JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

En este protocolo, los linfocitos se colocan en la cámara superior de un sistema de transmigración, separados de la cámara inferior por una membrana porosa. La quimiocina se añade a la cámara inferior, lo que induce la migración activa a lo largo de un gradiente de quimiocina. Después de 48 h, los linfocitos se cuentan en ambas cámaras para cuantificar la transmigración.

Resumen

Aquí, presentamos un método eficiente que se puede ejecutar con habilidades básicas de laboratorio y materiales para evaluar el movimiento quimiocinético de linfocitos en un sistema de transmigración ex vivo. Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) y las células auxiliares CD4+ T se aislaron de los bazos y los pulmones de los ratones BALB/c con problemas de óvulos de huevo de pollo (OVA). Confirmamos la expresión de CCR4 tanto en células CD4+ T como en ILC2, comparativamente. CCL17 y CCL22 son los ligandos conocidos para CCR4; por lo tanto, utilizando este método de transmigración ex vivo examinamos el movimiento inducido por CCL17- y CCL22 de CCR4+ linfocitos. Para establecer gradientes de quimiocina, CCL17 y CCL22 se colocaron en la cámara inferior del sistema de transmigración. Luego se añadieron linfocitos aislados a las cámaras superiores y durante un período de 48 h los linfocitos migraron activamente a través de poros de 3 m hacia la quimiocina en la cámara inferior. Este es un sistema eficaz para determinar la quimiocinética de los linfocitos, pero, comprensiblemente, no imita las complejidades que se encuentran en los microambientes de órganos in vivo. Esta es una limitación del método que puede superarse mediante la adición de imágenes in situ del órgano y los linfocitos en estudio. Por el contrario, la ventaja de este método es que puede ser realizado por un técnico de nivel de entrada a una tasa mucho más rentable que las imágenes en vivo. A medida que los compuestos terapéuticos están disponibles para mejorar la migración, como en el caso de las células inmunitarias citotóxicas infiltrantes del tumor, o para inhibir la migración, tal vez en el caso de enfermedades autoinmunes donde la inmunopatología es preocupante, este método puede ser utilizado como herramienta de selección. En general, el método es eficaz si la quimiocina de interés está generando constantemente quimiocinética a un nivel estadísticamente más alto que el control de los medios. En tales casos, el grado de inhibición /mejora por un compuesto dado puede ser determinado también.

Introducción

Este método de transmigración original fue presentado por Stephen Boyden en 1962 en el Journal of Experimental Medicine1. Gran parte de lo que sabemos sobre la quimiotaxis y la quimioquinética no sería posible sin el desarrollo de la cámara Boyden. Antes del descubrimiento de la primera quimiocina en 1977, se utilizaban sistemas de transmigración ex vivo para aprender sobre factores séricos que podrían detener el movimiento celular en los macrófagos mientras amplificaban la motilidad celular en neutrófilos1,2. Una enorme riqueza de conocimiento se ha desarrollado con respecto a la migración de células inmunitarias, y hasta la fecha, 47 quimioquinos se han descubierto con 19 receptores correspondientes3,4. Además, multitud de inhibidores/potenciadores de estas vías de quimiocina han sido objeto de desarrollo con fines terapéuticos5,6,7,8. Muchos de esos compuestos se han probado en cámaras de transmigración similares para entender las interacciones directas entre los compuestos y la capacidad de respuesta de las células inmunes a una quimiocinadada 9.

La transmigración, o diapedesis, al tejido inflamado es un proceso esencial para una respuesta inflamatoria saludable para eliminar la infección10,11. Una cámara Boyden, un sistema de transmigración o un aparato transwell se componen generalmente de dos cámaras separadas por una membrana porosa1,12. La cámara inferior a menudo contiene medios que contienen la quimiocina de interés, mientras que los leucocitos se colocan en la cámara superior. El tamaño del poro en la membrana se puede seleccionar en función del tamaño de la célula de interés. Para este proyecto, seleccionamos una membrana porosa de 3 m, ya que las células linfoides tienen un tamaño de 7-20 m, dependiendo de la etapa de desarrollo celular. Este tamaño de los poros asegura que estas células no están cayendo pasivamente a través de los poros, sino que están migrando activamente en respuesta al gradiente de quimiocina.

