Evaluación de la prehensión habilidosa en ratones mediante un auto-entrenador

Resumen

El método para evaluar el impacto de la formación en las habilidades motoras es una herramienta útil. Desafortunadamente, la mayoría de las evaluaciones conductuales pueden ser intensivas en mano de obra y/o costosas. Aquí describimos un método robótico para evaluar la habilidad de la prehensión (alcance a agarrar) en ratones.

Resumen

Describimos un método para introducir ratones ingenuos en una nueva tarea de prehensión (alcance a alcance). Los ratones se alojan solos en jaulas con una ranura frontal que permite al ratón salir de su jaula y recuperar pellets de comida. Se emplea una restricción alimentaria mínima para alentar a los ratones a realizar la recuperación de alimentos de la ranura. A medida que los ratones comienzan a asociarse llegando a la ranura para la comida, los pellets se retiran manualmente para estimular la extensión y pronación de su pata para agarrar y recuperar el pellet a través de la ranura frontal. Cuando los ratones comienzan a alcanzar los pellets a medida que llegan a la ranura, el ensayo conductual se puede realizar midiendo la velocidad a la que agarran y recuperan con éxito el pellet deseado. A continuación, se introducen en un auto-entrenador que automatiza tanto el proceso de proporcionar pellets de alimentos para que el ratón pueda agarrar, como la grabación de intentos exitosos y fallidos de alcanzar y agarrar. Esto permite la recopilación de datos de alcance para varios ratones con un esfuerzo mínimo, que se utilizará en el análisis experimental según corresponda.

Introducción

Los métodos para probar experimentalmente una lesión motora antes y después de neurológica, así como para modular el tiempo, la cantidad y el tipo de entrenamiento motor son importantes para la investigación traslacional. En la última década, los ratones, debido a la facilidad de la manipulación genética, se han convertido en un sistema modelo popular en el que esclarecer los mecanismos del aprendizaje motor antes y después de las lesiones. Sin embargo, los ensayos conductuales en ratones no se han optimizado de la misma manera que tales ensayos han sido para otros mamíferos (especialmente ratas). Además, hay diferencias importantes entre el comportamiento de un ratón y una rata que sugieren fuertemente entrenar a las dos especies de diferentes maneras^1,2.

Los movimientos prensales calificados utilizan una mano/pata para colocar alimentos en la boca, manipular un objeto o utilizar una herramienta. De hecho, llegar a captar diversos objetos en la vida diaria es una función fundamental de las extremidades superiores y el acto de alcance a comer es una forma de prehensión que muchos mamíferos utilizan. Muchos de los cambios genéticos, fisiológicos y anatómicos que sustentan la adquisición de habilidades prensiles han sido bien definidos en el campo³. Al traducir los hallazgos preclínicos a los resultados clínicos, se necesita una prueba relevante que sea eficiente y reproducible. Los estudios de alcance de roedores y humanos demuestran que el comportamiento de la prehensión es similar en humanos y en animales^4. En consecuencia, estas similitudes sugieren que las pruebas de prension pueden servir como modelo traslacional para investigar el aprendizaje motor, así como impedimentos y tratamientos de enfermedades humanas. Por lo tanto, la evaluación de la prehensión en ratones puede ofrecer una poderosa herramienta en la investigación traslacional que estudia los estados de salud y enfermedad⁴.

Desafortunadamente, la tarea de prehensión en ratones, incluso para un entorno de laboratorio a pequeña escala, puede ser laboriosa y llevar mucho tiempo. Para aliviar este problema, aquí se describe una versión automatizada de la tarea de prehensión. La tarea descrita requiere que los ratones extiendan una sola pata a través de la ranura frontal de la jaula doméstica del ratón, pronifen la pata extendida, agarren la recompensa de pellets de alimentos y tiren del pellet de vuelta al interior de la jaula para su consumo. Los datos resultantes se presentan como un éxito de prehensión o un error. Esta automatización registra con éxito los datos y reduce la carga y el tiempo con que los investigadores deben participar en la tarea.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por la ACUC (Comité de Cuidado y Uso de Animales) de la Universidad Johns Hopkins.

