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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In diesem Protokoll werden Lymphozyten in die obere Kammer eines Transmigrationssystems gelegt, die durch eine poröse Membran von der unteren Kammer getrennt sind. Chemokin wird der unteren Kammer hinzugefügt, was eine aktive Migration entlang eines Chemokingradienten induziert. Nach 48 h werden Lymphozyten in beiden Kammern gezählt, um die Transmigration zu quantitieren.

Zusammenfassung

Hierbei präsentieren wir eine effiziente Methode, die mit grundlegenden Laborfertigkeiten und Materialien ausgeführt werden kann, um die lymphozyte chemokine Bewegung in einem Ex-vivo-Transmigrationssystem zu bewerten. Angeborene Lymphzellen der Gruppe 2 (ILC2) und CD4+ T-Helferzellen wurden aus Milz und Lunge von Hühnerei-Ovalbumin (OVA)-herausgeforderten BALB/c-Mäusen isoliert. Wir haben die Expression von CCR4 auf CD4+ T-Zellen und ILC2, vergleichsweise bestätigt. CCL17 und CCL22 sind die bekannten Liganden für CCR4; Daher haben wir mit dieser Ex-vivo-Transmigration-Methode die CCL17- und CCL22-induzierte Bewegung von CCR4+ Lymphozyten untersucht. Um Chemokin-Gradienten zu ermitteln, wurden CCL17 und CCL22 in die untere Kammer des Transmigration-Systems gelegt. Isolierte Lymphozyten wurden dann den oberen Kammern zugesetzt und über einen Zeitraum von 48 h wanderten die Lymphozyten aktiv durch 3 m Poren in Richtung Chemokin in der unteren Kammer. Dies ist ein wirksames System zur Bestimmung der Chemokinetik von Lymphozyten, imitiert aber verständlicherweise nicht die Komplexitäten, die in den in vivo Organmikroumgebungen zu finden sind. Dies ist eine Einschränkung der Methode, die durch die Zugabe von In-situ-Bildgebung des untersuchten Organs und Lymphozyten überwunden werden kann. Im Gegensatz dazu besteht der Vorteil dieser Methode darin, dass ein Einsteigertechniker viel kostengünstiger als Live-Bildgebung durchgeführt werden kann. Da therapeutische Verbindungen zur Verbesserung der Migration verfügbar werden, wie im Falle von Tumor infiltrierenden zytotoxischen Immunzellen, oder um die Migration zu hemmen, vielleicht im Falle von Autoimmunerkrankungen, bei denen die Immunpathologie von Beunruhigung ist, kann diese Methode als Screening-Tool. Im Allgemeinen ist die Methode wirksam, wenn das Chemokin von Interesse konsequent Chemokinetik auf einem statistisch höheren Niveau als die Medienkontrolle erzeugt. In solchen Fällen kann auch der Grad der Hemmung/Verbesserung durch eine bestimmte Verbindung bestimmt werden.

Einleitung

Diese ursprüngliche Transmigration-Methode wurde 1962 von Stephen Boyden im Journal of Experimental Medicine1vorgestellt. Vieles von dem, was wir über Chemotaxis und Chemokinetik wissen, wäre ohne die Entwicklung der Boydenkammer nicht möglich. Vor der Entdeckung des ersten Chemokins im Jahr 1977 wurden Ex-vivo-Transmigrationssysteme verwendet, um mehr über Serumfaktoren zu erfahren, die zelluläre Bewegungen in Makrophagen festsetzen könnten, während die zelluläre Motilität in Neutrophilen verstärkt wird1,2. Es wurde ein riesiger Wissensschatz in Bezug auf die Immunzellmigration entwickelt, und bis heute wurden 47 Chemokine mit 19 entsprechenden Rezeptoren3,4entdeckt. Darüber hinaus haben viele Inhibitoren/Enhancer dieser Chemokin-Wege eine Entwicklung zu therapeutischenZwecken5,6,7,8. Viele dieser Verbindungen wurden in ähnlichen Transmigrationskammern getestet, um direkte Wechselwirkungen zwischen den Verbindungen und immunzellige Reaktionsfähigkeit auf ein bestimmtes Chemokin zu verstehen9.

