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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para enriquecer los sitios endógenos de unión al ARN o "huellas" de los complejos de ARN:proteína (RNP) de células de mamíferos. Este enfoque implica dos inmunoprecipitaciones de subunidades RNP y por lo tanto se denomina inmunoprecipitación de ARN en tándem (RIPiT).

Resumen

La inmunoprecipitación de ARN en tándem (RIPiT) es un método para enriquecer las huellas de ARN de un par de proteínas dentro de un complejo de ARN:proteína (RNP). RIPiT emplea dos pasos de purificación. En primer lugar, la inmunoprecipitación de una subunidad RNP etiquetada es seguida por una digestión leve de RNase y una posterior elución de afinidad no desnaturalizante. Una segunda inmunoprecipitación de otra subunidad RNP permite el enriquecimiento de un complejo definido. Después de una eliminación desnaturalización de ARN y proteínas, las huellas de ARN se convierten en bibliotecas de secuenciación de ADN de alto rendimiento. A diferencia del más popular reticulación ultravioleta (UV) seguido de enfoque de inmunoprecipitación (CLIP) para enriquecer los sitios de unión RBP, RIPiT es independiente de la reticulación UV. Por lo tanto, RIPiT se puede aplicar a numerosas proteínas presentes en el interactome de ARN y más allá que son esenciales para la regulación del ARN, pero no contactan directamente con el ARN o UV-crosslink mal al ARN. Los dos pasos de purificación en RIPiT proporcionan una ventaja adicional de identificar sitios de unión donde una proteína de interés actúa en asociación con otro cofactor. La estrategia de doble purificación también sirve para mejorar la señal limitando el fondo. Aquí, proporcionamos un procedimiento paso a paso para realizar RIPiT y generar bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento a partir de huellas de ARN aisladas. También describimos las ventajas y aplicaciones de RIPiT y discutimos algunas de sus limitaciones.

Introducción

Dentro de las células, el ARN existe en complejos con proteínas para formar complejos de ARN:proteínas (RNPs). Los RRP se ensamblan alrededor de proteínas de unión al ARN (RBP, aquellas que unen directamente el ARN) pero también comprenden los RBP no (aquellos que unen los PBP pero no el ARN), y a menudo son dinámicos en la naturaleza. Los BBP y sus cofactores funcionan colectivamente dentro de los RNP para ejecutar funciones regulatorias. Por ejemplo, en la vía de descomposición del ARNm mediado por tonterías (NMD), las proteínas UPF (UPF1, UPF2 y UPF3b) reconocen el ribosoma terminado prematuramente. Cada una de las proteínas UPF puede unirse al ARN, pero es sólo cuando se ensamblan juntas que comienza a formarse un complejo NMD activo. Dentro de este complejo, UPF1 se activa aún más por fosforilación por un SMG1 no RBP, y dicha activación UPF1 eventualmente conduce a la contratación de factores inductores de descomposición de ARNm1,2. En este ejemplo, los RBP requieren cofactores que no son DeRBP para el reclutamiento y la activación del complejo RNP que activa NMD. Otra propiedad de los RNPs es su heterogeneidad compositiva. Considere el spliceosoma, que existe en los complejos distintos E, A, B o C. Diferentes complejos de spliceos tienenproteínas superpuestas y distintas 3. Para estudiar las funciones de RNP, es importante dilucidar qué ARN están unidos por una RBP y sus proteínas asociadas. Existen muchos métodos para lograrlo, con cada enfoque teniendo sus claras ventajas y desventajas4,5,6,7.

Los métodos más populares para identificar los sitios de unión de la RBP —reticulación seguido de inmunoprecipitación (CLIP) y sus diversas variaciones— dependen de la luz ultravioleta (UV) para cruzar una RBP al ARN8. Sin embargo, este no es un enfoque eficaz para los no RBP dentro de los RMP, que no entran en contacto directamente con el ARN. Aquí, describimos un enfoque alternativo que es aplicable a los BBP y no BBP por igual, para aislar e identificar sus sitios de enlace de ARN. Este enfoque llamado inmunoprecipitación de ARN en tándem (RIPiT) consta de dos pasos de inmunoprecipitación, que ayudan a lograr una mayor especificidad en comparación con una sola purificación (Figura1)9,10. Como los pasos de inmunoprecipitación individual (IP) se pueden llevar a cabo con una cuerda más baja en comparación con CLIP, RIPiT no depende de la disponibilidad de anticuerpos que puedan soportar la presencia de detergentes fuertes durante la inmunoprecipitación. La ventaja más singular de RIPiT es la capacidad de apuntar a dos proteínas diferentes en dos pasos de purificación; esto proporciona una manera poderosa de enriquecer un complejo RNP diferenciado compositivamente de otros complejos similares11.

