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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este protocolo usa peptídeos mistos G6PI para construir modelos de artrite reumatoide que estão mais próximos do da artrite reumatoide humana em células CD4+ T e citocinas. Células T assassinas naturais invariantes de alta pureza (principalmente iNKT2) com fenótipos e funções específicas foram obtidas por indução in vivo e purificação in vitro para imunoterapia adotiva.

Resumo

Artrite reumatoide (RA) é uma doença inflamatória crônica autoimune complexa. A patogênese da doença está relacionada com células invariantes assassinas naturais T (iNKT). Pacientes com RA ativa apresentam menos células iNKT, função celular defeituosa e polarização excessiva de Th1. Neste estudo, foi estabelecido um modelo animal RA utilizando uma mistura de hGPI325-339 e hGPI469-483 peptídeos. As células iNKT foram obtidas por indução in vivo e purificação in vitro, seguidas de infusão em camundongos RA para imunoterapia adotiva. O rastreamento do sistema de imagem in vivo (IVIS) revelou que as células iNKT foram distribuídas principalmente no baço e fígado. No dia 12 após a terapia celular, a progressão da doença desacelerou significativamente, os sintomas clínicos foram aliviados, a abundância de células iNKT no timo aumentou, a proporção de iNKT1 no timo diminuiu, e os níveis de TNF-α, IFN-γ, e IL-6 em o soro diminuiu. A imunoterapia adotiva das células iNKT restaurou o equilíbrio das células imunes e corrigiu a inflamação excessiva do corpo.

Introdução

A artrite reumatoide (RA) é uma doença autoimune caracterizada por incomodade crônica e progressiva com incidência de 0,5 a 1%1,2. A patogênese subjacente é atribuída à proliferação anormal das células CD4+ e CD8+ T, manifestadas por um aumento na proporção de células CD4+IFN-γ+ e CD4+IL-17A+ T, e o número reduzido de células CD4+IL-4+ e CD4+CD25+FoxP3+ T. Portanto, a secreção de citocinas inflamatórias é aumentada, e uma reação inflamatória excessiva destrói o equilíbrio nativo e a função de tolerância do sistema imunológico do corpo. Além disso, o ajudante T linfócito (Th) 1 células que penetram na articulação agravam a resposta inflamatória e danos articulares. Portanto, a inibição da resposta inflamatória excessiva e da restauração da tolerância imunológica e do equilíbrio imunológico são fundamentais para o tratamento de RA3,4.

As células iNKT têm funções e características das células NK e t. As células iNKT abrigam uma cadeia de células T distintae e invariante (TCR) com repertórios limitados de β-cadeia TCR5 e reconhecem o antígeno glicolipídico apresentado pelo maior complexo de histocompatibilidade (MHC) classe I CD1d na superfície das células presentes em antígenos. Mitsuo et al.6 detectaram um grande número de células iNKT e defeitos funcionais em muitas doenças autoimunes, incluindo ra. Aurore et al.7 demonstraram que as células iNKT têm um efeito positivo na manutenção da tolerância autoimune e que quando o número e a função das células iNKT são restaurados, a doença é aliviada. Além disso, Miellot-Gafsou et al.8 descobriram que as células iNKT não só revogaram a doença, mas também aumentaram a progressão da doença. Esses resultados contraditórios sugerem que as células iNKT são células T heterogêneas, e a função de diferentes subconjuntos pode ser revertida. Em um estudo clínico de RA, a frequência de células iNKT correlacionada com o escore da atividade da doença9. Os resultados também confirmaram que a frequência do iNKT foi reduzida em pacientes com RA, o número de subconjuntos de células CD4+IFN-γ+ T aumentou, e os níveis secretos de citocinas inflamatórias IFN-γ e TNF-α aumentaram10,11. Além disso, Sharif et al.12 investigados diabetes tipo 1 (T1D) e descobriram que a infusão seletiva de células iNKT upregulamentou a expressão da citocina inflamatória IL-4, manteve a tolerância imune e impediu o desenvolvimento do diabetes tipo 1. Portanto, a infusão adotiva de células iNKT específicas ou ativação direcionada de células iNKT aumenta o nível de células iNKT em pacientes com RA, o que pode ser um avanço no tratamento de RA.