La principal ventaja de este protocolo es su rentabilidad. La transmigración in vivo es difícil porque requiere un amplio entrenamiento en manejo de animales y cirugía, y a menudo implica microscopía de alta potencia que no siempre está disponible para un investigador. El cribado rentable de compuestos que se cree que mejoran o inhiben la transmigración se puede realizar antes de la toma de imágenes in vivo. Debido a que el sistema de transmigración está estrechamente controlado, las células pueden ser tratadas inicialmente y luego añadidas al aparato transwell, o, viceversa, la quimiocina puede ser tratada primero con un inhibidor de la quimiocina y luego las células añadidas al aparato transwell. Por último, las células endoteliales y/o las proteínas de membrana del sótano se pueden agregar a la parte inferior del inserto transwell 1-2 días antes del experimento de transmigración para entender la implicación de estas células de barrera en la quimiocinética. Una vez más, estas manipulaciones del sistema proporcionan un poderoso medio de determinar información importante sobre la eficacia de un compuesto dado antes de estudios in vivo más complicados.

El uso de un sistema de cámara de transmigración es una forma eficaz de evaluar la movilidad de los linfocitos en diversas condiciones in vivo e in vitro12,13,14. Aquí, describimos un método optimizado para evaluar la capacidad de respuesta de los linfocitos ex vivo a las quimioquinas en una cámara de transmigración. En este experimento de ejemplo, las células CD4+ T y las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) se aislaron de machos y hembras, ratones BALB/c después de la exposición a los alérgenos de OVA. Se generó la hipótesis de que CCR4+ CD45+ Lineage- (LIN-) ILC2 de ratones con alérgenos migrarían más eficientemente hacia CCL17 y CCL22 que las células auxiliares CCR4+ CD4+ T. CCL17 y CCL22 son quimiolinas comúnmente producidas por células dendríticas y macrófagos del fenotipo M2 (alérgico), entre otras células, en alergia15,16. CCL17 y CCL22 pueden considerarse biomarcadores de inflamación alérgica, ya que se detectan fácilmente en los pulmones durante las exacerbaciones de las vías respiratorias16,17,18. Es importante destacar que la expresión CCR4 es elevada en comparación con los controles no tratados, como se revela en los datos bioinformáticos generados a partir de ILC2 aislados de animales tratados con ácaros del polvo de la casa, y de manera similar ILC2 de animales ingenuos tratados ex vivo con IL-33 ( alérgenos que promueven la citoquina innata) upregulates CCR419,20. Además, según los datos de ILC2 en la base de datos del Proyecto Genoma Inmunológico (www.immgen.org), el ARNm CCR4 está muy expresado en estas células inmunitarias innatas. Hasta la fecha, poco se sabe con respecto al tráfico de ILC2 en los tejidos, pero es probable que las células ILC2 y CD4+ T utilicen quimioquinas y receptores similares para la quimiotaxis y quimiocinética, ya que expresan factores de transcripción y receptores similares. Por lo tanto, comparamos CCL17 frente a la capacidad de respuesta CCL22, de linfocitos ILC2 y CD4+ T, tanto de animales machos como de mujeres, con problemas de OVA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí fueron revisados y aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska (UNMC) y la Universidad de Utah.