Transmigration, oder Diapedese, in entzündetes Gewebe ist ein wesentlicher Prozess für eine gesunde Entzündungsreaktion auf klare Infektion10,11. Ein Boyden-Kammer-, Transmigrationssystem oder Transwell-Apparat besteht in der Regel aus zwei Kammern, die durch eine poröse Membran1,12getrennt sind. Die untere Kammer hält am häufigsten Medien, die das Chemokin von Interesse enthalten, während Leukozyten in der oberen Kammer platziert werden. Die Größe der Pore in der Membran kann basierend auf der Größe der betreffenden Zelle ausgewählt werden. Für dieses Projekt haben wir eine poröse Membran von 3 m ausgewählt, da die Lymphzellen je nach Stadium der zellulären Entwicklung 7-20 m groß sind. Diese Porengröße stellt sicher, dass diese Zellen nicht passiv durch die Poren fallen, sondern dass sie aktiv als Reaktion auf den Chemokingradienten migrieren.

Der hauptvorteil dieses Protokolls ist seine Wirtschaftlichkeit. Die In-vivo-Transmigration ist schwierig, da sie eine umfassende Ausbildung im Umgang mit Tieren und in der Chirurgie erfordert und häufig eine hochleistungsfähige Mikroskopie erfordert, die einem Forscher nicht immer zur Verfügung steht. Kostengünstiges Screening von Verbindungen, von denen angenommen wird, dass sie die Transmigration verbessern oder hemmen, kann vor der In-vivo-Bildgebung durchgeführt werden. Da das Transmigrationssystem streng kontrolliert wird, können Zellen zunächst dem Transwell-Apparat zugesetzt werden, oder umgekehrt kann das Chemokin zuerst mit einem Chemokin-Inhibitor behandelt werden, dann mit Zellen, die dem Transwell-Apparat zugesetzt werden. Schließlich können Endothelzellen und/oder Kellermembranproteine 1-2 Tage vor dem Transmigrationsexperiment an der Unterseite des Transwell-Inserts zugesetzt werden, um die Beteiligung dieser Barrierezellen an der Chemokinetik zu verstehen. Auch diese Manipulationen des Systems bieten ein leistungsfähiges Mittel, um wichtige Informationen über die Wirksamkeit einer bestimmten Verbindung im Vorfeld komplizierterer In-vivo-Studien zu bestimmen.

Die Verwendung eines Transmigrationskammersystems ist eine effektive Möglichkeit, die Lymphozytenmobilität unter verschiedenen In-vivo- und In-vitro-Bedingungen12,13,14zu bewerten. Hierin beschreiben wir eine optimierte Methode zur Beurteilung der Ex-vivo-Lymphozytenreaktion auf Chemokine in einer Transmigrationskammer. In diesem Beispielexperiment wurden CD4+ T-Zellen und angeborene Lymphzellen der Gruppe 2 (ILC2) nach der OVA-Allergen-Exposition von männlichen und weiblichen BALB/c-Mäusen isoliert. Es wurde die Hypothese erstellt, dass CCR4+ CD45+ Lineage- (LIN-) ILC2 von allergenbekämpften Mäusen effizienter in Richtung CCL17 und CCL22 migrieren würde als CCR4+ CD4+ T-Helferzellen. CCL17 und CCL22 sind Chemokine, die häufig von dendritischen Zellen und Makrophagen des M2 (allergischen) Phänotyps unter anderen Zellen, in Allergie15,16produziert werden. CCL17 und CCL22 können als Biomarker allergischer Entzündungen betrachtet werden, da sie bei Atemwegsexazerbationen16,17,18leicht in der Lunge nachgewiesen werden können. Wichtig ist, dass die CCR4-Expression im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen erhöht ist, wie aus bioinformatischen Daten hervorgeht, die aus ILC2 gewonnen wurden, das von Hausstaubmilben behandelten Tieren isoliert wurde, und ähnlich ILC2 von naiven Tieren, die ex vivo mit IL-33 behandelt wurden ( allergenförderndes angeborenes Zytokin) upreguliert CCR419,20. Darüber hinaus ist CCR4 mRNA nach Daten für ILC2 in der Datenbank des Immunologischen Genomprojekts (www.immgen.org) in diesen angeborenen Immunzellen stark exprimiert. Bis heute ist wenig über den Handel mit ILC2 in Gewebe bekannt, aber es ist wahrscheinlich, dass die ILC2- und CD4+ T-Zellen ähnliche Chemokine und Rezeptoren für Chemotaxis und Chemokinetik verwenden, da sie ähnliche Transkriptionsfaktoren und Rezeptoren ausdrücken. So verglichen wir CCL17 versus CCL22 Reaktionsfähigkeit, von ILC2 und CD4+ T Lymphozyten, von männlichen und weiblichen, OVA-herausgeforderten Tieren.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees am University of Nebraska Medical Center (UNMC) und der University of Utah überprüft und genehmigt.