A imunoterapia celular é atualmente de grande interesse e tem sido amplamente utilizada na terapia contra o câncer. No entanto, as células iNKT são células imunoreguladoras raras e heterogêneas (apenas 0,3% do número total de PBMCs)13, o que limita potenciais aplicações clínicas. Essas células são divididas principalmente em três subpopulações: 1) células iNKT1, que têm uma alta expressão de proteína promielocítica de zinco -finger protein (PLZF) e fator de transcrição t-box (T-bet); 2) células iNKT2 com expressão intermediária de PLZF e proteína de ligação GATA 3 (GATA3); 3) células iNKT17 com baixa expressão de PLZF e receptor nuclear órfão relacionado a retinóides (ROR)-γt que secretam IFN-γ, IL-4 e IL-1714. Células iNKT ativadas secretam citocinas semelhantes a Th1, Th2 e Th17, que determinam os diferentes efeitos imunomodulatórios das células iNKT15. Os efeitos imunomodulatórios e imunoterapêuticos da ativação específica de várias subpopulações de células iNKT são diferentes. Portanto, a seleção de fenótipos específicos de células iNKT (principalmente iNKT2) com funções anti-inflamatórias para regular a resposta imune do corpo pode corrigir o desequilíbrio imunológico e as doenças imunológicas em RA.

O estabelecimento de um modelo animal ideal é de grande importância para o tratamento e estudo da patogênese ra. Atualmente, os modelos animais mais usados e maduros incluem artrite induzida por colágeno, artrite adjuvante, artrite induzida por zimosan e artrite induzida por polissacarídeo16–17. No entanto, não há um modelo que possa simular totalmente todas as características do RA humano. Artrite induzida por colágeno tipo II (CIA) é um modelo clássico de artrite. A CIA é induzida pela imunização de camundongos com anticorpos monoclonais específicos de colágeno tipo II, refletindo a dependência de anticorpos desse modelo da doença. Benurs et al. descreveram um modelo com uma resposta imune sistêmica à isomerase glicose-6-fosfato (G6PI), que induz poliartrite simétrica periférica em cepas de camundongos suscetíveis18,19. Nesse modelo, o desenvolvimento da artrite depende de células T, células B e imunidade inata18,19,20. Horikoshi21 descobriu que os modelos RA resultantes da imunização de camundongos DBA/1 com fragmentos de polipeptídeo G6PI são mais semelhantes ao RA humano em termos de células CD4+ T e citocinas (ou seja, IL-6 e TNF-α) do que os modelos da CIA. Para aumentar o efeito estimulante no local de reconhecimento do TCR, os fragmentos de polipeptídeo misto do G6PI (hGPI325-339 e hGPI469-483) foram usados para imunizar camundongos DBA/1 para construir o modelo de camundongora RA. A taxa de sucesso dessa abordagem pode ser alta porque hGPI325-339 e hGPI469-483 são imunodominantes para respostas de células T restritas a Q I-A. Portanto, este modelo pode simular a superproliferação de células CD4+ T e defeitos celulares iNKT em pacientesRA 22. A pesquisa básica da imunopatologia ra estabeleceu as bases para nossa investigação mais aprofundada.

Protocolo

Todos os camundongos experimentais (150 no total) eram camundongos saudáveis de DBA/1 masculino, 6-8 semanas de idade (20,0 ± 1,5 g), criados em um ambiente específico sem patógenos (FPS). Não há tratamento especial antes de ser modelo. O experimento foi dividido em um grupo de controle saudável (15 camundongos), um grupo de controle de modelos (15 camundongos) e um grupo de terapia celular (55 camundongos). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Bem-Estar Animal e Ética da Universidade hebei.

