Bewertung der geschickten Vorhension bei Mäusen mit einem Auto-Trainer

Zusammenfassung

Die Methode zur Bewertung der Auswirkungen der Ausbildung auf die motorischen Fähigkeiten ist ein nützliches Instrument. Leider können die meisten Verhaltensbeurteilungen arbeitsintensiv und/oder teuer sein. Wir beschreiben hier eine Robotik-Methode zur Beurteilung von Prehension (Reach-to-Grasp) Fähigkeiten bei Mäusen.

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode, um naive Mäuse in eine neuartige Vorhensionsaufgabe (Reach-to-Grasp) einzuführen. Mäuse sind singart in Käfigen mit einem frontalen Schlitz untergebracht, der es der Maus ermöglicht, aus ihrem Käfig zu greifen und Futterpellets zu holen. Minimale Nahrungsbeschränkung wird angewendet, um die Mäuse zu ermutigen, die Nahrungsentnahme aus dem Schlitz durchzuführen. Als die Mäuse beginnen, sich mit dem Kommen zum Schlitz für Nahrung zu verbinden, werden die Pellets manuell weggezogen, um die Verlängerung und Pronation ihrer Pfote zu stimulieren, um das Pellet zu greifen und durch den frontalen Schlitz zu holen. Wenn die Mäuse beginnen, nach den Pellets zu greifen, wenn sie am Schlitz ankommen, kann der Verhaltenstest durchgeführt werden, indem die Rate gemessen wird, mit der sie das gewünschte Pellet erfolgreich erfassen und abrufen. Sie werden dann einem Auto-Trainer vorgestellt, der sowohl den Prozess der Bereitstellung von Futterpellets für die Maus zum Greifen automatisiert, als auch die Aufzeichnung erfolgreicher und fehlgeschlagener Reichweiten- und Greifversuche. Dies ermöglicht die Erfassung von Erreichensdaten für mehrere Mäuse mit minimalem Aufwand, die gegebenenfalls in der experimentellen Analyse verwendet werden können.

Einleitung

Methoden zur experimentellen Prüfung einer motorischen Fähigkeiten vor und nach der neurologischen Verletzung sowie modulationen Timing, Menge und Art des motorischen Trainings sind wichtig für die translationale Forschung. In den letzten zehn Jahren sind Mäuse aufgrund der damit verbundenen Leichtigkeit der genetischen Manipulation zu einem beliebten Modellsystem geworden, in dem die Mechanismen des motorischen Lernens vor und nach der Verletzung aufgeklärt werden können. Verhaltenstests bei Mäusen wurden jedoch nicht in der gleichen Weise optimiert, wie es bei anderen Säugetieren (insbesondere Ratten) der Fall war. Darüber hinaus gibt es wichtige Unterschiede zwischen dem Verhalten einer Maus und einer Ratte, die stark darauf hindeuten, die beiden Arten in verschiedenen Weisen zu trainieren^1,2.

Geschickte prehensile Bewegungen verwenden eine Hand / Pfote, um Nahrung in den Mund zu legen, ein Objekt zu manipulieren, oder ein Werkzeug zu verwenden. Tatsächlich ist das Erreichen verschiedener Objekte im täglichen Leben eine grundlegende Funktion der oberen Gliedmaßen und die Reichweite-zu-Essen-Akt ist eine Form der Vorhension, die viele Säugetiere verwenden. Viele der genetischen, physiologischen und anatomischen Veränderungen, die dem Erwerb von prehensile Fähigkeiten zugrunde liegen, wurden im Feld³gut definiert. Bei der Übersetzung präklinischer Befunde in klinische Ergebnisse braucht man einen relevanten Test, der effizient und reproduzierbar ist. Studien an Nagetieren und Menschen zeigen, dass das Verhalten der Vorhension beim Menschen und bei Tieren ähnlich ist⁴. Dementsprechend deuten diese Ähnlichkeiten darauf hin, dass Prehension-Tests als translationsmodell für die Untersuchung des motorischen Lernens sowie von Beeinträchtigungen und Behandlungen menschlicher Krankheiten dienen können. Daher kann die Bewertung der Vorhension bei Mäusen ein leistungsfähiges Werkzeug in der translationalen Forschung bieten, das sowohl Gesundheit als auch Krankheitszustände untersucht⁴.