1. Aufbau und Herstellung von Reagenzien

  1. Bereiten Sie komplette RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medien vor.
    1. Fügen Sie 10 ml hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) zu 90 ml RPMI hinzu.
    2. 1 ml 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamin zu 100 ml von 10% FBS RPMI hinzufügen.
  2. Bereiten Sie ILC2-Erweiterungsmedien vor.
    1. Fügen Sie IL-2 und IL-33 (20 ng/ml pro Zytokin) zu 10 ml vollständigem RPMI hinzu.
    2. Wenn die Zytokine der Lager 10 g/ml betragen, werden die Pipette 20 l IL-2 und IL-33 in ein 15 ml-Rohr mit 10 ml kompletten RPMI-Medien pipetten.
  3. Vorbereiten der Lungendissoziation Medium.
    1. Fügen Sie 50 mg Typ 1 Kollagenase zu 250 ml unsupplementiertes RPMI hinzu.
    2. 2,5 ml 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamin in Schritt 1.3.1 zu den 250 ml Medien hinzufügen.
    3. Mischen Sie die Medien vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Typ-1-Collagenase vor der Anwendung vollständig aufgelöst wird.
  4. Bereiten Sie serumfreies RPMI vor.
    1. 1 g lyophilisiertes Rinderserumalbumin (BSA) in 200 ml RPMI verdünnen.
    2. 2 ml 100x Penicillin-Streptomycin-Glutamin hinzufügen.
    3. Mischen Sie die Medien vorsichtig, um sicherzustellen, dass die BSA vor dem Gebrauch vollständig in den Medien aufgelöst wird.
  5. Bereiten Sie Migration Medium mit CCL17 vor.
    1. Erwerben Sie 10 ml serumfreies RPMI und fügen Sie CCL17 [50 ng/mL] hinzu.
      1. Wenn der Lager-CCL17 10 g/ml beträgt, fügen Sie 50 L CCL17-Bestand auf 10 ml serumfreies RPMI-Medium hinzu.
  6. Bereiten Sie Migration Medium mit CCL22 vor.
    1. Erwerben Sie 10 ml serumfreies RPMI und fügen Sie CCL22 [50 ng/mL] hinzu.
    2. Wenn der Lager-CCL22-Bestand 10 g/ml beträgt, fügen Sie 50 L CCL22-Bestand auf 10 ml serumfreies RPMI-Medium hinzu.
  7. Bereiten Sie CCR4 Antikörper Staining Cocktail.
    1. Fügen Sie für insgesamt 10 Tests 5 l der folgenden Antikörper zu einem 5 ml-Rohr hinzu: Anti-Maus-CCR4, CD19, CD11b, CD45, ST2 und ICOS.
      HINWEIS: Beispiel für die Herstellung von Antikörpercocktails für 10 Proben: 0,5 l jeder Antikörper x 10 Proben = 5 l jedes der in 1.7.1 aufgeführten Antikörper.
    2. Für insgesamt 10 Tests fügen Sie dem Antikörpercocktail aus Schritt 1.7.1: Anti-Maus-CD3, CD11c und NK1.1 2,5 l der folgenden Antikörper hinzu.
      HINWEIS: Beispiel zum Vervollständigen des Antikörpercocktails für 10 Proben: 0,25 l x 10 Proben = 2,5 l CD3- und NK1.1-Antikörper.
    3. Den CCR4 Antikörper Staining Cocktail bei 4 °C aufbewahren, bis er bereit ist, den Proben hinzuzufügen. Entsorgen Sie Antikörpercocktail nach 1 Woche, wenn sie nicht verwendet werden.
  8. Bereiten Sie 1x Stabilisierende Fixierung vor.
    1. 10 ml deionisiertes destilliertes Wasser zu 5 ml 3x stabilisierendem Fixierkonzentrat hinzufügen

2. Zubereitung allergenbewehrter BALB/c-Mäuse

HINWEIS: Männliche und weibliche BALB/c-Mäuse wurden im Alter von 6 bis 8 Wochen im Alter von 6 bis 8 Wochen von Charles River (UNMC) oder Jackson Laboratories (University of Utah) gekauft.