1. Construindo o Modelo da Doença

  1. Duplicando o modelo animal RA
    1. Pesar 1,75 mg de hG6PI 325-339 e hG6PI 469-483 fragmentos e dissolvê-los em 5,25 mL de 4 °C de água destilada tripla.
    2. Dissolva o adjuvante completo da Freund (CFA) em um banho de água de 50 °C, desenhe 5,25 mL em outro tubo de centrífuga de 10 mL e esfrie-o para uso.
    3. Coloque a mistura de solução hG6PI e solução CFA em uma unidade de emulsificação artificial com duas seringas de vidro conectadas.
    4. Empurre a seringa a uma velocidade e frequência constantes de 10-20x por min para emulsificar completamente a solução de peptídeo misto e a solução CFA. Realize a operação em um banho de gelo, e mantenha as gotículas de emulsão na água por 10 min após a conclusão da emulsificação sem dispersão.
    5. Injete 150 μL de hG6PIs emulsificados na raiz da cauda do mouse subcutâneamente.
    6. Injete 200 mg de toxina de Pertussis no mouse intraperitonely a 0 h e 48 h após a injeção hG6PI.
  2. Verificação experimental do modelo RA
    1. Meça a espessura da pata do rato com uma pinça Vernier (2x por dia).
    2. Observe e marque o grau de vermelhidão e inchaço do pé. Use os seguintes critérios de pontuação: 1) dedos com leve inchaço; 2) pedis dorsum e almofada de pé com inchaço vermelho claro; 3) tornozelo com inchaço vermelho.
    3. Eutanizar os camundongos anestesia profunda por injeção intraperitoneal de 1% de pentobarbital de sódio (50 mg/kg de peso corporal) 14 dias após a modelagem e remover as patas para a coloração de HE.
    4. Determine os níveis de secreção do soro IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-α e IFN-γ usando um ensaio de matriz de bead citométrica comercial (CBA) de acordo com o protocolo do fabricante.