Leider kann die Vorarbeit bei Mäusen, auch für eine kleine Laborumgebung, mühsam und zeitaufwändig sein. Um dieses Problem zu lindern, beschreiben wir hier eine automatisierte Version der Prehension-Aufgabe. Die beschriebene Aufgabe erfordert, dass Mäuse eine einzelne Pfote durch den Frontalschlitz des Heimkäfigs der Maus ausdehnen, die verlängerte Pfote pronieren, die Belohnung für das Futterpellet erfassen und das Pellet zum Verzehr zurück ins Käfiginnere ziehen. Die resultierenden Daten werden entweder als Prehension-Erfolg oder -Fehler dargestellt. Diese Automatisierung zeichnet die Daten erfolgreich auf und reduziert den Aufwand und die Zeit, mit der sich die Forscher mit der Aufgabe auseinandersetzen müssen.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom ACUC (Animal Care and Use Committee) der Johns Hopkins University genehmigt.

1. Vorbereiten von Mauskäfigen für den Einsatz

1. Erstellen Sie eine Schlitzöffnung mit Abmessungen von 0,8 cm Breite und 7 cm Höhe von der Basis am vorderen Ende jedes Käfigs, wie in Abbildung 1dargestellt. Dieser Schlitz dient als Öffnung, durch die das Tier erreicht wird.
   HINWEIS: Der Auto-Trainer wurde für den Einsatz mit den Standard-Mauskäfigabmessungen (siehe Abbildung 1) entwickelt, die von den meisten Tierforschungsanbietern geliefert werden. Darüber hinaus unterstützt der Auto-Trainer problemlos andere Käfigtypen.
2. In jedem einzelnen Käfig fügen Sie eine Plattform neben dem Schlitz hinzu, damit die Mäuse stehen und die vorgestellten Pellets erreichen können. Stellen Sie sicher, dass sich die Plattform über dem ca. 3 cm hohen Käfigabfallboden befindet. Verwenden Sie Petri-Gerichte mit Superkleber befestigt und von einem Blech ca. 10 cm x 15 cm gekrönt, aber jede flache Oberfläche groß genug für eine Maus zu stehen, um von zu erreichen genügt.
3. Erstellen Sie eine vertikale Kerbe durch die Mitte der Vorderseite des Käfigs, die 0,8 cm breit und 7 cm hoch ist, so dass eine Maus seine Pfote aus dem Käfig heraus erreichen kann.
4. Aus einem dünnen Blech (ca. 2 mm dick) wird ein Käfigtor in Rechtecke von 5 cm x 10 cm geschnitten, um als gleichmäßige Öffnung zu dienen, durch die das Tier zu erreichen ist.
   HINWEIS: Mäuse können auf Plastikkäfigen kauen, was die Größe der Öffnung ändern würde. Die Maus wird durch diesen 0,8 cm Schlitz gelangen, wenn das metallische Käfigtor während des Testens mit Klebeband über die geschlitzte Öffnung des Käfigs gelegt wird, wobei die effektive Breite des Schlitzes zwischen den Käfigen erhalten bleibt.
5. Bedecken Sie den Steckplatz jedes Käfigs mit Klebeband, wenn seine Maus nicht getestet wird, um zu verhindern, dass Abfälle aus dem Käfig vertrieben werden.