  1. Nach der Akklimatisierung (1 Woche), sensibilisieren alle Tiere zu OVA.
    1. Kombinieren Sie 100 g/ml OVA adsorbiert auf Aluminiumhydroxid (20 mg/ml) in einem 5 ml Polystyrol-Rohr.
    2. Mischen Sie das Rohr und ziehen Sie sofort 500 l der OVA-AlumSuspension in eine 1 ml, 28 G Spritze (Insulinspritze).
    3. Legen Sie eine Maus in ein Glockenglas mit Isofluran (1-2 ml unter einem falschen Boden, damit das Tier nicht direkt in Isofluran steht). Lassen Sie die Maus unter Anästhesie für etwa 1-2 min gehen, oder bis die Rate der Atmung sinkt.
    4. Nehmen Sie schnell die Maus am Fell auf dem Rücken und den Schultern und injizieren Sie 100 l OVA-Alum intraperitoneally pro Maus21,22.
    5. Legen Sie die Maus wieder in den Käfig und achten Sie darauf, dass sie wieder beweglich sind; dies sollte innerhalb von 2-5 min erfolgen.
  2. Sieben Tage nach der Sensibilisierung unterziehen Sie alle Tiere intranasalen (d.h.) 1,5% OVA in steriler Salin in einer Vernebelungskammer (Data Sciences International) für 20 min verdünnt.
    1. Entfernen Sie Mäuse aus ihren Käfigen und legen Sie sie in die tierische Vernebelungskammer. Schließen Sie den Deckel auf der Kammer.
    2. Befestigen Sie den Nebelschlauch am Eingangsauslauf an der Vernebelungskammer.
    3. 30 ml 1,5% OVA in steriler Salin verdünnt in den Verneblerbecher geben.
    4. Schalten Sie den Vernebler ein und lassen Sie die Kammer 20 min lang mit Nebel füllen.
    5. Schalten Sie den Vernebler aus und lassen Sie den Nebel absetzen.
    6. Bringen Sie die Tiere in ihre Käfige zurück.
  3. Wiederholen Sie Schritt 2.2 für insgesamt 5 Mal, an 5 aufeinanderfolgenden Tagen, um allergische Entzündungen zu induzieren.