1. Configuración y preparación de reactivos

  1. Prepare los medios completos de RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
    1. Añadir 10 ml de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor a 90 ml de RPMI.
    2. Añadir 1 mL de 100x Penicilina-Streptomicina-Glutamina a 100 mL de 10% FBS RPMI.
  2. Prepare los medios de expansión ILC2.
    1. Agregue IL-2 e IL-33 (20 ng/mL cada citoquina) a 10 mL de RPMI completo.
    2. Si las citoquinas de stock son de 10 g/ml, la pipeta de 20 ml de IL-2 e IL-33 en un tubo de 15 ml que contiene 10 ml de medios RPMI completos.
  3. Preparar el medio de disociación pulmonar.
    1. Añadir 50 mg de colagenasa tipo 1 a 250 ml de RPMI no suplementada.
    2. Añadir 2,5 ml de 100x penicilina-estreptomicina-glutamina a los 250 ml de medios en el paso 1.3.1.
    3. Mezcle suavemente el medio para asegurarse de que el tipo 1 de la colagenasa se disuelva por completo antes de su uso.
  4. Prepare RPMI sin suero.
    1. Diluir 1 g de albúmina sérica bovina liofilizada (BSA) en 200 ml de RPMI.
    2. Añadir 2 ml de 100x penicilina-estreptomicina-glutamina.
    3. Mezcle suavemente el soporte para asegurarse de que el BSA se disuelve completamente en el medio antes de su uso.
  5. Prepare el medio de migración con CCL17.
    1. Adquiera 10 ml de RPMI sin suero y agregue CCL17 [50 ng/mL].
      1. Si el stock CCL17 es de 10 g/ml, añada 50 ml de material CCL17 a 10 ml de medios RPMI libres de suero.
  6. Prepare el medio de migración con CCL22.
    1. Adquiera 10 ml de RPMI sin suero y agregue CCL22 [50 ng/mL].
    2. Si el stock CCL22 es de 10 g/ml, añada 50 ml de material CCL22 a 10 ml de medios RPMI libres de suero.
  7. Preparar CCR4 Anticuerpo Staining Cocktail.
    1. Para un total de 10 pruebas, añada 5 ml de cada uno de los siguientes anticuerpos a un tubo de 5 ml: CCR4 antiratón, CD19, CD11b, CD45, ST2 e ICOS.
      NOTA: Ejemplo de cómo hacer un cóctel de anticuerpos para 10 muestras: 0,5 l de cada anticuerpo x 10 muestras a 5 l de cada uno de los anticuerpos enumerados en 1.7.1.
    2. Para un total de 10 pruebas, añada 2,5 l de los siguientes anticuerpos al cóctel de anticuerpos del paso 1.7.1: CD3 antiratón, CD11c y NK1.1.
      NOTA: Ejemplo para completar el cóctel de anticuerpos para 10 muestras: 0,25 l x 10 muestras a 2,5 ml de anticuerpos CD3, CD11c y NK1.1.
    3. Almacene el cóctel de tinción de anticuerpos CCR4 a 4 oC hasta que esté listo para añadir a las muestras. Deseche el cóctel de anticuerpos después de 1 semana si no se utiliza.
  8. Prepare 1x Fijante Estabilizador.
    1. Añadir 10 ml de agua destilada desionizada a 5 ml de concentrado fijador estabilizador 3x

2. Preparación de ratones BALB/c con problemas de alérgenos

NOTA: Los ratones BALB/c masculinos y femeninos fueron comprados a Charles River (UNMC) o Jackson Laboratories (Universidad de Utah) a las 6 a 8 semanas de edad.

  1. Después de la aclimatación (1 semana), sensibilizar a todos los animales a LA OVA.
    1. Combine 100 g/ml de OVA adsorbido con hidróxido de aluminio (20 mg/ml) en un tubo de poliestireno de 5 ml.
    2. Mezcle el tubo y extraiga inmediatamente 500 ml de la suspensión ova-alum en una jeringa de 1 ml y 28 G (jeringa de insulina).
    3. Coloque un ratón en un frasco de campana que contenga isoflurano (1-2 ml bajo un piso falso, de modo que el animal no esté de pie directamente en isoflurano). Permita que el ratón se someta a anestesia durante aproximadamente 1-2 min, o hasta que la tasa de respiración baje.
    4. Recoja rápidamente el ratón por el pelaje en la espalda y los hombros e inyecte 100 ol de ova-alumnalmente por ratón21,22.
    5. Coloque el ratón de nuevo en su jaula y observe para asegurarse de que recuperan la movilidad; esto debe ocurrir dentro de 2-5 min.
  2. Siete días después de la sensibilización, someta a todos los animales a ova intranasal (i.n.) 1,5% de OVA diluido en solución salina estéril en una cámara de nebulización (Data Sciences International) durante 20 min.
    1. Retire los ratones de sus jaulas y colóquelos en la cámara de nebulización animal. Cierre la tapa de la cámara.
    2. Fije la manguera de nebulización a la boquilla de entrada en la cámara de nebulización.
    3. Añadir 30 ml de 1,5% de OVA diluido en solución salina estéril a la copa de nebulización en el nebulizador.
    4. Encienda el nebulizador y deje que la cámara se llene de niebla durante 20 minutos.
    5. Apague el nebulizador y deje que la niebla se asiente.
    6. Devolver animales a sus jaulas.
  3. Repita el paso 2.2 para un total de 5 veces, en 5 días consecutivos, para inducir inflamación alérgica.