2. Einführung von Mäusen in die erreichende Bewegung

1. Zeichnen Sie das Startgewicht jeder Maus auf und berechnen Sie 85 % dieses Wertes, um ihr Zielgewicht zu finden, wobei sie bis zu 20 g aufrunden, wenn das Ergebnis geringer ist. Geben Sie ihnen ein Fütterungsregime, um sie zu bringen und dann dieses Zielgewicht zu halten.
   1. Geben Sie jeder Maus 2,5 g Pellets am ersten Tag und notieren Sie jede Änderung ihres Gewichts 24 h später.
      HINWEIS: Wiegen Sie die Mäuse einmal pro Tag und erwarten Sie einen Gewichtsabfall von 0,25-1 g pro Tag.
   2. Ändern Sie den täglichen Feed jeder Maus nach Bedarf, basierend auf dieser anfänglichen Änderung und laufenden Änderungen im Gewicht jeder Maus, um eine allmähliche Gewichtsabnahme (weniger als 0,8 g Verlust pro Tag) zu induzieren und dann das resultierende Zielgewicht beizubehalten. Variieren Sie zwischen drei bis sechs 500 mg Pellets (1,5 bis 3,0 g) pro Tag, um wirksam zu sein.
      HINWEIS: Mäuse bleiben auf dieser Diät, um ihr Zielgewicht während des gesamten Protokolls zu halten.
2. Wenn eine Maus ihr Zielgewicht erreicht hat, stellen Sie jede Maus das Konzept vor, zum Gated-Slot für ein zusätzliches Futterpellet zu kommen. Beginnen Sie eine Trainingseinheit, indem Sie ein 45 mg Pellet auf der Pelletoberfläche direkt vor dem Schlitz platzieren und jeder Maus erlauben, es abzurufen. Die meisten Mäuse werden diese Fütterungsanordnung innerhalb von 1-2 Tagen einnehmen.
3. Sobald die Maus einen offenen Schlitz mit gefüttert assoziiert, ermutigen Sie sie, mit einer Pfote zu erreichen, anstatt mit dem Mund.
   HINWEIS: Dies ist der komplexeste Schritt, der 1-2 Tage dauert, und es ist sehr einfach, versehentlich kontraproduktives Verhalten bei Mäusen zu vermitteln; Weitere Informationen und Ratschläge finden Sie im Diskussionsbereich.
   1. Halten Sie ein Pellet mit einer Pinzette in der gleichen Position, in der die Maus zuvor Pellets abgerufen hat. Wenn die Maus beginnt, nach dem Pellet zu beißen, ziehen Sie es etwa einen halben Zentimeter weg, so dass das Pellet aprea-reichweite seines Mundes ist.
      HINWEIS: Eine Maus mit ihrem Zielgewicht versucht, das nicht in Reichweite erreichbare Pellet abzurufen. Wann immer die Maus eine Pfote durch den Schlitz ausstreckt, verstärken Sie dieses Verhalten, indem Sie ihr erlauben, das Pellet zu essen. Einige Mäuse können eine Vorliebe für eine Pfote gegenüber der anderen aufweisen, wenn sie sich für Nahrung ausdehnen.
   2. Während nicht instrumental zu experimentieren, zeichnen Sie auf, ob die linke oder rechte Pfote bevorzugt wird. Dies kann möglicherweise höhere Gesamterfolgsraten im Verhaltenstest ermöglichen; alternativ, beseitigen Sie eine Variable, indem Sie jede Maus zwingen, mit der gleichen Pfote zu erreichen.
      HINWEIS: Bessere Ergebnisse werden erzielt, wenn Mäuse ihre bevorzugte Pfote verwenden.
   3. Wenn jede Maus eine Pfote mit dem Verzehr eines Pellets verbindet, verstärken Sie dieses Verhalten weiter, indem sie das Pellet als Reaktion auf Versuche, das Pellet mit Mund und Zunge zurückzuholen, zurückhält. Mäuse werden beginnen, diese Anordnung über 2 bis 3 Tage zu erfüllen.
   4. Schlussstellen Sie die Einführung des gewünschten Pfoten-Erreichbarkeitsverhaltens, indem Sie das 45 mg-Pellet knapp 1 cm vom äußeren Rand des Käfigtores entfernt platzieren, so dass der linke oder rechte Punkt des Pellets (ob rechts oder links des Käfigschlitzes vom Prüfer) die Perspektive bzw. die Perspektive ist tangential zu einer Linie, die sich direkt vom Rand des Schlitzes des Käfigtors erstreckt. Erlauben Sie der Maus, zu versuchen, das Pellet abzurufen, wachsam zu sein, um das Pellet zu entfernen und seinen Verbrauch zu verhindern, wenn die Maus versuchen sollte, mit einer anderen Methode als Pfotenverlängerung.
      HINWEIS: Wenn eine Maus konsequent eine Pfote zum Greifen ausdehnt und in der Lage ist, das mitgelieferte Pellet zu berühren, ist sie bereit für Tests mit dem unten beschriebenen Auto-Trainer und dem zugehörigen Verhaltenstest. Die Zeit von naiven Einführungen bis hin zur Vorbereitung variiert von Mäusen; Wenn es Nachzügler gibt, die mehr als zwei Wochen brauchen, um zu verstehen, sollten sie aus dem Datensatz ausgeschlossen werden.

