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Resumen

Este protocolo utiliza péptidos mixtos G6PI para construir modelos de artritis reumatoide que están más cerca de la artritis reumatoide humana en células CD4+ T y citoquinas. Células T asesinas naturales invariables de alta pureza (principalmente iNKT2) con fenotipos y funciones específicas se obtuvieron mediante inducción in vivo y purificación in vitro para inmunoterapia adoptiva.

Resumen

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica compleja. La patogénesis de la enfermedad está relacionada con células T (iNKT) asesinas naturales invariables. Los pacientes con AR activa presentan menos células iNKT, función celular defectuosa y polarización excesiva de Th1. En este estudio, se estableció un modelo animal de RA utilizando una mezcla de péptidos hGPI325-339 y hGPI469-483. Las células iNKT se obtuvieron por inducción in vivo y purificación in vitro, seguida de perfusión en ratones RA para inmunoterapia adoptiva. El seguimiento del sistema de imágenes in vivo (IVIS) reveló que las células iNKT se distribuyeron principalmente en el bazo y el hígado. El día 12 después de la terapia celular, la progresión de la enfermedad se desaceleró significativamente, los síntomas clínicos se aliviaron, la abundancia de células iNKT en el timo aumentó, la proporción de iNKT1 en el timo disminuyó, y los niveles de TNF-, IFN-o, y IL-6 en el suero disminuyó. La inmunoterapia adoptiva de las células iNKT restauró el equilibrio de las células inmunitarias y corrigió la inflamación excesiva del cuerpo.

Introducción

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune caracterizada por una invasividad crónica progresiva con incidencia de 0,5-1%1,2. La patogénesis subyacente se atribuye a la proliferación anormal de células autoreactivas CD4+ y CD8+ T, manifestadas por un aumento en la proporción de células CD4+IFN-+ y CD4+IL-17A+ T, y el número reducido de células CD4+IL-4+ y CD4+CD25+FoxP3+ T. Por lo tanto, la secreción de citoquinas inflamatorias se incrementa, y una reacción inflamatoria excesiva destruye el equilibrio nativo y la función de tolerancia del sistema inmunológico del cuerpo. Además, las células auxiliares del linfocito T (Th) 1 que penetran en la articulación agravan la respuesta inflamatoria y el daño articular. Por lo tanto, la inhibición de la respuesta inflamatoria excesiva y la restauración de la tolerancia inmune y el equilibrio inmune son clave para el tratamiento de RA3,4.

Las celdas iNKT tienen funciones y características de células NK y células T. Las células iNKT albergan una cadena distinta e invariable de receptor de células T (TCR) con repertorios limitados de cadena TCR5 y reconocen el antígeno glucólido presentado por la molécula CD1d del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) CD1d en la superficie de las células que presentan antígenos. 6 detectó un gran número de células iNKT y defectos funcionales en muchas enfermedades autoinmunes, incluida la AR. 7demostraron que las células iNKT tienen un efecto positivo en el mantenimiento de la tolerancia autoinmune y que cuando se restaura el número y la función de las células iNKT, la enfermedad se alivia. Además, Miellot-Gafsou et al.8 encontraron que las células iNKT no sólo abrogaron la enfermedad, sino que también aumentaron la progresión de la enfermedad. Estos resultados contradictorios sugieren que las células iNKT son células T heterogéneas, y la función de diferentes subconjuntos puede revertirse. En un estudio clínico de AR, la frecuencia de las células iNKT se correlacionó con la puntuación de la actividad de la enfermedad9. Los resultados también confirmaron que la frecuencia de iNKT se redujo en pacientes con AR, el número de subconjuntos de células CD4+IFN +T aumentó, y los niveles secretores de citoquinas inflamatorias IFN-o y TNF-o aumentaron10,11. Además,12 investigaron la diabetes tipo 1 (T1D) y encontraron que la infusión selectiva de células iNKT reguló la expresión de la citoquina inflamatoria IL-4, mantuvo la tolerancia inmune y presionó el desarrollo de la diabetes tipo 1. Por lo tanto, la infusión adoptiva de células iNKT específicas o la activación dirigida de células iNKT aumenta el nivel de células iNKT en pacientes con AR, lo que puede ser un avance en el tratamiento con AR.