Pequeñas variaciones en el procedimiento RIPiT pueden mejorar aún más el enriquecimiento de RNP. Por ejemplo, algunas interacciones ARN-proteína o proteína-proteína dentro de los RNPs son transitorias y puede ser difícil purificar eficientemente las huellas de estos complejos. Para estabilizar tales interacciones, los RNP pueden ser reticulados dentro de las células con formaldehído antes de la lisis celular y RIPiT. Por ejemplo, hemos observado que una interacción débil entre el factor de núcleo del complejo de unión exón (EJC), EIF4AIII y el factor de desmontaje del EJC, PYM12 puede estabilizarse con el tratamiento de formaldehído de modo que se enriquezcan más huellas de ARN (datos no se muestra). Antes de la cosecha celular y RIPiT, las células también pueden ser tratadas con medicamentos para estabilizar o enriquecer los RMP en un estado particular. Por ejemplo, cuando se estudian proteínas que se eliminan del ARNm durante la traducción (por ejemplo, el EJC13, UPF114), el tratamiento con inhibidores de la traducción como la puromicina, la cicloheximida o la harringtonina puede proteínas en los ARN.

La cantidad de ARN recuperada de RIPiT suele ser baja (0,5-10 pmoles, es decir, 10-250 ng de ARN teniendo una longitud media de ARN de 75 nt). La razón principal de esto es que sólo una pequeña fracción de una proteína dada está presente en complejo con otras proteínas dentro de los NRP (cualquier proteína "libre" IP'ed en el primer paso se pierde durante el segundo IP). Para generar bibliotecas RNA-Seq a partir de este ARN, también describimos aquí una adaptación del protocolo publicado anteriormente adecuado para tales entradas de ARN bajas15,16 (Figura2), que produce muestras listas para secuenciación de alto rendimiento en 3 Días.

Protocolo

1. Establecimiento de líneas de celda hek293 estables que expresan proteína de interés con etiqueta FLAG con etiqueta DE TETRA (POI)

  1. Células HEK293 semillas con un objetivo de recombinación Flp establemente integrado (FRT) a una densidad de 10 x 104 células/ml en medio de crecimiento (medio de águila modificado de Dulbecco [DMEM] + 10% suero bovino fetal [FBS] + 1% penicilina-estreptomicina [penn/strep]) en 6- platos de pozo. Permitir que las células crezcan durante la noche en una incubadora humidificada a 37oC y 5% de CO2 (condiciones de crecimiento estándar para todos los pasos posteriores).
  2. Al día siguiente, las células deben ser confluentes del 70 %. De acuerdo con el protocolo de reactivo de transfección, transfectar las células HEK293 que contienen el sitio FRT con una relación 9:1 de pcDNA5-TETO-FLAG-POI:pOG44.
    NOTA: La etiqueta FLAG tiene el motivo de secuencia DYKDDDDK (D á ácido aspártico, Y - tirosina, y K - lisina).
  3. Después de las 24 h, comience la selección de antibióticos. Retire los medios y agregue un medio de crecimiento fresco complementado con 100 g/ml de higromicina. Dentro de 72 h, las células no transinfectadas deben comenzar a morir.
  4. Cada 48-72 h, cambiar los medios de crecimiento y complementar con higromicina fresca.
  5. Después de 2 semanas de selección, comenzarán a aparecer colonias discretas de células transtróficadas estables. Una vez que las colonias sean visibles a simple vista, añadir 1 ml de trippsina a la placa e incubar durante 5 min a 37oC. Resuspenda las células en DMEM, transfiera las células a una nueva placa de 10 cm y ajuste el volumen a un medio de crecimiento fresco de 10 ml complementado con higromicina de 100 g/ml. Permita que la placa alcance una confluencia del 80 % para expandir aún más las células para preparar existencias permanentes.
  6. Determinar la cantidad de tetraciclina (Tet) necesaria para obtener el nivel óptimo de expresión FLAG-POI para el experimento. Cultivar células en formato de 12 pocillos y realizar una valoración de Tet entre 0-1,000 ng/mL rango para 16-24 h. Realizar manchas occidentales en las muestras de valoración con anticuerpos contra el PDI.
    NOTA: En el caso de proteínas de hasta 60 kDa, la copia etiquetada por FLAG y la copia endógena de la proteína se puede resolver en la electroforesis de gel de dodecylo-poliacrilamida (SDS-PAGE) con etiqueta FLAG para comparar los niveles de expresión de FLAG-POI con su contraparte endógena. Para proteínas más grandes, la intensidad de la señal en las muestras inducidas por Tet se puede comparar con la muestra no inducida. La solución de stock de tetraciclina se puede preparar a 1 mg/ml en etanol 100%. Las diluciones de la población para el trabajo de cultivo celular deben ser en agua estéril o solución salina con fosfato (PBS). Las existencias de tetraciclina deben prepararse frescas una vez al mes.