3. Aislamiento de células CD4+ T de bazos y pulmones de ratones con problemas de OVA

  1. Eutanasia humanamente todos los animales machos y hembras tratados con OVA mediante asfixia porCO2 de acuerdo con los protocolos aprobados de la IACUC, utilizando de 2 a 3 animales por grupo, por experimento.
  2. Exibar los pulmones y los bazos de los animales y colocar los tejidos en tubos de disociación separados en función del tipo de tejido y el sexo del animal23.
  3. Disociar el tejido pulmonar en 500 ml de medios de disociación pulmonar (25 U/ml; colagenasa, tipo 1) en el disociador de tejido automatizado utilizando el protocolo 'pulmón'.
    1. Repita 3.2 y 3.3 un total de dos veces.
  4. Disociar tejido de bazo en 500 ml de medios RPMI completos utilizando el protocolo 'spleen' en el disociador de tejido automatizado.
    NOTA: Los pasos restantes deben realizarse en un gabinete de seguridad biológica utilizando una técnica estéril.
  5. Enjuague los tubos de disociación que contienen los homogeneizados pulmonar y del bazo con 5 ml de medios adicionales de disociación pulmonar o RPMI completa, respectivamente.
  6. Filtrar las suspensiones celulares a través de un colador de células de 40 m y recoger en tubos cónicos de 50 ml.
  7. Incubar los homogeneizadores pulmonares durante 15-30 min en una incubadora de 37 oC con 5% deCO2 para disociar aún más el tejido pulmonar.
  8. Añadir 5 ml de RPMI completa al pulmón y el bazo homogeneiza y peletizar las células en la parte inferior de los tubos de 50 ml utilizando centrifugación; 378 x g a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
  9. Combine los esplenocitos y las células pulmonares en un solo tubo cónico de 50 ml y determine el recuento total de células utilizando el contador de células automatizado.
  10. Ajuste las suspensiones de células macho y hembra a 1 x 108 células/ml en tampón de separación y agréguelas a un tubo de poliestireno de 5 ml.
    NOTA: El Protocolo de Enriquecimiento se puede ajustar hasta 14 ml de tubos de poliestireno cuando se adquieren más células del bazo y los pulmones. Este protocolo fue diseñado para tejidos de 2-3 ratones por grupo; por lo tanto, un tubo de 5 ml debe ser suficiente.
  11. Utilice aproximadamente dos tercios del total de celdas para el aislamiento ILC2 de acuerdo con el protocolo de enriquecimiento ILC2.
    1. Añadir un cóctel de anticuerpos (50 l/ml) a la suspensión celular e incubar durante 5 min a RT.
    2. Vortex esferas rápidas durante 30 s y añadir a la muestra a una velocidad de 75 l /ml de suspensión celular. Mezclar e incubar suavemente durante 5 min a RT.
    3. Cubra el tubo hasta 3 ml de volumen total con tampón de separación y colóquelo en el imán de separación fácil de 8 cámaras. Incubar durante 3 min a RT.
    4. Inclinar el imán hacia adelante (lejos de los complejos de células-anticuerpos esfera adheridos a la parte posterior del tubo) y pipetear la suspensión de la célula en un tubo limpio de 5 ml.
    5. Añadir 1,5 ml de RPMI completo a los tubos y centrífuga a 378 x g durante 5 min a RT.
    6. Vierta el medio del pellet celular y resuspenda el ILC2 a 1 x 107 células por ml.
    7. Coloque 100 uL de ILC2 macho y hembra por pozo en una placa de 96 pocillos en U y agregue 100 ml de medios de expansión ILC2 a cada poca.
    8. Incubar las células durante 4-5 días para expandir el ILC2.
    9. Recoger el ILC2 en un tubo de 5 ml y añadir hasta 4,5 ml de RPMI sin suero. Centrifugar las células a 378 x g durante 5 min a RT.
    10. Cuente las células usando un hemacitómetro y resuspenda a 1 x 107 ILC2 por ml en RPMI sin suero.
  12. Utilice las celdas restantes para el procedimiento de aislamiento de celda CD4+ T, que se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo de aislamiento de celda CD4+ T del ratón con pocas modificaciones.
    1. Agregue el suero de rata (50 l/ml) a la suspensión de enriquecimiento de células T CD4.
    2. Añadir cóctel de aislamiento (50 l/ml) a la muestra e incubar durante 10 min a RT.
    3. Vortex esferas rápidas durante 30 s y añadir a la muestra a una velocidad de 75 L /ml.
    4. Mezclar suavemente la suspensión celular e incubar durante 2,5 min y RT
    5. Cubra las muestras hasta 3 ml y coloque los tubos de 5 ml en el imán de separación fácil de 8 cámaras e incubar durante 5 minutos en RT.
    6. Incline el imán hacia adelante y pipetee la suspensión celular en un tubo limpio de 5 ml.
    7. Añadir 1,5 ml de RPMI sin suero a los tubos y centrifugar a 378 x g durante 5 min a RT.
    8. Vierta el medio del pellet celular y resuspenda las células CD4+ T a 1 x 107 células por ml en RPMI sin suero.