La inmunoterapia celular es actualmente de gran interés y ha sido ampliamente utilizada en la terapia contra el cáncer. Sin embargo, las células iNKT son células inmunorreguladoras heterogéneas raras (sólo 0,3% del número total de PBMC)13,lo que limita las posibles aplicaciones clínicas. Estas células se dividen principalmente en tres subpoblaciones: 1) células iNKT1, que tienen una alta expresión de la leucemia promielocítica proteína zinc-dedo (PLZF) y factor de transcripción T-caja (T-bet); 2) células iNKT2 con expresión intermedia de PLZF y proteína de unión GATA 3 (GATA3); 3) células iNKT17 con baja expresión de PLZF y receptor nuclear huérfano (ROR) relacionado con retinoides- que secretan IFN-, IL-4 e IL-1714. Las células iNKT activadas secretan citoquinas similares a Th1, Th2 y Th17, que determinan los diferentes efectos inmunomoduladores de las células iNKT15. Los efectos inmunomoduladores e inmunoterapéuticos de la activación específica de varias subpoblaciones de células iNKT son diferentes. Por lo tanto, la selección de fenotipos específicos de células iNKT (principalmente iNKT2) con funciones antiinflamatorias para regular la respuesta inmune del cuerpo puede corregir el desequilibrio inmune y los trastornos inmunológicos en la AR.

El establecimiento de un modelo animal ideal es de gran importancia para el tratamiento y estudio de la patogénesis de la AR. Actualmente, los modelos animales más comúnmente utilizados y maduros incluyen artritis inducida por colágeno, artritis adyuvante, artritis inducida por cimosa, y artritis inducida por polisacáridos16–17. Sin embargo, no hay ningún modelo que pueda simular completamente todas las características de la RA humana. La artritis inducida por colágeno tipo II (CIA) es un modelo clásico de artritis. La CIA es inducida por la inmunización de ratones con anticuerpos monoclonales específicos para colágeno tipo II, lo que refleja la dependencia de anticuerpos de este modelo de enfermedad. Describió un modelo con una respuesta inmune sistémica a la isomerasa de glucosa-6-fosfato (G6PI), que induce la poliartritis simétrica periférica en cepas de ratón susceptibles18,19. En este modelo, el desarrollo de la artritis depende de las células T, células B, e inmunidad innata18,19,20. Horikoshi21 encontró que los modelos de RA resultantes de la inmunización de ratones DBA/1 con fragmentos de polipéptidos G6PI son más similares a la RA humana en términos de células CD4+ T y citoquinas (es decir, IL-6 y TNF)) que los modelos de la CIA. Con el fin de aumentar el efecto estimulante en el sitio de reconocimiento TCR, los fragmentos de polipéptidos mixtos de G6PI (hGPI325-339 y hGPI469-483) se utilizaron para inmunizar ratones DBA/1 para construir el modelo de ratón RA. La tasa de éxito de este enfoque puede ser alta porque hGPI325-339 y hGPI469-483 son inmunodominantes para las respuestas de células T restringidas a Q-A. Por lo tanto, este modelo puede simular la sobreproliferación de células CD4+ T y defectos celulares iNKT en pacientes con AR22. La investigación básica de la inmunopatología de la AR sentó las bases para nuestra investigación más profunda.

Protocolo

Todos los ratones experimentales (150 en total) eran ratones machosanos, de 6 a 8 semanas de edad (20,0 x 1,5 g), criados en un entorno específico libre de patógenos (SPF). No hay ningún tratamiento especial antes del modelado. El experimento se dividió en un grupo de control saludable (15 ratones), un grupo de control de modelos (15 ratones) y un grupo de terapia celular (55 ratones). Este estudio fue aprobado por el Comité de Bienestar Animal y Etica de la Universidad de Hebei.