2. Obtenção de células iNKT com terapia celular adotiva

  1. Indução direcional de células iNKT
    1. Injete camundongos normais intraperitoneicamente com α-GalCer (0,1 mg/kg de peso corporal).
  2. Isolamento de células iNKT
    1. Três dias após a modelagem, injete camundongos intraperitonealmente com 1% pentobarbital de sódio (50 mg/kg de peso corporal) para anestesia. Ratos adequadamente anestesiados não mostram uma resposta de retirada da pata traseira a uma pitada de dedo do pé.
    2. Isole o baço de um mouse DBA/1 depois de injetá-lo intraperitoneticamente com α-GalCer. Prepare uma única suspensão celular cortando e moendo o baço em uma peneira de malha de 200.
    3. Lave a suspensão celular com PBS, centrífuga a 200 x g por 5 min, e descarte o supernatante. Repetir.
    4. Resuspenda as células com 1 mL de solução de diluição de sangue inteiro e tecido. Adicione 3 mL de meio de separação de linfócitos de camundongos e, em seguida, centrífuga as células por 20 min a 300 x g à temperatura ambiente.
    5. Colete a camada de linfócitos brancos leitosos (ou seja, a segunda camada da parte superior), lave-a 2x com PBS e conte com um contador de células automatizado.
  3. Estratégia de seleção positiva de classificação celular ativada magnética (MACS)para purificação de células iNKT
    NOTA: Para o pré-tratamento dos tetramers CD1d, 1 mg/mL de α-Galcer foi diluído a 200 μg/mL com 0,5% de Tween-20 e 0,9% da NaCl, e 5 μL da solução resultante foi adicionado a 100 μL da solução tetramer CD1dd. A mistura foi incubada por 12h à temperatura ambiente e colocada a 4 °C para uso. O tCR β foi diluído 80x com água deionizada. Todos os outros anticorpos foram usados como solução de estoque.
    1. Resuspender 107 células com 100 μL de PBS 4 °C, adicionar 10 μL de CD1d Tetramer-PE carregado α-GalCer, e incuba-las a 4 °C por 15 min no escuro.
    2. Lave as células 2x com PBS e resuspenda-as em 80 μL de PBS.
    3. Adicione 20 μL de anti-PE-MicroBeads e incuba-as a 4 °C por 20 min no escuro.
    4. Lave-os 2x com PBS e resuspenda as células com 500 μL de PBS.
    5. Coloque a coluna de classificação no campo magnético do macs sorter e enxágue com 500 μL de PBS.
    6. Adicione a suspensão celular da etapa 2.3.4 à coluna de classificação, colete o fluxo e enxágue 3x com tampão PBS.
    7. Remova o campo magnético e colete as células da coluna de classificação. Neste ponto, adicione 1 mL de tampão PBS à coluna de classificação, e empurre rapidamente o êmbolo a uma pressão constante para levar as células rotuladas para o tubo de coleta e obter células iNKT purificadas. Conte com um contador de celular automatizado.
  4. Identificação do fenótipo celular iNKT
    1. Tome 1 x 106 células das etapas 2.2.5 e 2.3.7, respectivamente, e resuspenda-as em 50 μL de PBS.
    2. Incubação anticorpo: Não adicione o anticorpo ao tubo de controle negativo, adicione 0,5 μL de α-GalCer-PE-CD1d Tetramer ou 10 μL de β FITC-TCR no único tubo de controle positivo. Adicione 0,5 μL de α-GalCer-PE-CD1d tetramer e 10 μL de fitc-TCR β no tubo de amostra. Incuba-os a 4 °C por 30 min no escuro.
    3. Lave as células na PBS e, em seguida, centrífuga a 200 x g por 5 min.
    4. Descarte o supernatante, adicione 1 mL da foxation/solução de trabalho foxp3/permeabilização, e incuba rastizar as células por 45 min a 4 °C no escuro.
    5. Adicione 1 mL de 1x solução de trabalho buffer de permeabilização e centrífuga as células em temperatura ambiente por 500 x g em temperatura ambiente por 5 min.
    6. Descarte o supernatante. Adicione 1 μL de Alexa Fluor 647 mouse Anti-PLZF e 1 μL de perCP-Cy 5.5 mouse anti-T-bet (ou 1 μL de PerCP-Cy 5.5 mouse anti-RORΥt) por 30 min à temperatura ambiente no escuro.
    7. Adicione a 2 mL da solução de trabalho buffer de permeabilização para limpeza.
    8. Descarte o supernatante, resuspenda as células em 500 μL de PBS e meça por citometria de fluxo.
  5. Identificação funcional de células iNKT
    1. Tome 3 x 106 células iNKT a partir da etapa 2.3.7 e resuspenda-as em 12 placas de poço com 1,5 mL de RPMI-1640 incompleto médio (ou seja, sem soro).
    2. Adicione phorbol ester (PMA, 50 ng/mL) e ionomicina de cálcio (IO, 1 μg/mL) e coloque em uma incubadora de CO2 por 24 h.
    3. Colete o supernatant celular e detecte os níveis de secreção de IL-2, IL-17A, TNF-α, IL-6, IL-4, IFN-γ e IL-10 usando um ensaio comercial da CBA de acordo com o protocolo do fabricante.
  6. Estudo experimental sobre a via migratória de células iNKT em camundongos RA
    1. Dissolva dir dye (2,5 mg/mL) em DMSO.
    2. Resuspender as células iNKT em 6 placas de poço com rpmI-1640 incompleto médio. A densidade é de 1 × 106 células/mL.
    3. Adicione a solução DiR (5 μg/mL) e incuba em uma incubadora de CO2 por 25 min.
    4. Lave com PBS e resuspenda as células (3 x 106/300 μL) para obter células iNKT com rótulo diR (DiR-iNKT).
    5. Injete 1% de pentobarbital de sódio (50 mg/kg de peso corporal) intraperitoneicamente para anestesiar os camundongos. Ratos adequadamente anestesiados não mostram uma retirada da pata traseira para beliscar os dedos dos dedos. Aplique pomada veterinária aos olhos do camundongo para evitar a secura enquanto estiver anestesia para imagem.
    6. Injete as células DiR-iNKT 3 x 106 por mouse na veia traseira com o modelo RA por 8 dias. Monitore as células iNKT em camundongos pós-injeção por 0 min, 10 min, 30 min, 60 min e dia 0 (após 3 h), 1, 3, 6, 12, 26, 34, 38 e 42 dias usando um animal pequeno no sistema de imagem vivo (IVIS). O comprimento de onda de excitação usado foi de 748 nm, o comprimento de onda de emissões era de 780 nm, e o tempo de exposição era automático.
    7. Coloque cada rato em uma gaiola separada após cada observação e mantenha a rerecência esnaciada. Observe até a recuperação da anestesia.