3. Verwenden des Auto-Trainers

HINWEIS: Siehe Abbildung 1-3 und den Diskussionsabschnitt für eine vollständige Beschreibung der Hardware, Software und der physischen Aktionen des Auto-Trainers.

1. Bereiten Sie sich auf die Trainingseinheit vor.
   1. Kalibrieren Sie den Köder-Pellet-Sensor. Klicken Sie auf den Run-Pfeil in der LabVIEW-Schnittstelle und beachten Sie den Köder-Pellet-Sensor, der sowohl mit als auch ohne Pellet an Ort und Stelle liest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Stopp, um diesen Testlauf zu beenden und das Köder-Pelletsensor-Ziel auf einen Wert zwischen diesen beiden Messwerten zu ändern (Abbildung 3 und Tabelle 2). Die meisten Lichtverhältnisse bieten einen Messwert zwischen 1 und 4.
   2. Platzieren Sie den modifizierten Mauskäfig auf dem Autotrainer (Abbildung 2). Befestigen Sie das Käfigtor ( Abbildung 1) und richten Sie das Pellet wie im manuellen Verfahren am Rand des Schlitzes aus.
2. Führen Sie die Mausschulung über die LabVIEW-Schnittstelle aus.
   1. Eingabe von Informationen, die zum Aufzeichnen von Daten über die Schulungssitzung erforderlich sind (Abbildung 3 und Tabelle 2).
      1. Klicken Sie auf das Feld Maus-ID, und geben Sie den Dateinamen jeder Trainingssitzung über die Computertastatur ein.
      2. Klicken Sie auf das Feld Gesamtpellets, um während der Routine zu verteilen, um zu steuern, wie viele Pellets für ein einzelnes Experiment abgegeben werden (normalerweise 20 - 30). Klicken Sie dazu auf die Auf- und Abwärtspfeile, oder geben Sie die Nummer über die Tastatur des Computers ein.
      3. Klicken Sie auf das Feld Pause After Pellet Number, um eine Pause von 5 s festzulegen, nachdem das angegebene Pellet vom Sprungbrett entfernt wurde. Klicken Sie dazu auf die Auf- und Abwärtspfeile, oder geben Sie die Nummer über die Tastatur des Computers ein.
      4. Klicken Sie auf das Feld Pause Länge, um eine Pause zwischen dem Zeitpunkt, an dem ein Pellet vom Sprungbrett entfernt wird, und dem Zeitpunkt, zu dem ein neues Pellet abgegeben wird, eine Pause einzulegen. Klicken Sie dazu auf die Auf- und Abwärtspfeile, oder geben Sie die Nummer über die Tastatur des Computers ein.
         HINWEIS: Normalerweise ist 1 s eine angemessene Pausenzeit. Wenn die Mäuse ängstlich sind, nachdem jedes Pellet abgegeben wurde, ist es ratsam, die Pausenlänge mit dem Feld Pause Länge auf 5 s zu erhöhen.
      5. Erfassen Sie manuell den Abstand, in dem das Pellet im Feld Entfernung erreichen platziert wird. Klicken Sie dazu auf die Auf- und Abwärtspfeile, oder geben Sie die Nummer über die Tastatur des Computers ein.
         HINWEIS: Die Größe der Beschleunigungs- und Zeitarrays wird für Debugging-Zwecke verfügbar gemacht und kann ignoriert werden.
      6. Klicken Sie auf das Feld Ordner zum Einschließen von Protokollen, um den Dateispeicherort zum Speichern der gesammelten Daten auszuwählen.
      7. Nachdem die Informationsfelder ausgefüllt wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Trainingseinheit zu beginnen. Der Auto-Trainer gibt einzelne Pellets aus und verfolgt, ob sie durch den Trichter fallen, bis die Gesamtzahl der Pellets abgegeben wurde und das letzte Pellet entweder von der Maus geborgen oder fallen gelassen wurde. Das Programm wird an dieser Stelle automatisch beendet. Bei Bedarf kann es auch vorzeitig gestoppt werden, indem Sie auf die Stopp-Taste klicken.
   2. Sobald die Software eingerichtet ist, legen Sie den Home-Käfig der Maus, die getestet werden soll, auf den Sockel und beobachten Sie die Maus, damit Sie beurteilen können, ob die Maus tatsächlich gelernt hat, das erforderliche neuartige Erreichensverhalten zu versuchen. Nachdem Sie auf die Schaltfläche Ausführen geklickt haben, lassen Sie die Maus den Steckplatz und seine neue, unbekannte Umgebung untersuchen.
      HINWEIS: Ähnlich wie bei der Einführung von Mäusen in das Konzept des Erreichens, erwarten Einige Mäuse konformer als andere. Mäuse, die das Konzept verstanden haben, sollten versuchen, innerhalb von 5-10 min zu erreichen und werden die Bewegung des Autotrainers mit dem vorgestellten Pellet assoziieren, wie wenn sie einen unbedeckten Steckplatz mit Nahrung in den Anfangsstadien dieses Protokolls assoziieren.