1. Construir el modelo de enfermedad

  1. Duplicación del modelo animal RA
    1. Pesar 1,75 mg de fragmentos de hG6PI 325-339 y hG6PI 469-483 y disolverlos en 5,25 ml de agua destilada triple de 4oC.
    2. Disolver el adyuvante completo de Freund (CFA) en un baño de agua de 50 oC, dibujar 5,25 ml en otro tubo centrífugo de 10 ml y enfriarlo para su uso.
    3. Coloque la mezcla de solución hG6PI y solución cfA en una unidad de emulsión artificial con dos jeringas de vidrio conectadas.
    4. Empuje la jeringa a una velocidad y frecuencia constantes de 10–20 x por minuto para emulsionar completamente la solución de péptido mixto y la solución cfA. Realizar la operación en un baño de hielo, y mantener las gotas de emulsión en el agua durante 10 minutos después de la finalización de la emulsión sin dispersión.
    5. Inyectar 150 l de hG6PI emulsionados en la raíz de la cola del ratón por vía subcutánea.
    6. Inyectar 200 mg de toxina de la tos ferina en el ratón por vía intraperitoneal a 0 h y 48 h después de la inyección de hG6PI.
  2. Verificación experimental del modelo RA
    1. Mida el grosor de la pata del ratón con una pinza Vernier (2 veces al día).
    2. Observar y marcar el grado de enrojecimiento e hinchazón del pie. Utilice los siguientes criterios de puntuación: 1) dedos de los dedos con hinchazón leve; 2) pedis de dorsum y almohadilla para el pie con hinchazón roja clara; 3) tobillo con hinchazón roja.
    3. Eutanasia a los ratones bajo anestesia profunda mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg de peso corporal) 14 días después del modelado y retire las patas para la tinción HE.
    4. Determinar los niveles de secreción de suero IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-o, e IFN-o utilizando un ensayo de matriz de cuentas citométricas comerciales (CBA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