1. Preparación de jaulas de ratón para su uso

1. Cree una abertura ranurada con dimensiones de 0,8 cm de ancho y 7 cm de altura desde la base en el extremo frontal de cada jaula, como se ilustra en la Figura 1. Esta ranura sirve como la abertura a través de la cual el animal alcanzará.
   NOTA: El auto-entrenador fue diseñado para su uso con las dimensiones estándar de la jaula del ratón (como se muestra en la Figura 1) suministradas por la mayoría de los proveedores de suministros de investigación animal. Además, el auto-entrenador soportará fácilmente otros tipos de jaulas.
2. Dentro de cada jaula individual, agregue una plataforma adyacente a la ranura para permitir que los ratones se pongan de pie y alcancen los pellets presentados. Asegúrese de que la plataforma se encuentra por encima del suelo de la camada de la jaula, aproximadamente 3 cm de altura. Utilice platos Petri fijados con superpegamento y tapados por una hoja de metal de aproximadamente 10 cm x 15 cm, sin embargo, cualquier superficie plana lo suficientemente grande como para que un ratón se ponga de pie para alcanzar desde será suficiente.
3. Crear una muesca vertical a través de la mitad de la parte delantera de la jaula que mide 0,8 cm de ancho y 7 cm de alto que permitirá a un ratón alcanzar su pata fuera de la jaula.
4. A partir de una fina lámina de metal, (aproximadamente 2 mm de espesor) cortar una puerta de jaula en rectángulos que miden 5 cm x 10 cm para servir como una abertura uniforme a través de la cual el animal debe alcanzar.
   NOTA: Los ratones pueden masticar jaulas de plástico que cambiarían el tamaño de la abertura. El ratón alcanzará a través de esta ranura de 0,8 cm cuando la puerta de la jaula metálica se coloca sobre la abertura ranurada de la jaula durante las pruebas con cinta adhesiva, manteniendo el ancho efectivo de la ranura entre jaulas.
5. Cubra la ranura de cada jaula con cinta adhesiva cuando su ratón no esté siendo probado para evitar que la basura sea expulsada de la jaula.