2. Células de cultivo para la inducción de tetraciclina y el procedimiento RIPiT

  1. Semilla sin gas integrada FLAG-POI HEK293 a una densidad de 3 x 105 células/ml en medio de crecimiento en placas de 15 cm. Permita que las células crezcan a37 oC y 5% co 2.
    NOTA: En general, de tres a cinco placas de 15 cm producirán huellas de ARN de 2-20 pmol de arna dependiendo de la abundancia del RNP de interés. Si los NRP serán reticulados y purificados formaldehído bajo condiciones estrictas, entonces el doble de entrada puede ser necesaria.
  2. Añadir tetraciclina a la concentración óptima predeterminada a los medios para inducir la expresión del FLAG-POI (ver paso 1.6) 16-24 h antes de que las células sean cosechadas.
    NOTA: No es necesario cambiar el medio de crecimiento. Las células deben estar listas para cosechar alrededor de 72 h después de la sembrada o cuando las placas son confluentes del 80%. Es importante evitar que las células se vuelvan confluentes.

3. Cosecha celular, tratamiento de formaldehído y lisis celular

  1. Lave las células monocapa suavemente con 15 ml de PBS refrigerado por cada placa de 15 cm. A continuación, raspe las células en 30 ml de PBS. Si las células fueron tratadas con medicamentos antes de la cosecha, suplemento PBS con el medicamento. Recoger todas las células en un tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: Para preservar las interacciones débiles, las células pueden ser reticuladas con formaldehído: añadir formaldehído a la suspensión celular desde el paso 3.1 a una concentración final de 0.1% e incubar en un balancín a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir 3 mL del tampón de enfriamiento (Tabla 1 ) y roca durante 5 minutos adicionales.
  2. Células de pellets a 400 x g durante 10 min a 4oC y desechar el sobrenadante.
  3. Células de Lyse en 4 ml de tampón de lisis hipotónica en frío (HLB; Tabla 1). Utilice una pipeta P1000 para resuspender las células. Pasar a un tubo de 5 ml e incubar el lisado sobre hielo durante 10 min.
  4. Coloque el lisado en un baño de hielo y sonicar a una amplitud del 10% durante 30 s con pulsos de 1 s con pausas de 2 s. A continuación, ajuste la concentración de sal a 150 mM añadiendo 108 ml de 5 M NaCl.
    NOTA: Las muestras reticuladas de formaldehído pueden estar sujetas a lisis y purificación más estrictas al incluir un 0,1% cada una de SDS y desoxicolato de sodio en el tampón de lisis.
  5. Limpie el lisado por centrifugación a 21.000 x g durante 10 min a 4oC. Recoger un sobrenadante de 20 l (extracto celular) en un tubo etiquetado para el análisis de la mancha occidental de los niveles de proteínas en la entrada (ver Figura 3A).
    NOTA: Mientras el islato está en centrífuga, las perlas de agarosa FLAG se pueden lavar (ver paso 4.1). Las perlas de agarosa FLAG deben lavarse 3 veces en 4 ml de tampón de lavado isotónico helado (IsoWB, Tabla 1).

4. Inmunoprecipitación FLAG

  1. Aplique el sobrenadante restante del paso 3.5 a 750 s pre-lavado FLAG abalorios de agarosa en un tubo de 5 ml (el volumen de cama de las perlas de agarosa FLAG lavadas será de 375 l). Incubar cuentas de agarosa FLAG y extracto celular durante 1-3 h a 4oC con mezcla suave.
    NOTA: Este volumen de cuentas de agarosa FLAG debe ser suficiente para una amplia gama de proteínas, pero puede optimizarse, si es necesario.
  2. Pellet FLAG cuentas de agarosa por centrifugación a 400 x g durante 1 min a 4 oC. Recoger 20 l del sobrenadante en un tubo etiquetado para el análisis de la mancha occidental de los niveles de proteína en el extracto de células agotadas (ver Figura 3A). Deseche el sobrenadante restante.
  3. Para lavar las perlas de agarosa FLAG, añadir 4 mL de IsoWB y resuspender. Perlas de pelet a 400 x g durante 1 min a 4oC. Retire con cuidado el sobrenadante. Repita 4x.
    NOTA: Para lavados estrictos de las IP reticuladas de formaldehído, se puede incluir en el tampón de lavado un 0,1% cada una de SDS y desoxicolato de sodio para los dos primeros pasos de lavado.