3. Isolierung von CD4+ T-Zellen aus Milz und Lunge von OVA-herausgeforderten Mäusen

  1. Humane Euthane alle OVA-behandelten männlichen und weiblichen Tiere durch CO2-Erstickung nach zugelassenen IACUC-Protokollen, mit 2 bis 3 Tieren pro Gruppe, pro Experiment.
  2. Verbrauchen Von Lungen und Milz von Tieren und legen Gewebe in getrennten Dissoziationsröhren basierend auf gewebeartund geschlechtdes Tier23.
  3. Dissoziieren Sie Lungengewebe in 500 L Lungendissoziation Medien (25 U/ml; Kollagenase, Typ 1) im automatisierten Gewebedissoziator mit dem "Lungen"-Protokoll.
    1. Wiederholen Sie 3.2 und 3.3 insgesamt zweimal.
  4. Dissoziieren Sie Milzgewebe in 500 L vollständiger RPMI-Medien mit dem "Milz"-Protokoll auf dem automatisierten Gewebedissoziator.
    HINWEIS: Die restlichen Schritte sollten in einem Biological Safety-Schrank mit steriler Technik durchgeführt werden.
  5. Spülen Sie die dissoziationsröhren, die Lungen- und Milzhomogenate enthalten, mit 5 ml zusätzlichem Lungendissoziationsmedium bzw. Complete RPMI.
  6. Filtern Sie Zellsuspensionen durch ein 40-m-Zellsieb und sammeln Sie in 50 ml konische Schläuche.
  7. Inkubieren Sie die Lunge für 15–30 min in einem 37 °C-Inkubator mit 5%CO2, um das Lungengewebe weiter zu dissoziieren.
  8. Fügen Sie 5 ml Complete RPMI in die Lunge und Milzhomogenate und Pellet der Zellen an der Unterseite der 50 ml-Rohre mit Zentrifugation; 378 x g bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
  9. Kombinieren Sie Splenozyten und Lungenzellen zu einem einzigen 50 ml konischen Rohr und bestimmen Sie die Gesamtzellzahl mit dem automatisierten Zellzähler.
  10. Männliche und weibliche Zellsuspensionen im Trennpuffer auf 1 x 108 Zellen/ml einstellen und zu einem 5 ml Polystyrolrohr hinzufügen.
    HINWEIS: Das Anreicherungsprotokoll kann bis zu 14 ml Polystyrolröhren eingestellt werden, wenn mehr Zellen aus Milz und Lunge gewonnen werden. Dieses Protokoll wurde für Gewebe von 2–3 Mäusen pro Gruppe entwickelt; daher sollte ein 5 ml Rohr ausreichen.
  11. Verwenden Sie etwa zwei Drittel der gesamten Zellen für die ILC2-Isolierung gemäß dem ILC2-Anreicherungsprotokoll.
    1. Fügen Sie der Zellsuspension einen Antikörpercocktail (50 l/ml) hinzu und brüten Sie 5 min bei RT.
    2. Wirbel-Schnellkugeln für 30 s und fügen Sie der Probe mit einer Rate von 75 l/ml Zellsuspension hinzu. Sanft mischen und inkubieren für 5 min bei RT.
    3. Das Rohr mit Trennpuffer auf bis zu 3 ml Gesamtvolumen aufstellen und in den 8-Kammer-Leichttrennmagneten legen. 3 min bei RT inkubieren.
    4. Tippen Sie den Magneten nach vorne (weg von den Kugel-Antikörper-Zell-Komplexen, die an der Rückseite des Rohres haften) und Pipette von der Zellsuspension in ein sauberes 5 ml-Rohr.
    5. Fügen Sie 1,5 ml komplettes RPMI in die Rohre und Zentrifuge bei 378 x g für 5 min bei RT.
    6. Gießen Sie die Medien aus dem Zellpellet und setzen Sie den ILC2 mit 1 x 107 Zellen pro ml wieder aus.
    7. Platzieren Sie 100 uL männlicher und weiblicher ILC2 pro Brunnen in eine U-Boden-, 96-Well-Platte und fügen Sie jedem Bohrwert 100 l ILC2-Erweiterungsmedien hinzu.
    8. Inkubieren Sie die Zellen für 4-5 Tage, um den ILC2 zu erweitern.
    9. Sammeln Sie den ILC2 in ein 5 ml Rohr und addieren Sie bis zu 4,5 ml serumfreies RPMI. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 378 x g für 5 min bei RT.
    10. Zählen Sie Zellen mit einem Hemacytometer und setzen Sie bei 1 x 107 ILC2 pro ml im serumfreien RPMI wieder auf.
  12. Verwenden Sie die verbleibenden Zellen für die CD4+ T-Zellisolation, die gemäß dem Maus-CD4+ T-Zellisolationsprotokoll mit wenigen Modifikationen durchgeführt wird.
    1. Fügen Sie der CD4 T-Zellanreicherungsuspension Rattenserum (50 l/ml) hinzu.
    2. Isolationscocktail (50 l/ml) in die Probe geben und 10 min bei RT brüten.
    3. Wirbel-Schnellkugeln für 30 s und fügen Sie der Probe mit einer Rate von 75 l/ml hinzu.
    4. Die Zellsuspension vorsichtig mischen und 2,5 min und RT inkubieren
    5. Die Proben auf 3 ml aufstellen und die 5 ml-Rohre in den 8-Kammer-Leichttrennmagneten legen und 5 min bei RT inkubieren.
    6. Tippen Sie den Magneten nach vorne und pipette die Zellsuspension in ein sauberes 5 ml Rohr.
    7. 1,5 ml serumfreies RPMI bei 378 x g für 5 min bei RT in die Rohre und Zentrifuge geben.
    8. Gießen Sie die Medien aus dem Zellpellet und setzen Sie die CD4+ T-Zellen bei 1 x 107 Zellen pro ml in serumfreiem RPMI wieder auf.