2. Introducción de ratones al movimiento de alcance

1. Registre el peso inicial de cada ratón y calcule el 85% de ese valor para encontrar su peso objetivo, redondeando hasta 20 g si el resultado es menor. Dales un régimen de alimentación para llevarlos y luego mantener este peso objetivo.
   1. Dar a cada ratón 2,5 g de pellets el primer día y anotar cualquier cambio en su peso 24 h más tarde.
      NOTA: Pese los ratones una vez al día y espere una caída de peso de 0,25-1 g por día.
   2. Cambie la alimentación diaria de cada ratón según sea necesario, basándose en este cambio inicial y los cambios continuos en el peso de cada ratón, con el fin de inducir la pérdida gradual de peso (menos de 0,8 g perdidos por día) y luego mantener el peso objetivo resultante. Variar entre tres a seis 500 mg de pellets (1,5 a 3,0 g) por día para ser eficaz.
      NOTA: Los ratones permanecen en esta dieta para mantener su peso objetivo a lo largo del protocolo.
2. Cuando un ratón ha alcanzado su peso objetivo, introducir cada ratón en el concepto de subir a la ranura cerrada para un pellet de alimentos suplementario. Comience una sesión de entrenamiento colocando un pellet de 45 mg en la superficie del pellet, directamente delante de la ranura, y permita que cada ratón lo recupere. La mayoría de los ratones tomarán a este arreglo de alimentación dentro de 1-2 días.
3. Una vez que el ratón asocia una ranura abierta con ser alimentado, anímelos a alcanzar con una pata, en lugar de la boca.
   NOTA: Este es el paso más complejo, tomar 1-2 días, e inculcar un comportamiento contraproducente en ratones por error es muy fácil; consulte la sección de discusión para obtener más información y asesoramiento.
   1. Usando un par de pinzas, sostenga un pellet en la misma posición en la que el ratón ha recuperado pellets previamente. A medida que el ratón comienza a morder el pellet, tire de él aproximadamente medio centímetro de tal forma que el pellet esté fuera del alcance de su boca.
      NOTA: Un ratón en su peso objetivo intentará recuperar el pellet fuera de alcance. Cada vez que el ratón extiende una pata a través de la ranura, reforzar ese comportamiento permitiendo que se coma el pellet. Algunos ratones pueden exhibir una preferencia por una pata sobre la otra cuando se extienden para alimentos.
   2. Aunque no es instrumental para la experimentación, registre si se prefiere la pata izquierda o derecha. Esto puede permitir potencialmente mayores tasas de éxito general en el ensayo conductual; alternativamente, elimine una variable forzando a cada ratón a alcanzar con la misma pata.
      NOTA: Se obtienen mejores resultados si los ratones utilizan su pata preferida.
   3. A medida que cada ratón se asocia extendiendo una pata con comer un pellet, reforzar aún más ese comportamiento mediante la retención del pellet en respuesta a los intentos de recuperar el pellet con la boca y la lengua. Los ratones comenzarán a cumplir con este acuerdo durante 2 a 3 días.
   4. Finalizar la introducción del comportamiento deseado de alcance de la pata colocando el pellet de 45 mg justo por debajo de 1 cm del borde exterior de la puerta de la jaula, de tal manera que el punto más a la izquierda o a la derecha del pellet (ya sea a la derecha o a la izquierda de la ranura de la jaula del investigador 's perspective, respectivamente) es tangente a una línea que se extiende directamente desde el borde de la ranura de la puerta de la jaula. Permita que el ratón intente recuperar el pellet, estando vigilante para eliminar el pellet y evitar su consumo si el ratón debe intentar por algún otro método que la extensión de la pata.
      NOTA: Cuando un ratón extiende constantemente una pata para agarrar y es capaz de tocar el pellet proporcionado, está listo para la prueba usando el auto-entrenador descrito a continuación y el ensayo de comportamiento asociado. El tiempo desde las introducciones ingenuas hasta la preparación variará entre ratones; si hay rezagados que tardan más de dos semanas en entenderse, deben excluirse del conjunto de datos.

3. Uso del auto-entrenador

NOTA: Consulte la Figura 1-3 y la sección de discusión para obtener una descripción completa del hardware, el software y las acciones físicas del auto-entrenador.