5. Digestión RNase I

  1. Diluir RNase I a 0.002-0.01 unidades/ml en 750 l de IsoWB (la concentración adecuada para los tamaños de huella deseados debe determinarse empíricamente). Añadir IsoWB-RNase I a las cuentas de agarosa FLAG lavadas e incubar con una mezcla suave a 4 oC durante 10 min.
  2. Perlas de pelet a 400 x g durante 1 min a 4oC. Recoger un sobrenadante de 20 l (elución RNase I) en un tubo etiquetado para el análisis de la mancha occidental. Deseche la IsoWB-RNase I y lave las perlas de agarosa FLAG 4x con IsoWB como se describe en el paso 4.3.

6. Laución de afinidad

  1. Preparar un stock de tampón de elución (péptido FLAG a 250 ng/ml en IsoWB). Aplicar 375 l de tampón de elución a las perlas de agarosa FLAG y agitar suavemente a 4 oC durante 1-2 h. Perlas de agarosa DE PELLEt FLAG y recoger una alícuota de 15 l de la elución para la mancha occidental de proteínas en FLAG IP (ver Figura 3A).
    NOTA: Cuando la elución de afinidad está en curso, se puede realizar la sección 7.

7. Conjugación de anticuerpos de perlas magnéticas

  1. Lavar perlas magnéticas de 50 l (es decir, Dynabeads; Tabla de Materiales) 3x en 1 ml IsoWB en tubo de 1,5 ml. Resuspenda los perlas magnéticas en 100 ml de tampón de conjugación. Añadir la cantidad adecuada de anticuerpos (la cantidad exacta de anticuerpos que se utilizará para la IP deberá determinarse empíricamente para cada anticuerpo).
    NOTA: Las perlas magnéticas de la proteína A son óptimas para los anticuerpos producidos en el conejo, mientras que las cuentas magnéticas de la proteína G son más adecuadas para los anticuerpos de ratón. La tabla de compatibilidad de perlas magnéticas está disponible en el sitio web del proveedor para elegir las cuentas adecuadas para cada anticuerpo.
  2. Lavar las perlas magnéticas 2x en el tampón de conjugación (Tabla 1). Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos. Almacenar en hielo hasta el siguiente paso.

8. Segunda inmunoprecipitación

  1. Aplique la elución de afinidad FLAG restante del paso 6.1 a las cuentas magnéticas acopladas a los anticuerpos contra la proteína de interés. Incubar con una mezcla suave a 4oC durante 1-2 h. Capturar perlas magnéticas en un imán y recoger 15 oL de sobrenadante para el análisis de proteínas no unidas a través de la mancha occidental. Lavar las perlas magnéticas 7x con 1 mL de IsoWB.

9. Desnaturalización de la elución

  1. Añadir 100 l de tampón de muestra transparente (Tabla1) a las perlas magnéticas y resuspender con una pipeta P200. Incubar sobre hielo durante 10 minutos. Deslice suavemente para resuspender las cuentas periódicamente.
  2. Capturar perlas magnéticas en un imán y recoger 15 l de elución para el análisis de proteínas en la elución RIPiT a través de la mancha occidental (ver Figura 3A). Transfiera la elución restante a un nuevo tubo de 1,5 ml etiquetado.
    NOTA: Si las muestras fueron reticuladas de formaldehído, las muestras deben incubarse a 65 oC durante 1 h para reticulación inversa.
  3. Realice blots occidentales en muestras recogidas en varios pasos (entrada, agotamiento de IP FLAG, IP FLAG, segundo agotamiento de IP, segunda elución de IP). Blot con anticuerpos contra las dos proteínas de cebo, sus otros interactores si se conocen, y al menos un RBP no interactuable como un control negativo (Figura3A).