2. Obtención de células iNKT con terapia celular adoptiva

  1. Inducción direccional de células iNKT
    1. Inyectar ratones normales por vía intraperitoneal con el valor de "GalCer" (0,1 mg/kg de peso corporal).
  2. Aislamiento de células iNKT
    1. Tres días después del modelado, inyectar ratones por vía intraperitoneal con un 1% de pentobarbital sódico (50 mg/kg de peso corporal) para la anestesia. Los ratones anestesiados adecuadamente no muestran una respuesta de abstinencia de pata trasera a un pellizco del dedo del pies.
    2. Aísle el bazo de un ratón DBA/1 después de inyectarlo por vía intraperitoneal con el galCer. Preparar una suspensión de una sola célula cortando y moliendo el bazo en un tamiz de malla 200.
    3. Lave la suspensión celular con PBS, centrífuga a 200 x g durante 5 min y deseche el sobrenadante. Repetir.
    4. Resuspender las células con 1 ml de solución de dilución de sangre y tejido entero. Añadir 3 ml de medio de separación de linfocitos de ratón, y luego centrifugar las células durante 20 min a 300 x g a temperatura ambiente.
    5. Recoger la capa de linfocitos blancos lechosos (es decir, la segunda capa de la parte superior), lavarla 2 veces con PBS, y contar con un contador de células automatizado.
  3. Clasificación de células activadamagnéticas magnéticas (MACS)Estrategia de selección positiva para la purificación de células iNKT
    NOTA: Para el pretratamiento de los tetrámeros CD1d, se diluyó 1 mg/ml de la galcer a 200 g/ml con un 0,5% de Tween-20 y un 0,9% de NaCl, y 5 ml de la solución resultante a 100 ml de la solución de tetrámero CD1d. La mezcla se incuba durante 12 h a temperatura ambiente y se colocó a 4oC para su uso. El TCR se diluyó 80veces con agua desionizada. Todos los demás anticuerpos se utilizaron como solución de stock.
    1. Resuspenda 107 células con 100 oC de PBS de 4 oC, agregue 10 sL de Tetramer-PE CD1d cargado con GalCer e incubarlas a 4 oC durante 15 minutos en la oscuridad.
    2. Lavar las células 2veces con PBS y resuspenderlas en 80 sL de PBS.
    3. Añadir 20 s de anti-PE-MicroBeads e incubarlos a 4 oC durante 20 minutos en la oscuridad.
    4. Lávelos 2 veces con PBS y resuspenda las células con 500 ml de PBS.
    5. Coloque la columna de clasificación en el campo magnético de la clasificadodora MACS y enjuague con 500 ml de PBS.
    6. Agregue la suspensión de celda del paso 2.3.4 a la columna de ordenación, recopile el flujo a través y enjuague 3x con búfer PBS.
    7. Retire el campo magnético y recoja las celdas de la columna de clasificación. En este punto, agregue 1 ml de búfer PBS a la columna de clasificación y empuje rápidamente el émbolo a una presión constante para conducir las celdas etiquetadas al tubo de recolección y obtener células iNKT purificadas. Cuente con un contador de celdas automatizado.
  4. Identificación del fenotipo celular iNKT
    1. Tome 1 x 106 células de los pasos 2.2.5 y 2.3.7, respectivamente, y resuspenda en 50 l de PBS.
    2. Incubación de anticuerpos: No añada el anticuerpo al tubo de control negativo, añada 0,5 ml de Tetramer de GalCer-PE-CD1d o 10 ml de FITC-TCR en el tubo de control positivo único. Añadir 0,5 ml de tetrámero de la galcer-PE-CD1d y 10 ml de FITC-TCR en el tubo de muestra. Incubarlos a 4oC durante 30 min en la oscuridad.
    3. Lavar las células en PBS y luego centrifugar a 200 x g durante 5 min.
    4. Deseche el sobrenadante, agregue 1 ml de Foxp3 Foxation/Permeabilization solución de trabajo, e incubar las células durante 45 minutos a 4 oC en la oscuridad.
    5. Añadir 1 ml de 1x solución de trabajo Tampón de permeabilización y centrifugar las células a temperatura ambiente durante 500 x g a temperatura ambiente durante 5 min.
    6. Descarta el sobrenadante. Añadir 1 l de ratón Anti-PLZF de Alexa Fluor 647 y 1 l de PerCP-Cy 5.5 mouse anti-T-bet (o 1 l de PerCP-Cy 5.5 mouse anti-ROR-t) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
    7. Añadir a 2 mL de solución de trabajo de tampón de permeabilización para la limpieza.
    8. Deseche el sobrenadante, resuspenda las células en 500 s de PBS y mida por citometría de flujo.
  5. Identificación funcional de células iNKT
    1. Tome 3 x 106 células iNKT del paso 2.3.7 y resuspenda en 12 placas de pozo con 1,5 ml de medio incompleto RPMI-1640 (es decir, sin suero).
    2. Añadir éster de phorbol (PMA, 50 ng/mL) y calcio de ionomicina (IO, 1 g/ml) y colocar en una incubadora deCO2 durante 24 h.
    3. Recoger el sobrenadante celular y detectar los niveles de secreción de IL-2, IL-17A, TNF-, IL-6, IL-4, IFN-o, e IL-10 utilizando un ensayo comercial CBA de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  6. Estudio experimental sobre la vía migratoria de células iNKT en ratones RA
    1. Disolver el tinte DiR (2,5 mg/ml) en DMSO.
    2. Resuspenda las células iNKT en 6 placas de pozo con medio incompleto RPMI-1640. La densidad es de 1 x 106 celdas/ml.
    3. Añadir la solución diR (5 g/mL) e incubar en una incubadora de CO2 durante 25 min.
    4. Lavar con PBS y resuspender las células (3 x 106/300 l) para obtener células iNKT etiquetadas con DiR (DiR-iNKT).
    5. Inyectar un 1% de pentobarbital sódico (50 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal para anestesiar a los ratones. Los ratones anestesiados adecuadamente no muestran una retirada de la pata trasera hasta pellizcar el dedo del dedo del pies. Aplique pomada veterinaria en los ojos del ratón para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia para la toma de imágenes.
    6. Inyectar células DiR-iNKT 3 x 106 por ratón en la vena de la cola con el modelo RA durante 8 días. Supervise las células iNKT en ratones después de la inyección durante 0 min, 10 min, 30 min, 60 min y día 0 (después de 3 h), 1, 3, 6, 12, 26, 34, 38 y 42 días utilizando un pequeño sistema de imágenes in vivo animal (IVIS). La longitud de onda de excitación utilizada era de 748 nm, la longitud de onda de emisión era de 780 nm y el tiempo de exposición era automático.
    7. Coloque cada ratón en una jaula separada después de cada observación y mantenga la recumbencia esternal. Observar hasta la recuperación de la anestesia.