4. Determinar la expresión CCR4 en células CD4+ T y células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) de animales con problemas de OVA por citometría de flujo

NOTA: Los siguientes pasos se pueden realizar en una mesa de trabajo abierta, ya que son técnicas no estériles.

  1. Adquiera aproximadamente 1–2.5 x 105 células ILC2 de las células 3.11.10 y 1–2.5 x 106 CD4+ T del paso 3.12.8 en tubos separados de 5 ml.
    1. Mantenga un tubo adicional de al menos 5.0 x 104 células T CD4+ como un control sin mancha.
  2. Suspenda las células en 100–200 l de tampón FACS y agregue 1 l de bloque Fc a cada tubo, luego incubar en hielo (o en un refrigerador de 4 oC) durante 10 minutos.
  3. Añadir 1–2 ml de búfer FACS a cada tubo y centrífuga a 378 x g durante 5 min en RT.
  4. Vierta el sobrenadante y resuspenda las células en 100–200 l de búfer FACS.
  5. Añadir 37,5 l del cóctel de tinción de anticuerpos CCR4 a la suspensión celular en todos los tubos excepto en el tubo que contiene las células 'no manchadas'.
  6. Incubar los tubos sobre hielo, o en un refrigerador de 4 oC, durante 20-30 min.
  7. Añadir 1–2 ml de búfer FACS a cada tubo y centrífuga a 378 x g durante 5 min en RT.
  8. Vierte el sobrenadante.
  9. Repita los pasos 4.7 y 4.8.
  10. Añadir de 250 a 300 ml de fijador estabilizador 1x (ver Tabla de Materiales)a cada tubo.
  11. Prepare controles de perlas monocolor para cada anticuerpo en el cóctel de anticuerpos CCR4 de acuerdo con el protocolo proporcionado con las perlas de compensación.
    1. Vortex las cuentas de compensación.
    2. Añade una gota de las perlas a cada tubo de control de un solo color.
    3. Añadir 1 l de cada anticuerpo en el cóctel de anticuerpos CCR4 a su propio tubo etiquetado.
    4. Mezclar e incubar suavemente durante 10 minutos en un refrigerador de 4 oC o en hielo.
    5. Añadir 1–2 ml de búfer FACS a todos los tubos y centrífuga a 378 x g durante 5 min en RT.
    6. Vierta el sobrenadante y resuspenda las perlas en 200 l de tampón FACS.
    7. Refrigere los controles de un solo color hasta que todas las muestras estén manchadas y listas para ser analizadas en el citómetro de flujo.
  12. Analice las celdas no manchadas, los controles de un solo color y las muestras experimentales en el citómetro de flujo dentro de las 24 horas de fijación.

5. Procedimiento de Transmigración Ex Vivo

NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en un Gabinete de Seguridad Biológica, ya que requieren una técnica estéril.

  1. Adquiera el ILC2 de las células T del paso 3.11.10 y CD4 del paso 3.12.8 y determine el número de inserciones transwell necesarias para el experimento.
    NOTA: Ejemplo: Para 1,2 ml de células T CD4 enriquecidas del paso 3.12.8, multiplique 1,2 x 1.000 l a 1.200 ol; a continuación, divida 1.200 uL por 100 l a 12, el número de plaquitas necesarias para la transmigración CD4 T.
  2. Mueva suavemente las plaquitas transwell de 3 m de las filas medias de una placa de 24 pocillos.
  3. Agregue 500 l de medios de migración con CCL17 a aproximadamente un tercio de los pozos.
  4. Agregue 500 l de medios de migración con CCL22 a otro tercio de los pozos.
  5. Añadir 500 l de RPMI sin suero que no contenga quimiocina al último tercio de los pozos.
  6. Etiquete claramente la tapa de la placa con los medios de transmigración apropiados colocados en los pozos inferiores.
  7. Vuelva a colocar las inserciones transwell en los pozos que contienen los diversos tratamientos.
  8. Agregue suavemente 100 sl de células T CD4 o ILC2 al pozo superior de cada plaquita. No mezcle ni pipetee la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo en los transoquetos, ya que esto puede confundir los resultados del experimento.
  9. Etiquete claramente la tapa de la placa con el tipo de celda colocado en cada pocto y escriba la fecha y hora del día en que se agregaron las celdas.
  10. Repita los pasos 5.2 a 5.9 hasta que todas las celdas se hayan colocado en inserciones transwell con medios.
  11. Colocar suavemente la placa en una incubadora de 37oC con 5% deCO2 durante 48 h. Minimice el contacto con la placa durante el período de incubación.