4. Bestimmung der CCR4-Expression auf CD4+ T-Zellen und Gruppe 2 angeborener lymphoider Zellen (ILC2) von OVA-herausgeforderten Tieren durch Durchflusszytometrie

HINWEIS: Die folgenden Schritte können auf einer offenen Tischplatte ausgeführt werden, da es sich um nicht-sterile Techniken handelt.

  1. Erfassen Sie ca. 1–2,5 x 105 ILC2-Zellen aus Schritt 3.11.10 und 1–2,5 x 106 CD4+ T-Zellen aus Schritt 3.12.8 in separaten 5 ml-Röhren.
    1. Bewahren Sie eine zusätzliche Röhre mit mindestens 5,0 x 104 CD4+ T-Zellen als unbefleckte Steuerung auf.
  2. Die Zellen in 100–200 L FACS-Puffer aufhängen und jeder Röhre 1 L Fc Block hinzufügen, dann 10 min auf Eis (oder in einem 4 °C-Kühlschrank) inkubieren.
  3. Fügen Sie 1–2 ml FACS-Puffer in jedes Rohr und jede Zentrifuge bei 378 x g für 5 min bei RT.
  4. Gießen Sie den Überstand ab und suspendieren Sie die Zellen in 100–200 L FACS Buffer.
  5. Fügen Sie der Zellsuspension in jeder Röhre außer dem Rohr, das die "unbefleckten" Zellen enthält, 37,5 l des CCR4 Antikörper-Färbecocktails hinzu.
  6. Die Rohre auf Eis oder in einem 4 °C-Kühlschrank für 20–30 min inkubieren.
  7. Fügen Sie 1–2 ml FACS-Puffer in jedes Rohr und jede Zentrifuge bei 378 x g für 5 min bei RT.
  8. Gießen Sie den Überstand ab.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 4.7 und 4.8.
  10. Fügen Sie jedem Rohr 250–300 l 1x stabilisierende Fixierung (siehe Materialtabelle)hinzu.
  11. Bereiten Sie einfarbige Perlensteuerungen für jeden Antikörper im CCR4-Antikörpercocktail gemäß dem protokollierten Protokoll vor, das mit den Kompensationsperlen versehen ist.
    1. Wirbel die Kompensation Sabe.
    2. Fügen Sie jedem einfarbigen Steuerrohr einen Tropfen der Perlen hinzu.
    3. Fügen Sie 1 l von jedem Antikörper im CCR4 Antikörper-Cocktail zu seinem eigenen beschrifteten Rohr hinzu.
    4. 10 min im 4 °C-Kühlschrank oder auf Eis sanft mischen und bebrüten.
    5. Fügen Sie 1–2 ml FACS-Puffer in alle Rohre und Zentrifuge bei 378 x g für 5 min bei RT.
    6. Gießen Sie den Überstand ab und setzen Sie die Perlen in 200 L FACS-Puffer wieder aus.
    7. Kühlen Sie die einfarbigen Steuerungen, bis alle Proben gebeizt sind und auf dem Durchflusszytometer analysiert werden können.
  12. Analysieren Sie die ungefärbten Zellen, einfarbigen Steuerungen und die experimentellen Proben auf dem Durchflusszytometer innerhalb von 24 h der Fixierung.

5. Ex-Vivo-Transmigrationsverfahren

HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden, da sie sterile Technik erfordern.

