de antibióticos.
    3. 24 h después del tratamiento con antibióticos, descongelar la cantidad necesaria de material FMT, dar a cada ratón 200 l de material FMT a través de gavage oral. Repita el procedimiento de nuevo a las 48 h después de los antibióticos.
    4. Extienda cualquier material FMT descongelar restante o sobrante en el pelaje de los ratones humanizados o en la ropa de cama de la jaula.

5. Recogida de muestras fecales frescas

  1. Autoclave bolsas de papel individuales antes de transferir a la campana de humos.
  2. En la campana de humos, coloque un ratón en cada bolsa de papel individual y permita que el ratón defeque.
  3. Con fórceps estériles, recoja la muestra fecal en tubos de plástico de 1,5 ml y congele a -80 oC. Devuelva a los ratones a las jaulas de microisolator.
    NOTA: Este método de recolección de muestras fecales permite la recolección de muestras fecales frescas de ratones individuales sin manipulaciones que induzcan estrés.

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Resultados

La Figura 1 muestra un esquema de los métodos utilizados para crear ratones de doble hu-BLT y describe brevemente el proceso de agregar un sistema inmune humano funcional y un microbioma intestinal estable similar al humano a los ratones NSG. La Figura 2 muestra un ejemplo de análisis de citometría de flujo de sangre periférica de un ratón BLT humanizado 10 semanas después de la cirugía. La Figura 3 muestra la abundancia rela...

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Discusión

El protocolo descrito aquí es para la creación de ratones de doble hu-BLT que cuentan con un sistema inmune humano funcional y un microbioma intestinal humano estable. Este protocolo se puede adaptar a otros modelos de ratones humanizados o no humanizados sin necesidad de animales GF e instalaciones gnotobióticas. Si bien los métodos descritos aquí son relativamente simples, hay varios detalles críticos que son importantes para la creación exitosa de ratones de doble hu-BLT. Los ratones NSG son extremadamente inmu...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Yanmin Wan, Guobin Kang y Pallabi Kundu por su ayuda en la generación de ratones humanizados BLT. Nos gustaría reconocer el Fondo de Genómica de la UNMC que recibe apoyo parcial de la Red de Investigación de Nebraska en Genómica Funcional NE-INBRE P20GM103427-14, La Biología Molecular de Sistemas Neurosensoriales CoBRE P30GM110768, The Fred & Pamela Buffett Cancer Center - P30CA036727, The Center for Root and Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, y la Iniciativa de Investigación de Nebraska. Nos gustaría agradecer a la Universidad de Nebraska - Lincoln Life Sciences Annex y a su personal por su asistencia. Este estudio es apoyado en parte por el InstitutoNacional de Salud (NIH) Becas R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI111862 to Q Li.  Los funderos no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la preparación del manuscrito o la decisión de publicación.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Animal Feeding Needles 18GCadence Science9928B
Clidox-s ActivatorPharmacal Research Laboratories95120F
Clidox-s BasePharmacal Research Laboratories96125F
DGM 108 cage rackTechniplast
Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L Grainger12R063
FMT Upper Delivery Microbiota Preparations OpenBiomeFMP30
Grape Kool-AidKraft Foods Inc.
hCD19-PE/Cy5Biolegend302209
hCD3-PEBiolegend300408
hCD4-Alexa 700Biolegend300526
hCD45-FITCBiolegend304006
hCD8-APC/Cy7Biolegend301016
Lactate Buffered Ringer's SolutionBoston BioProducts Inc PY-906-500 
mCD45-APCBiolegend103111
Microvette 100 K3EMicrovette20.1278.100
Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving OintmentNeosporin
NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)The Jackson Laboratory005557
PrecisionGlide 25 G NeedleBD305127
RS200 X-ray irradiatorRAD Source Technologies
Sealsafe Plus GM500 microisolator cagesTechniplast
Sterile Non-woven GauzeFisherbrand22-028-558
Teklad global 16% protein irradiated mouse chowTeklad2916

Referencias

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