Ergebnisse

Im Allgemeinen wird empfohlen, dass jede Trainingseinheit aus etwa 20-30 Tests besteht, die vom Benutzer festgelegt, automatisch vom Auto-Trainer ausgeführt und in einer einzigen Protokolldatei pro Sitzung und Maus gespeichert werden können. Jede Prüfung kann nacheinander, direkt nach der anderen, mit 2-5 s Pause durchgeführt werden. Mäuse, die auf dem Auto-Trainer trainiert werden, zeigen eine Steigerung der Fähigkeiten über 10 Trainingseinheiten.

Diskussion

Unser Auto-Trainer evaluiert die Reichweite von Forelimb (Prehension) automatisiert. Um diesen Endpunkt zu erreichen, wurden viele der Parameter, die für die Mausvorhensionsaufgabe entwickelt wurden, einschließlich Pelletplatzierung, Pelletgröße und Trainingskriterien, über mehrere Jahre iteriert und an frühere Protokolle^{angepasst 2,5 ,6}. Der Fortschritt hier ist die Automatisierung der Aufgabe mit einem Roboter, der Haus...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABS Filament	Custom 3D Printed	N/A	utilized for pellet holder, frame, arm and funnel
ABS Sheet	McMaster-Carr	8586K581	3/8" thickness; used for platform compononents, positioning stand guides and base
Adruino Mini	Adruino	A000087	nano version also compatiable as well as other similar microcontrollers
Bench-Top Adjustable-Height Positioning Stand	McMaster-Carr	9967T43	35 lbs. load capacity
Clear Acrylic Round Tube	McMaster-Carr	8532K14	ID 3/8"
Low-Carbon Steel Wire	McMaster-Carr	8855K14	0.148" diameter
Pellet Dispenser	Lafayette Instrument: Neuroscience	80209-45	with 45 mg interchangeable pellet size wheel and optional stand
Photointerrupter Breakout Board	SparkFun	BOB-09322 ROHS	designed for Sharp GP1A57HRJ00F
Reflective Object Sensor	Fairchild Semiconductor	QRD1113	phototransistor output
Servo Motor	SparkFun	S8213	generic metal gear (micro size)
Transmissive Photointerrupter	Sharp	GP1A57HRJ00F	gap: 10 mm, slit: 1.8 mm