  1. Erfassen Sie die ILC2-Zellen aus Schritt 3.11.10 und CD4 T-Zellen aus Schritt 3.12.8 und bestimmen Sie die Anzahl der transwell-Einsätze, die für das Experiment benötigt werden.
    HINWEIS: Beispiel: Bei 1,2 ml angereicherten CD4-T-Zellen ab Schritt 3.12.8 1,2 x 1.000 l = 1.200 l multiplizieren; dann 1.200 uL durch 100 l = 12 teilen, die Anzahl der Einsätze, die für die CD4 T-Transmigration benötigt werden.
  2. Bewegen Sie die 3 m Transwell-Einsätze vorsichtig aus den mittleren Reihen einer 24-Well-Platte.
  3. Fügen Sie mit CCL17 500 L Migrationsmedien zu etwa einem Drittel der Brunnen hinzu.
  4. Fügen Sie 500 L Migrationsmedien mit CCL22 zu einem weiteren Drittel der Brunnen hinzu.
  5. Fügen Sie dem letzten Drittel der Brunnen 500 L serumfreies RPMI ohne Chemokin hinzu.
  6. Beschriften Sie den Deckel auf der Platte eindeutig mit den entsprechenden Transmigrationsmedien, die in den unteren Brunnen platziert sind.
  7. Legen Sie die Transwell-Einsätze wieder in die Brunnen mit den verschiedenen Behandlungen.
  8. Fügen Sie vorsichtig 100 L CD4-T-Zellen oder ILC2 an den oberen Brunnen jedes Inserts. Mischen oder pipetten Sie die Zellsuspension in den Transwells nicht nach oben und unten, da dies die Ergebnisse des Experiments verwirren kann.
  9. Kennzeichnen Sie den Deckel der Platte eindeutig mit dem In jedem Brunnen platzierten Zelltyp und schreiben Sie das Datum und die Uhrzeit, zu der die Zellen hinzugefügt wurden.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 5.2 bis 5.9, bis alle Zellen in Transwell-Inserts mit Medien platziert wurden.
  11. Legen Sie die Platte vorsichtig in einen 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 für 48 h. Minimieren Sie den Kontakt mit der Platte über die Inkubationszeit.

6. Quantifizierung der Ex-Vivo-Transmigration

  1. Entfernen Sie die Platte vorsichtig aus dem Inkubator und entfernen Sie alle Transwell-Einsätze aus den mittleren Reihen in die leeren Brunnen direkt darüber oder unten.
  2. Sammeln Sie die Zellen von den unteren und oberen Brunnen der Transwell-Einsätze in Röhren mit TOP oder BOTTOM, mit CCL17, CCL22 oder Medien, mit dem Zelltyp und mit der Replikationsnummer (mindestens 3 Replikationen pro Experiment).
  3. Spülen Sie die unteren Brunnen mit 500 l 1x PBS und sammeln Sie diese Inspülung in das entsprechende Rohr.
  4. Spülen Sie die oberen Brunnen mit 250 l 1x PBS und sammeln Sie diese Spülung in das entsprechende Rohr.
  5. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 378 x g für 5 min bei RT.
  6. Sanfte Pipette aus allen Überstand aus dem Zellpellet.
  7. Resuspend T-Zellen und ILC2 in 50 l von 1x PBS.
  8. Nehmen Sie 10 l der Zellsuspensionen und fügen Sie zu 90 l von 0,4% Trypan blau hinzu.
  9. Zählen Sie die Zellen auf dem automatisierten Zellenzähler.
    1. Datensatz %Lebensfähigkeit.
    2. Zeichnen Sie die Zellenanzahl pro ml für jede Probe auf.
    3. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen pro Behandlung in der oberen und unteren Kammer; die Zellenanzahl aufzeichnen.

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Ergebnisse

CCR4-Expression auf CD4+ T-Zellen und ILC2.

Für den Erfolg des Ex-vivo-Transmigrationsexperiments ist es unerlässlich, zu bestimmen, ob die Lymphozyten auf CCL17 und CCL22 über CCR4 reagieren; Daher haben wir die CCR4-Expression sowohl auf CD4+ T-Zellen als auch auf ILC2 durch Durchflusszytometrie bestimmt. Obwohl bekannt ist, dass OVA-spezifische CD4+ Helfer-T-Zellen CCR4 exprimieren, ist weniger über die Expression von CCR4 auf ILC2 bekannt.