10. Extracción de ARN y curado final

  1. Para la elución DE RIPiT, añadir 320 l de ddH libre de RNase2O, 400 l de alcohol isoamilo fenol-cloroformo (PCIAA, pH 4.5), y vórtice para 30 s y girar a temperatura ambiente a 12.000 x g durante 5 min. Añadir 35 ml de acetato de sodio de 3M, 1 l de 1 M MgCl 2, 10 g de glucógeno y 1 ml de etanol al 100%. Incubar durante la noche a -20oC.
  2. Para peletizar el ARN, centrífuga a 12.000 x g durante 30 min a 4oC. Lave el ARN en 70% de etanol.
  3. Para eliminar el fosfato de 3' que queda en el ARN después del escote RNase I, resuspenda el pellet de ARN en 17 ml de ddH2O libre de RNase, y agregue 2 ml de tampón quinasa de polinucleótido T4 10x (PNK) tampón (Tablade materiales)y 1 l de T4 PNK. Incubar a 37oC durante 30 min.
    NOTA: La actividad 3'fosfatasa de T4 PNK tiene una actividad óptima a pH 617. El búfer de reacción PNK está optimizado para la actividad quinasa de 5' de T4 PNK y tiene un pH de 7.6. Al ajustar el pH de la reacción de curado final, este paso se puede optimizar aún más.
  4. Añadir 380 sde DdH2O sin RNase y 400 l de PCIAA pH 4.5 al tubo. Vortex para 30 s, centrífuga a 12.000 x g durante 5 min. Recoger la fase acuosa y añadir 35 ml de acetato de sodio de 3 M, 1 l de 1 M MgCl2, 10 g de glucógeno y 1 ml de etanol al 100%.
  5. Incubar durante la noche a -20oC. Pellet y lave el ARN con 70% de etanol como arriba. Resuspenda el ARN en 4,5 ml de agua libre de RNase.

11. Estimación del tamaño y la abundancia de la huella de ARN

  1. Se espera que un RIPiT exitoso produzca 1 pmol o más de fragmentos de ARN. Para cuantificar el rendimiento real, transfiera 0,7 ml de ARN RIPiT (1/6 de rendimiento total) a un tubo nuevo. Añadir 2 l de 10 x T4 PNK tamp, 1 l de 1 mM de ATP, 40 ci a32P-ATP (0,5 x 1,0 l de la acción) y 1 l de T4 PNK. Ajustar el volumen a 10 s e incubar a 37 oC durante 30 min.
    1. En reacciones paralelas de PNK, etiquete una escalera de ADN de bajo rango y 0,1 pmol de un ARN sintético o un oligo de ADN (20-40 nt) para utilizar estándares de tamaño y cantidad.
  2. Resolver ARN/ADN etiquetado en gel urea-PAGE al 26% (20 x 27 x 0,45 mm3). El gel debe ser pre-ejecutado durante 30 minutos a 35 W. Enjuagar los pozos antes de la ejecución previa y antes de cargar las muestras y correr a 35 W hasta que el frente de tinte azul bromofenol casi haya llegado al final del gel.
  3. Retire cuidadosamente el gel de las placas de vidrio en un pedazo de papel de filtro de 8 x 11 pulgadas. Con gel encima del papel, colóquelo en un aparato de secado de gel y cúbralo con un trozo de envoltura de plástico. Gel seco a 80oC durante 1 h con vacío.
  4. Exponga el gel seco a un fosfopertano durante la noche o hasta que se detecte una señal adecuada. Imagen fosfopantalla. ARN de buena calidad de un RIPiT debe aparecer como un frotis en el carril, con bandas prominentes mínimas (Figura3B). Para cuantificar el ARN, compare la intensidad de la señal de los fragmentos de ARN del tamaño deseado en el carril RIPiT con la señal de 0,1 pmol de oligo sintético etiquetado.
    NOTA: Alternativamente, el tamaño y las cantidades de la huella de ARN se pueden verificar utilizando un bioanalizador de alta sensibilidad (Figura3C).