3. Avaliação da Imunoterapia Adotiva de Camundongos RA com células iNKT

  1. Imunoterapia adotiva celular iNKT para ratos RA
    1. Injete 3 x 106 células células iNKT células por mouse através da veia traseira. Selecione aleatoriamente 15 ratos que foram modelados 8 dias antes e obtenham células iNKT sem rotulagem DiR a partir da etapa 2.3.7 pela infusão da veia traseira.
  2. Avalie a eficácia da imunoterapia adotiva para células iNKT.
    1. Meça a espessura da pata do camundongo, quantifique o inchaço da articulação do tornozelo e escore sistematicamente após a infusão de células iNKT como descrito nos passos 1.2.1-1.2.2.
    2. Observe a infiltração celular inflamatória e as alterações articulares das articulações do camundongo, conforme descrito na etapa 1.2.3.
    3. Determine os níveis de secreção de IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-α e IFN-γ como descrito na etapa 1.2.4.
  3. Determine a frequência de células e subconjuntos iNKT.
    1. Isole o tímo do rato e prepare uma suspensão de uma única célula.
    2. Separe os linfócitos com fluido de separação linfócito.
    3. Determine a frequência celular iNKT e a frequência do subgrupo conforme descrito na etapa 2.4.
  4. Análise estatística
    NOTA: Todos os dados são apresentados como média ± Valores sd. de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
    1. Use uma análise de um fator de variância (ANOVA). Se a variância estiver satisfeita, use o teste LSD para maior comparação.
    2. Se a variância não for uniforme, use o teste não paramétrico. Use o teste Kruskal-Wallis H para comparação adicional31.

Resultados

A pontuação do índice de artrite e a espessura da pata aumentaram após a modelagem. Em comparação com o grupo controle, os dedos do grupo modelo RA começaram a mostrar inchaço vermelho em 6 dias após a modelagem, com agravamento gradual. Aos 14 dias, o inchaço vermelho na articulação do tornozelo atingiu o pico, seguido de alívio gradual. A espessura da pata mudou de forma semelhante (P < 0,05) (Figura 1).

A infiltração celular inflamatóri...

Discussão

As células iNKT são células T especiais que fazem a ponte imunidade inata e adaptativa e são desenvolvidas principalmente a partir de CD4++/CD8+ thymocytes. As células iNKT têm funções imunoregulatórias diversas e interagem com outras células imunes por contato direto e secreção de diferentes citocinas23, afetando células dendríticas (DCs), macrófagos, nêutrons, células B, células T e diferenciação e desenvolvimento celular NK

Divulgações

Os autores declaram que não há financiamento ou conflitos de interesse.

Agradecimentos

Nosso estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de CiênciaNatural da China (NSFC) (81771755), Colleges and university's key research project of Hebei province (ZD2017009) e o Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University. Somos gratos pelo apoio deles.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZFBD563490America
Anti-PE MicroBeadsMiltenyi130-048-801Germany
ColumnsMiltenyiMSGermany
Cryogenic CentrifugeBeckmanAllegra® X-15RAmerica
DiRThermo Fisher ScientificD12731America
Embedding CenterTianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.BMJ-1China
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β ChainBD553170America
Flow cytometerBDAccuri C6America
Freund's complete adjuvantSigmaF5881America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)Karebay Biochem18062202China
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)Karebay Biochem18062203China
In Vivo Imaging SystemPerkinElmercaliper IVIS lumina IIAmerica
Ionomycin CalciumCayman10004974America
KRN7000AdipoGenAG-CN2-0013America
Mouse CD1d Tetramer-PEMBLTS-MCD-1Japan
Mouse percollSolarbioP8620China
Optical MicroscopeOlympusOlympus-IIJapan
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒtBD562683America
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-betBD561316America
Pertussis toxinSigmaP7208America
phorbol estersCayman10008014America
Red Blood Cell Lysis BufferBD555899America
RPMI-1640Biological Industries01-100-1ACSIsrael
Th1/Th2/Th17 cytokines kitBD560485America
UltramicrotomeLeicaLeica EM UC6Germany

Referências

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