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Diskussion

Hierbei stellen wir eine etablierte Methode zur Beurteilung der chemokininduzierten Migration von Lymphozyten in einem Ex-vivo-Transmigrationssystem vor. Es gibt mehrere kritische Schritte im Protokoll, von denen der erste die Überprüfung der Expression des richtigen Chemokinrezeptors auf die Immunzellen im Experiment ist. In unseren Händen haben wir uns für CCR4 entschieden, weil die Literatur die Bedeutung von CCR4 auf Th2-Helfer-T-Zellen bei allergischen Entzündungen hervorhebt. Ovalbumin-induzierte Entzündung w...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine finanziellen Angaben oder Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der American Lung Association (K.J.W.), dem Memorial Eugene Kenney Fund an T.A.W. und K.J.W., großzügiger Start-up-Unterstützung der University of Utah für K.J.W. und einem Department of Veterans Affairs Award an T.A.W. (VA I01BX0003635) finanziert. T.A.W. ist Träger des Research Career Scientist Award (IK6 BX003781) des Department of Veterans Affairs. Die Autoren möchten die redaktionelle Unterstützung von Frau Lisa Chudomelka würdigen. Die Autoren danken dem UNMC Flow Cytometry Core für ihre Unterstützung bei der Erfassung der für dieses Manuskript generierten Flow-Zytometrie-Daten.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% Trypan BlueSigma-Aldrich15250061
1 mL syringeBD Bioscience329424U-100 Syringes Micro-Fine 28 G 1/2" 1cc
100x Penicillin-Streptomycin, L-GlutamineGibco10378-016Dilute to 1x in RPMI media
15 mL conical tubesOlympus Plastics28-101polypropylene tubes
3 μm transwell insertsGenesee Scientific25-28824-well plate containing 12 transwell inserts
3x stabilizing fixativeBD Pharmigen338036Prepare 1x solution according to manufacturers protocol
5 mL polystyrene tubesSTEM Cell Technologies38007
50 mL conical tubesOlympus Plastics28-106polypropylene tubes
8-chamber easy separation magnetSTEM Cell Technologies18103
ACK Lysing BufferLife Technologies CorporationA1049201
Advanced cell strainer, 40 μmGenesee Scientific25-375nylon mesh, 40 μm strainers
Aluminum Hydroxide, Reagent GradeSigma-Aldrich239186-25G20 mg/mL
anti-mouse CCR4; APC-conjugatedBiolegend1312110.5 μg/test
anti-mouse CD11bBD Pharmigen5573960.5 μg/test
anti-mouse CD11c; PE eFluor 610Thermo-Fischer Scientific61-0114-820.25 μg/test
anti-mouse CD16/32, Fc blockBD Pharmigen5531410.5 μg/test
anti-mouse CD19; APC-eFluor 780 conjugatedThermo-Fischer Scientific47-0193-820.5 μg/test
anti-mouse CD3; PE Cy 7-conjugatedBD Pharmigen5527740.25 μg/test
anti-mouse CD45; PE conjugatedBD Pharmigen560870.5 μg/test
anti-mouse ICOS (CD278)BD Pharmigen5640700.5 μg/test
anti-mouse NK1.1 (CD161); FITC-conjugatedBD Pharmigen5531640.25 μg/test
anti-mouse ST2 (IL-33R); PerCP Cy5.5 conjugatedBiolegend1453110.5 μg/test
Automated Cell CounterBIORAD1450102
Automated DissociatorMACS Miltenyi Biotec130-093-235
Bovine Serum Albumin, Lyophilized PowderSigma-AldrichA2153-10G0.5% in serum-free RPMI
Cell Counter ClidesBIORAD1450015
Chicken Egg Ovalbumin, Grade VSigma-AldrichA5503-10G500 μg/mL
Collagenase, Type 1, FilteredWorthington Biochemical CorporationCLSS-1, purchase as 5 X 50 mg vials (LS004216)25 U/mL in RPMI
Compensation beadsAffymetrix01-1111-411 drop per contol tube
Dissociation TubesMACS Miltenyi Biotec130-096-335
FACS BufferBD Pharmigen5546571x PBS + 2% FBS, w/ sodium azide; stored at 4 °C
Heat Inactivated-FBSGenesee Scientific25-525H10% in complete RPMI & ILC2 Expansion Media
Mouse CCL17GenScriptZ02954-2050 ng/mL
Mouse CCL22GenScriptZ02856-2050 ng/mL
Mouse CD4+ T cell enrichment kitSTEM Cell Technologies19852
Mouse IL-2GenScriptZ02764-2020 ng/mL
Mouse ILC2 enrichment kitSTEM Cell Technologies19842
Mouse recombinant IL-33STEM Cell Technologies7804420 ng/mL
RPMILife Technologies Corporation22400071
Separation BufferSTEM Cell Technologies201441x PBS + 2% FBS; stored at 4 °C
Small animal nebulizer and chamberData Sciences International
Sterile salineBaxter2F7124; NDC 0338-0048-040.9% Sodium Chloride

Referenzen

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