6. Cuantificación de la transmigración Ex Vivo

  1. Retire suavemente la placa de la incubadora y retire todas las inserciones transwell de las filas intermedias en los pozos vacíos justo encima o por debajo.
  2. Recoja las celdas de los pozos inferior y superior de las inserciones transwell en tubos etiquetados con TOP o BOTTOM, con CCL17, CCL22 o medios, con el tipo de celda y con el número de réplica (al menos 3 réplicas por experimento).
  3. Enjuague los pozos inferiores con 500 ml de 1pbS y recoja este enjuague en el tubo correspondiente.
  4. Enjuague los pozos superiores con 250 s de 1x PBS y recoja este enjuague en el tubo correspondiente.
  5. Reventar las células por centrifugación a 378 x g durante 5 min a RT.
  6. Pipetear suavemente todo el sobrenadante del pellet celular.
  7. Resuspenda las células T y ilC2 en 50 s de PBS 1x.
  8. Tomar 10 s de las suspensiones celulares y añadir a 90 sL de 0,4% trypan azul.
  9. Cuente las celdas en el contador de celdas automatizado.
    1. Registre %viabilidad.
    2. Registre el recuento de celdas por ml para cada muestra.
    3. Determinar el número total de células por tratamiento en la cámara superior e inferior; registrar los recuentos de células.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Expresión CCR4 en células T CD4+ e ILC2.

Para el éxito del experimento de transmigración ex vivo, es imperativo determinar si los linfocitos responden a CCL17 y CCL22 a través de CCR4; por lo tanto, determinamos la expresión CCR4 en células CD4+ T e ILC2 por citometría de flujo. Si bien es bien sabido que las células T específicas de OVA CD4+ auxiliares expresan CCR4, menos se sabe de la expresión de CCR4 en ILC2. La Figura...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

En este documento, presentamos un método bien establecido para evaluar la migración inducida por quimiocina de linfocitos en un sistema de transmigración ex vivo. Hay varios pasos críticos en el protocolo, el primero de los cuales es verificar la expresión del receptor de quimiocina correcto en las células inmunitarias en el experimento. En nuestras manos, elegimos CCR4 debido al cuerpo de literatura que destaca la importancia de CCR4 en th2 células T auxiliares en la inflamación alérgica. La inflamación induci...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgaciones

Los autores no tienen revelaciones financieras ni conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Asociación Americana del Pulmón (K.J.W.), el fondo Memorial Eugene Kenney otorgado a T.A.W. y K.J.W., generoso apoyo inicial de la Universidad de Utah para K.J.W., y un premio del Departamento de Asuntos de Veteranos a T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. ha recibido un Premio Científico de Carrera de Investigación (IK6 BX003781) del Departamento de Asuntos de Veteranos. Los autores desean reconocer la asistencia editorial de la Sra. Lisa Chudomelka. Los autores agradecen al núcleo de la citometría flow de la CMN por su apoyo en la recopilación de los datos de citometría de flujo generados para este manuscrito.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% Trypan BlueSigma-Aldrich15250061
1 mL syringeBD Bioscience329424U-100 Syringes Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-GlutamineGibco10378-016Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubesOlympus Plastics28-101polypropylene tubes
3 μm transwell insertsGenesee Scientific25-28824-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixativeBD Pharmigen338036Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubesSTEM Cell Technologies38007
50 mL conical tubesOlympus Plastics28-106polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnetSTEM Cell Technologies18103
ACK Lysing BufferLife Technologies CorporationA1049201
Advanced cell strainer, 40 μmGenesee Scientific25-375nylon mesh, 40 μm strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent GradeSigma-Aldrich239186-25G20 mg/mL
anti-mouse CCR4; APC-conjugatedBiolegend1312110.5 μg/test
anti-mouse CD11bBD Pharmigen5573960.5 μg/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610Thermo-Fischer Scientific61-0114-820.25 μg/test
anti-mouse CD16/32, Fc blockBD Pharmigen5531410.5 μg/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugatedThermo-Fischer Scientific47-0193-820.5 μg/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugatedBD Pharmigen5527740.25 μg/test
anti-mouse CD45; PE conjugatedBD Pharmigen560870.5 μg/test
anti-mouse ICOS (CD278)BD Pharmigen5640700.5 μg/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugatedBD Pharmigen5531640.25 μg/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugatedBiolegend1453110.5 μg/test
Automated Cell CounterBIORAD1450102
Automated DissociatorMACS Miltenyi Biotec130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized PowderSigma-AldrichA2153-10G0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter ClidesBIORAD1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade VSigma-AldrichA5503-10G500 μg/mL
Collagenase, Type 1, FilteredWorthington Biochemical CorporationCLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216)25 U/mL in RPMI
Compensation beadsAffymetrix01-1111-411 drop per contol tube
Dissociation TubesMACS Miltenyi Biotec130-096-335
FACS BufferBD Pharmigen5546571x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBSGenesee Scientific25-525H10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
Mouse CCL17GenScriptZ02954-2050 ng/mL
Mouse CCL22GenScriptZ02856-2050 ng/mL
Mouse CD4+ T cell enrichment kitSTEM Cell Technologies19852
Mouse IL-2GenScriptZ02764-2020 ng/mL
Mouse ILC2 enrichment kitSTEM Cell Technologies19842
Mouse recombinant IL-33STEM Cell Technologies7804420 ng/mL
RPMILife Technologies Corporation22400071
Separation BufferSTEM Cell Technologies201441x PBS + 2% FBS; stored at 4 °C
Small animal nebulizer and chamberData Sciences International
Sterile salineBaxter2F7124; NDC 0338-0048-040.9% Sodium Chloride