1. Prepárese para la sesión de entrenamiento.
   1. Calibrar el sensor de pellets de cebo. Haga clic en la flecha Ejecutar en la interfaz LabVIEW y observe el sensor de pellets de cebo leyendo tanto con y sin un pellet en su lugar. Haga clic en el botón Detener para detener esta ejecución de prueba y cambie el objetivo del sensor de pellets de cebo a un valor entre esas dos lecturas(Figura 3 y Tabla 2). La mayoría de las condiciones de iluminación proporcionan una lectura entre 1 y 4.
   2. Coloque la jaula del ratón modificada en el auto-entrenador(Figura 2). Fije la puerta de la jaula (Figura 1)y alinee el pellet al borde de la ranura como en el procedimiento manual.
2. Ejecute la sesión de entrenamiento del ratón mediante la interfaz LabVIEW.
   1. Introduzca la información necesaria para registrar datos sobre la sesión de entrenamiento(Figura 3 y Tabla 2).
      1. Haga clic en el campo ID del ratón y escriba el nombre de archivo de cada sesión de entrenamiento con el teclado del equipo.
      2. Haga clic en el campo Total de pellets para dispensar durante la rutina para controlar cuántos pellets se dispensan para un solo experimento (normalmente 20 - 30). Para ello, haga clic en las flechas arriba y abajo o introduzca el número con el teclado del ordenador.
      3. Haga clic en el campo Pausar después del número de pellet para establecer una pausa de 5 s después de eliminar el pellet indicado de la tabla de buceo. Para ello, haga clic en las flechas arriba y abajo o introduzca el número con el teclado del ordenador.
      4. Haga clic en el campo Longitud de pausa para establecer una pausa entre el momento en que se retira un pellet de la tabla de buceo y el momento en que se dispensa un nuevo pellet. Para ello, haga clic en las flechas arriba y abajo o introduzca el número con el teclado del ordenador
         NOTA: Por lo general, 1 s es un tiempo de pausa adecuado. Si los ratones están ansiosos después de dispensar cada pellet, es aconsejable aumentar la longitud de la pausa utilizando el campo Longitud de pausa a 5 s.
      5. Registre manualmente la distancia a la que se coloca el pellet en el campo Distancia de alcance. Para ello, haga clic en las flechas arriba y abajo o introduzca el número con el teclado del ordenador
         NOTA: El tamaño de las matrices de aceleración y tiempo se expone con fines de depuración y puede omitirse.
      6. Haga clic en el campo Carpeta para contener registros para seleccionar la ubicación del archivo para guardar los datos recopilados.
      7. Una vez rellenados los campos de información, haga clic en el botón Ejecutar para comenzar la sesión de entrenamiento. El auto-entrenador dispensará pellets individuales y rastreará si caen a través del embudo hasta que el número total de pellets haya sido dispensado, y el último pellet haya sido recuperado o dejado caer por el ratón. El programa se detendrá automáticamente en este punto. Si es necesario, también se puede detener prematuramente haciendo clic en el botón Detener.
   2. Una vez configurado el software, coloque la jaula de inicio del ratón para ser probado en el pedestal y observe el ratón para que pueda medir si el ratón realmente ha aprendido a intentar el comportamiento de alcance novedoso requerido. Después de hacer clic en el botón Ejecutar, permita que el ratón investigue la ranura y su nuevo entorno desconocido.
      NOTA: De forma similar a cuando se introducen ratones en el concepto de alcanzar, esperar que algunos ratones sean más compatibles que otros. Los ratones que han captado el concepto deben tratar de alcanzar dentro de 5-10 min y asociarán el movimiento del auto-entrenador con el pellet presentado, como cuando asocian una ranura descubierta con alimentos en las etapas iniciales de este protocolo.

Resultados

En general, se recomienda que cada sesión de entrenamiento consista en aproximadamente 20-30 pruebas, que pueden ser establecidas por el usuario, se ejecutan automáticamente por el auto-entrenador y se guardan en un único archivo de registro por sesión y ratón. Cada prueba se puede ejecutar consecutivamente, justo después de la otra, con 2-5 s de pausa. Los ratones entrenados en el auto-entrenador exhiben un aumento en la habilidad en 10 sesiones de entrenamiento.

Discusión

Nuestro auto-entrenador evalúa el alcance de las extremidades delanteras (prehensión) de forma automatizada. Para lograr este punto final, muchos de los parámetros diseñados para la tarea de prehensión del ratón, incluyendo la colocación de pellets, el tamaño del pellet y los criterios de entrenamiento, han sido iterados a lo largo de varios años y adaptados de protocolos anteriores^{2,5 ,6}. El avance aquí es la automat...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABS Filament	Custom 3D Printed	N/A	utilized for pellet holder, frame, arm and funnel
ABS Sheet	McMaster-Carr	8586K581	3/8" thickness; used for platform compononents, positioning stand guides and base
Adruino Mini	Adruino	A000087	nano version also compatiable as well as other similar microcontrollers
Bench-Top Adjustable-Height Positioning Stand	McMaster-Carr	9967T43	35 lbs. load capacity
Clear Acrylic Round Tube	McMaster-Carr	8532K14	ID 3/8"
Low-Carbon Steel Wire	McMaster-Carr	8855K14	0.148" diameter
Pellet Dispenser	Lafayette Instrument: Neuroscience	80209-45	with 45 mg interchangeable pellet size wheel and optional stand
Photointerrupter Breakout Board	SparkFun	BOB-09322 ROHS	designed for Sharp GP1A57HRJ00F
Reflective Object Sensor	Fairchild Semiconductor	QRD1113	phototransistor output
Servo Motor	SparkFun	S8213	generic metal gear (micro size)
Transmissive Photointerrupter	Sharp	GP1A57HRJ00F	gap: 10 mm, slit: 1.8 mm