12. Ligadura del adaptador

  1. Preparar el ARN RIPiT de manera que al menos 3 pmol de ARN se disuelvan en 3,8 ml de agua.
  2. En un tubo de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de 0,2 ml, combine 3,8 ml de ARN, 1 l de adaptador preadenilado miR-CAT-33 (7 m) (tablade materiales). Incubar la mezcla en un ciclor térmico a 65 oC durante 10 min, 16 oC durante 5 min, luego mantener a 4 oC.
    NOTA: El vinculador preadenilado se puede pedir desde el servicio de síntesis de oligo, o un adn personalizado sin denegar oligo de cualquier servicio de síntesis de oligo puede ser adenilado utilizando Mth ARN ligase (Tablade materiales) y gel purificado.
  3. Al mismo tubo, añadir 1,5 ml de tampón de ligasa de ARN T4 de 10x, 7,5 ml de polietilenglicol 8000 al 50% (PEG-8000), 0,75 ml de ditiothreitol de 20 mM (TDT) y 0,45 ml de T4 RNL2 Tr. K227Q (Tablade materiales).
    NOTA: 50% PEG-8000 viene con antelón de ARN y tampón comprado. Las soluciones PEG-8000 son viscosas y deben entubarse lentamente.
  4. Incubar la reacción en el ciclor térmico a 30 oC durante 6 h, calentar la ligasa a 65 oC durante 10 min, luego mantener a 4 oC.

13. Transcripción inversa

  1. Al tubo con la mezcla de ligadura del paso 12.4, añadir 11,25 l de mezcla de trifosfato de desoxinucleótido 4x (dNTP), que contiene una mezcla de DNTP regulares y biotinilados (ver Tabla 1), 1,0 ml de imprimaciones RT de 10 m (Tablade materiales)y 6,8 oL de Agua libre de RNase. Incubar a 65oC durante 5 min y mantener a 4oC.
  2. Transfiera los tubos al hielo y añada 9,0 l de tampón de primera cadena (FS) de 5x sin MgCl2 (Tabla 1), 2,25 ml de TDT de 100 mM, 1,2 ml de enzima transcriptasa inversa a un volumen final de 45 l (Tablade materiales).
  3. Incubar en un ciclor térmico a 55oC durante 30-60 min. Inactivar la transcriptasa inversa a 70oC durante 15 min y mantener la muestra a 4oC.

14. Purificación del producto RT

  1. Añadir 45 l de búfer de carga de urea 2x (Tabla1) a la reacción RT. Diluir 1 g de una escalera de ADN de bajo rango en 45 l y añadir 45 l de tampón de carga de urea 2x.
  2. Preparar 10% gel urea-PAGE (20 x 28 x 0,15 cm3; Tabla 1) con peine de 8 pozos. Con jeringa o pipeta, enjuague los pozos con un tampón Tris/borate/EDTA (TBE) de 0,5x.
    NOTA: Los geles caseros anteriores ofrecen una mejor resolución en la separación del producto RT extendido de la imprimación RT no extendida. Como alternativa, también se pueden utilizar geles de urea-PAGE prefabricados (Tablade materiales). Como los geles prefabricados permiten volúmenes máximos más pequeños por pozo, por lo que las muestras tendrán que dividirse en múltiples pozos. Los geles prefabricados deben funcionar a 150-200 V.
  3. Pre-ejecutar el gel a 35 W durante 30 min. Enjuagar los pozos de nuevo, cargar muestras y ejecutar el gel a 35 W hasta que el frente de tinte azul bromofenol haya migrado a aproximadamente 1 pulgada desde el final del gel.
    NOTA: Utilice el disipador de calor metálico durante la carrera previa y la carrera final para evitar el sobrecalentamiento del gel.
  4. Manchar el gel durante 5 min en 1x solución de tinción de gel de ácido nucleico de oro preparada en 0.5x TBE. Este tinte es sensible a la luz, así que evita la exposición a la luz.
  5. Gel de imagen en escáner fluorescente para fines de documentación utilizando filtros de emisión de 520 nm y 580 nm. Si un escáner fluorescente no está disponible, utilice un transiluminador de luz azul. El producto RT debe aparecer como un frotis a partir de la imprimación RT no extendida (Figura4).
    NOTA: Aunque el tinte de tinción de gel de ácido nucleico de oro se visualiza fácilmente en un documento de gel con fuente de luz UV, es vital no exponer el valioso producto RT a los rayos UV para evitar daños.
  6. Visualice el gel en un transiluminador de luz azul e exboce el producto RT del gel. Se recomienda cortar el ADN con extensiones que van desde 30-200 nt (Figura4). Coloque las piezas de gel extirpado sobre una superficie limpia y pique la rebanada en trozos pequeños para aumentar la superficie. Transfiera cuidadosamente a un tubo de 1,5 ml y agregue 800 ml de tampón de elución de ADN (Tabla1).
  7. Incubar las piezas de gel con una mezcla suave con tampón de elución de ADN durante la noche a temperatura ambiente.
  8. Separe el tampón de elución del gel pasando la suspensión a través de una columna de filtro de acetato de celulosa (Tablade materiales)colocada en un tubo de recogida de 2 ml.
  9. En el tubo de 1,5 ml, lave 10 ml de perlas magnéticas de estreptavidina con 500 ml de tampón de lavado de perlas de estreptavidina (Tabla1). Repita el proceso para tres lavados totales. No deje que las cuentas se sequen. Resuspender las perlas en 10 l de tampón de elución de ADN (Tabla1).
  10. Transfiera el tampón de elución separado de las piezas de gel en el paso 14.8 al tubo que contiene las perlas magnéticas de estreptavidina lavadas.
  11. Incubar con mezcla suave durante al menos 8 h a temperatura ambiente. Capturar perlas en un imán, eliminar el sobrenadante y resuspender perlas magnéticas en 10 l de agua libre de RNase y transferir a un tubo PCR de 0,2 ml.

15. Circularización del producto RT

  1. Los productos RT capturados en las perlas de estreptavidina se circularán mientras están atados a perlas. A la suspensión de perlas magnéticas, añadir 2,0 l de búfer de reacción de circularización de 10x, 1,0 l de 1 mM de ATP, 1,0 ml de 50 mM MnCl2, 4,0 l de betaína de 5 M, 1,0 l de ligasa ssDNA I (Tablade materiales)y 1,0 l de agua libre de RNase.
  2. Incubar la reacción de circularización en un ciclor térmico a 60 oC durante 4 h. El calor inactiva la ligasa ssDNA I calentando a 80 oC durante 10 min y luego mantener a 4 oC.

16. Prueba de PCR

  1. Antes de proceder a un PCR a gran escala, utilice una porción de producto circularizado para determinar el número ideal de ciclos de amplificación para cada muestra. Este paso ayuda a prevenir la sobreamplificación y limitar los artefactos de PCR a medida que los componentes de reacción de PCR se limitan en ciclos de PCR más altos.
  2. Preparar una reacción de PCR de 45 l con 4,0-6,0 l del producto circularizado a partir del paso 15,2, 9,0 l de búfer de reacción de 5x, dNTPs de 0,9 ml a 10 M, 2,25 ml de imprimación PE1,0 de 10 m (Tablade materiales),2,25 ml de imprimación PE2,0 de 10 m de PE2,0 (Tablade materiales) , y 0,045 l de polimerasa de ADN de alta fidelidad (Tablade Materiales)y agua.
  3. Mezcle bien la reacción y se divida en tres reacciones de 15 s. Cada una de estas tres reacciones estará sujeta a un número variable de ciclos de PCR. Se espera que el número ideal de ciclos esté entre 7 y 14. Así que realice los PCR de prueba para 8, 11, y 14 ciclos.
  4. Utilice las siguientes condiciones de PCR: 98 oC - 30 s; 98 oC - 5 s; 65 oC - 10 s; 72 oC - 15 s; 72 oC - 2 min; 12 oC - sostener.
  5. Añadir 3 l de tinte de carga de gel 6x y resolver en 10% gel PAGE nativo hasta que el frente de tinte azul haya migrado 3/4 del gel. Manchar el gel usando la mancha de gel de ácido nucleico de oro y la imagen como en los pasos 14.4 y 14.5 (Figura5).
  6. Para elegir el número ideal de ciclos de PCR, compare los productos de PCR del número creciente de ciclos. Elija el número de ciclo que produzca la mayor cantidad de producto del tamaño esperado sin artefactos de sobreamplificación (por ejemplo, un frotis de ADN mucho mayor de lo esperado, y donde no se vea ningún agotamiento apreciable de los imprimadores PE1.0 y PE2.0 (ver flecha roja en Figura 5).

17. PCR a gran escala

  1. Prepare una reacción de PCR de 45 l, como en el paso 16.2 y repita la PCR. Resuelve pcR en un 10% de PAGE nativo a 150 V, mancha con 1x mancha de gel de ácido nucleico de oro e imagen en un transiluminador de luz azul.
  2. Exbobe el producto PCR del gel y transfiera a una jeringa de 3 ml. Utilice la jeringa para triturar el gel y extruir lo que hace en un tubo de 1,5 ml.
    NOTA: El producto RT no extendido tras la circularización produce un producto PCR de 151 bp. Por lo tanto, en este paso se debe dimensionar los productos que son mayores que 151 bp (Figura6).
  3. Añadir 900 l de tampón de elución de ADN e incubar a temperatura ambiente durante la noche con una mezcla suave.
  4. Transfiera la suspensión de gel a una columna de filtro de acetato de celulosa colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Gire a 12.000 x g durante 3 min, recogiendo el sobrenadante en un tubo nuevo.
  5. Añadir otro tampón de elución de ADN de 400 l al gel triturado y transferirlo a un tubo de 1,5 ml. Incubar con mezcla suave durante 4 horas adicionales para una segunda elución.
  6. Piscina todas las eluciones y se divide en 3 tubos con 400 l cada uno. Precipita el ADN añadiendo 1 ml de 100% de etanol y 10 g de glucógeno. Vórtice e incubar al menos 2 h a -20 oC.
  7. ADN de pellets a 12.000 x g durante 30 min a 4oC. Lave el pellet de ADN con 70% de etanol.
  8. Retire con cuidado todo el etanol pipeteando y resuspenda rápidamente el pellet de ADN en 20 ml de agua.
    NOTA: En esta etapa, es importante no dejar que el pellet de ADN se seque, ya que el secado del ADN puede desnaturalizarlo.
  9. Utilice una pequeña porción de la muestra de ADN para determinar el tamaño y la concentración del producto PCR a través del fluorómetro y el bioanalizador de ADN de alta sensibilidad. Ahora se pueden enviar muestras para su secuenciación en una de las plataformas.
  10. Las lecturas secuenciadas se pueden procesar (por ejemplo, eliminación del adaptador, recorte para mantener secuencias >30 puntuación Phred), alineadas con el genoma de referencia y visualizadas en un navegador como el navegador del genoma UCSC (Figura7).

Resultados

Un RIPiT exitoso resultará en la inmunoprecipitación de proteínas de interés y otras proteínas interactuantes conocidas, y la ausencia de proteínas no interactúas. Como se ve en la Figura 3A,magoh y EIF4AIII se detectaron en la elución RIPiT, pero HNRNPA1 no lo fue (carril 6). Paralelamente, las huellas de ARN que se han copurificado con los complejos RNP se detectaron mediante autoradiografía (Figura3B) o bioanalizador...

Discusión

Aquí analizamos algunas consideraciones clave para realizar correctamente RIPiT. En primer lugar, las IP individuales deben optimizarse para lograr la máxima eficiencia posible en cada paso. La cantidad de perlas de agarosa FLAG para el número de entrada de células descritas aquí ha demostrado ser robusta para una amplia gama de proteínas que hemos probado. Dado que sólo una pequeña fracción de las proteínas asociadas se coinmunopreciada con la proteína FLAG, la cantidad de anticuerpos necesarias para una segu...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la subvención de NIH GM120209 (GS). Los autores agradecen al Núcleo de Recursos Compartidos de OSUCCC Genomics por sus servicios (CCC Support Grant NCI P30 CA16058).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-FLAG Affinity GelSigmaA2220
ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µCiPerkinElmerBLU502A250UC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200)Fisher14-823-435
Betaine 5MSigmaB0300
biotin-dATPTriLinkN-5002
biotin-dCTPPerkin ElmerNEL540001EA
Branson Sonifier, Model SSE-1Branson
CircLigase IVWR76081-606ssDNA ligase I
DMEM, High GlucoseThermoFisher11995-065
DNA load buffer NEBNEB
Dynabeads Protein ALifeTech10002D
Flp-In-T-REx 293 Cell LineThermoFisherR78007
GeneRuler Low Range DNA LadderThermoScientificFERSM1203
Hygromycin BThermoFisher10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 wellBio-Rad4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea GelBio-Rad4566033
miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Mirus transIT-X2 transfection reagentMirusMIR 6004
Mth RNA ligaseNEBE2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC
GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl)FisherBP1752I-100
Purple Gel Loading Dye (6x)NEBNEB #7025
Q5 DNA PolymeraseNEBM0491S/L
RNase I, E. coli, 1,000 UEppicenterN6901K
SPIN-X columnCorningCLS8160-24EA
Streptavidin beadsThermoFisher60210
Superscript III (SSIII)ThermoScientific18080044reverse transcriptase enzyme
SybrGoldThermoFisherS11494gold nucleic acid gel stain
T4 Polynucleotide Kinase-2500UNEBM0201L
T4RNL2 Tr. K227QNEBM0351S
TetracyclineSigma87128
Thermostable 5´ App DNA/RNA LigaseNEBM0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA
GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT
TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT
CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Typhoon 5 Bimolecular ImagerGE Healthcare Life Science29187191

Referencias

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