3. Evaluación de la Inmunoterapia Adoptiva de Ratones RA con Células iNKT

  1. inmunoterapia adoptiva de células iNKT para ratones RA
    1. Inyectar 3 x 106 células iNKT células por ratón a través de la vena de la cola. Seleccione aleatoriamente 15 ratones que fueron modelados 8 días antes y obtenga células iNKT sin etiquetado DiR del paso 2.3.7 por la infusión de la vena de la cola.
  2. Evaluar la eficacia de la inmunoterapia adoptiva para células iNKT.
    1. Mida el grosor de la pata del ratón, cuantifique la hinchazón de la articulación del tobillo y puntúe sistemáticamente después de la perfusión de células iNKT como se describe en los pasos 1.2.1–1.2.2.
    2. Observe la infiltración de células inflamatorias y los cambios articulares de las articulaciones del ratón como se describe en el paso 1.2.3.
    3. Determinar los niveles de secreción de IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-o, e IFN-o como se describe en el paso 1.2.4.
  3. Determine la frecuencia de las celdas y subconjuntos iNKT.
    1. Aísle el timo del ratón y prepare una suspensión de una sola célula.
    2. Separe los linfocitos con líquido de separación de linfocitos.
    3. Determine la frecuencia de celda iNKT y la frecuencia de los subgrupos como se describe en el paso 2.4.
  4. Análisis estadístico
    NOTA: Todos los datos se presentan como medias : Valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
    1. Utilice el análisis de un factor de varianza (ANOVA). Si se cumple la varianza, utilice la prueba LSD para una comparación adicional.
    2. Si la varianza no es uniforme, utilice la prueba no paramétrica. Utilice la prueba Kruskal-Wallis H para una comparación adicional31.

Resultados

La puntuación del índice de artritis y el grosor de la pata aumentaron después del modelado. En comparación con el grupo de control, los dedos del grupo modelo RA comenzaron a mostrar hinchazón roja a los 6 días después del modelado, con agravamiento gradual. A los 14 días, la hinchazón roja en la articulación del tobillo alcanzó su punto máximo, seguido de un alivio gradual. El grosor de la pata cambió de forma similar (P < 0.05) (Figura 1).

Discusión

Las células iNKT son células T especiales que unen inmunidad innata y adaptativa y se desarrollan principalmente a partir de CD4++/ CD8+ timocitos. Las células iNKT tienen diversas funciones inmunorreguladoras e interactúan con otras células inmunitarias por contacto directo y secreción de diferentes citoquinas23,afectando a las células dendríticas (CC), macrófagos, neutrófilos, células B, células T y diferenciación y desarrollo de célula...

Divulgaciones

Los autores no declaran financiación ni conflictos de intereses.

Agradecimientos

Nuestro estudio fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Colleges and university's key research project of Hebei province (ZD2017009) y el Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University. Estamos agradecidos por su apoyo.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZFBD563490America
Anti-PE MicroBeadsMiltenyi130-048-801Germany
ColumnsMiltenyiMSGermany
Cryogenic CentrifugeBeckmanAllegra® X-15RAmerica
DiRThermo Fisher ScientificD12731America
Embedding CenterTianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.BMJ-1China
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β ChainBD553170America
Flow cytometerBDAccuri C6America
Freund's complete adjuvantSigmaF5881America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)Karebay Biochem18062202China
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)Karebay Biochem18062203China
In Vivo Imaging SystemPerkinElmercaliper IVIS lumina IIAmerica
Ionomycin CalciumCayman10004974America
KRN7000AdipoGenAG-CN2-0013America
Mouse CD1d Tetramer-PEMBLTS-MCD-1Japan
Mouse percollSolarbioP8620China
Optical MicroscopeOlympusOlympus-IIJapan
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒtBD562683America
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-betBD561316America
Pertussis toxinSigmaP7208America
phorbol estersCayman10008014America
Red Blood Cell Lysis BufferBD555899America
RPMI-1640Biological Industries01-100-1ACSIsrael
Th1/Th2/Th17 cytokines kitBD560485America
UltramicrotomeLeicaLeica EM UC6Germany

Referencias

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