Referencias

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  2. Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Immunology. 6, 548(2015).
  3. Borroni, E. M., Savino, B., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines sound the alarmin: The role of atypical chemokine in inflammation and cancer. Seminars in Immunology. 38, 63-71 (2018).
  4. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. The New England Journal of Medicine. 354 (6), 610-621 (2006).
  5. Abboud, D., Hanson, J. Chemokine neutralization as an innovative therapeutic strategy for atopic dermatitis. Drug Discovery Today. 22 (4), 702-711 (2017).
  6. Aldinucci, D., Casagrande, N. Inhibition of the CCL5/CCR5 Axis against the Progression of Gastric Cancer. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), E1477(2018).
  7. Chonco, L., et al. Novel DNA Aptamers Against CCL21 Protein: Characterization and Biomedical Applications for Targeted Drug Delivery to T Cell-Rich Zones. Nucleic Acid Therapy. 28 (4), 242-251 (2018).
  8. Trivedi, P. J., Adams, D. H. Chemokines and Chemokine Receptors as Therapeutic Targets in Inflammatory Bowel Disease; Pitfalls and Promise. Journal of Crohn's and Colitis. 12 (12), 1508(2018).
  9. Pietrosimone, K. M., Bhandari, S., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. In vitro assays of chemotaxis as a window into mechanisms of toxicant-induced immunomodulation. Current Protocols in Toxicology. 58 (Unit 18.17), (2013).
  10. Davis, D. M. How studying the immune system leads us to new medicines. Lancet. 391 (10136), 2205-2206 (2018).
  11. Culley, F. J., Pennycook, A. M., Tregoning, J. S., Hussell, T., Openshaw, P. J. Differential chemokine expression following respiratory virus infection reflects Th1- or Th2-biased immunopathology. Journal of Virology. 80 (9), 4521-4527 (2006).
  12. Denney, H., Clench, M. R., Woodroofe, M. N. Cleavage of chemokines CCL2 and CXCL10 by matrix metalloproteinases-2 and -9: implications for chemotaxis. Biochemical and Biophysics Research Communications. 382 (2), 341-347 (2009).
  13. Burrell, B. E., et al. Lymph Node Stromal Fiber ER-TR7 Modulates CD4+ T Cell Lymph Node Trafficking and Transplant Tolerance. Transplantation. 99 (6), 1119-1125 (2015).
  14. Warren, K. J., Iwami, D., Harris, D. G., Bromberg, J. S., Burrell, B. E. Laminins affect T cell trafficking and allograft fate. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2204-2218 (2014).
  15. Hirata, H., et al. Th2 cell differentiation from naive CD4(+) T cells is enhanced by autocrine CC chemokines in atopic diseases. Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. , (2018).
  16. Lin, R., Choi, Y. H., Zidar, D. A., Walker, J. K. L. beta-Arrestin-2-Dependent Signaling Promotes CCR4-mediated Chemotaxis of Murine T-Helper Type 2 Cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 745-755 (2018).
  17. Zhang, Y., et al. A new antagonist for CCR4 attenuates allergic lung inflammation in a mouse model of asthma. Science Reports. 7 (1), 15038(2017).
  18. Lu, Y., et al. Dynamics of helper CD4 T cells during acute and stable allergic asthma. Mucosal Immunology. 11 (6), 1640-1652 (2018).
  19. Li, B. W. S., Beerens, D., Brem, M. D., Hendriks, R. W. Characterization of Group 2 Innate Lymphoid Cells in Allergic Airway Inflammation Models in the Mouse. Methods in Molecular Biology. 1559, 169-183 (2017).
  20. Li, B. W. S., et al. Group 2 Innate Lymphoid Cells Exhibit a Dynamic Phenotype in Allergic Airway Inflammation. Frontiers in Immunology. 8, 1684(2017).
  21. Warren, K. J., et al. Sex differences in activation of lung-related type-2 innate lymphoid cells in experimental asthma. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. , (2016).
  22. Warren, K. J., et al. Ovalbumin-sensitized mice have altered airway inflammation to agriculture organic dust. Respiratory Research. 20 (1), 51(2019).
  23. Poole, J. A., et al. alphabeta T cells and a mixed Th1/Th17 response are important in organic dust-induced airway disease. Annals of Allergy, Asthma, Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, Immunology. 109 (4), 266-273 (2012).
  24. Matsuo, K., et al. A CCR4 antagonist ameliorates atopic dermatitis-like skin lesions induced by dibutyl phthalate and a hydrogel patch containing ovalbumin. Biomedical Pharmacotherapy. 109, 1437-1444 (2019).
  25. Mikhak, Z., et al. Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in allergic pulmonary inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (1), 67-73 (2009).
  26. Monticelli, L. A., et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nature Immunology. 12 (11), 1045-1054 (2011).
  27. Saenz, S. A., et al. IL25 elicits a multipotent progenitor cell population that promotes T(H)2 cytokine responses. Nature. 464 (7293), 1362-1366 (2010).
  28. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  29. Nakajima, H., Shores, E. W., Noguchi, M., Leonard, W. J. The common cytokine receptor gamma chain plays an essential role in regulating lymphoid homeostasis. The Journal of Experimental Medicine. 185 (2), 189-195 (1997).
  30. Warren, K. J., et al. RSV-specific anti-viral immunity is disrupted by chronic ethanol consumption. Alcohol. , (2016).
  31. Warren, K. J., Poole, J. A., Sweeter, J. M., DeVasure, J. M., Wyatt, T. A. An association between MMP-9 and impaired T cell migration in ethanol-fed BALB/c mice infected with Respiratory Syncytial Virus-2A. Alcohol. , (2018).
  32. Molteni, R., et al. A novel device to concurrently assess leukocyte extravasation and interstitial migration within a defined 3D environment. Lab on a Chip. 15 (1), 195-207 (2015).
  33. Bersini, S., et al. Human in vitro 3D co-culture model to engineer vascularized bone-mimicking tissues combining computational tools and statistical experimental approach. Biomaterials. 76, 157-172 (2016).
  34. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Inmunolog a e infecci nN mero 151CCL17 C C Motif Chemokine 17 TARC timo y quimioquina relacionada con la activaci nCCL22 C C Motif Chemokine 22 MDC Quimioquina derivada del macr fagoCCR4 CC Chemokine Receptor 4C lula T CD4 CD4 C lula auxiliar T C lula Th2ILC2 C lula linfoide innata del grupo 2OVA Ovalbumin de huevo de pollo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados