Proporcionar un enriquecimiento ambiental significativo y medir el cortisol de saliva en cerdos alojados en pisos de lama

Resumen

Este protocolo demuestra cómo proporcionar un enriquecimiento ambiental práctico y significativo para los cerdos que se alojan en pisos de listón durante las diferentes etapas de sus vidas, y cómo recoger muestras de saliva de una manera no invasiva para la medición de concentraciones de cortisol, como biomarcador para el estrés agudo.

Resumen

Dado que la carne de cerdo es la carne más consumida en todo el mundo, el bienestar de los animales en la industria porcina se ha convertido cada vez más en una gran preocupación pública, lo que impone una presión sustancial proveniente de clientes, legisladores y otras partes interesadas, para mejorar el bienestar de estos animales. Varios estudios han demostrado que proporcionar enriquecimiento ambiental a los cerdos les permite expresar su comportamiento natural, como el enraizamiento y la exploración, así como anidar antes del desgarramiento, y se asocia con una reducción del estrés y una mejor producción y bienestar. Sin embargo, deben tenerse en cuenta muchas consideraciones al proporcionar enriquecimiento ambiental, como el tipo de suelo, el drenaje y los sistemas de alcantarillado, la etapa de los cerdos en la vida, el material, así como su método de suspensión, altura y ubicación dentro de la pluma. Los objetivos de este documento son (1) proporcionar información metodológica sobre cómo proporcionar un enriquecimiento ambiental significativo relativamente simple y práctico para los cerdos que se alojan en pisos de lamidos durante las diferentes etapas de su vida, y (2) demostrar cómo recoger muestras de saliva para la medición de las concentraciones de cortisol, como un biomarcador para el estrés agudo. Los protocolos incluyen información sobre el uso de yute, cuerdas de algodón, paja en estantes, así como dispositivos de palos de silicona masticables como enriquecimiento ambiental en plumas de arrowing y lactancia, destetes y acabados. Además, se detalla el uso de cuerda de algodón para una recogida de muestras de saliva no invasiva para el análisis de las concentraciones de cortisol. Los protocolos proporcionados son pertinentes para los profesionales con el objetivo de mejorar y supervisar el bienestar animal, tanto en la investigación como en la agricultura porcina industrial.

Introducción

La carne de cerdo es la carne más consumida en todo el mundo, con más de 1.300 millones de cerdos criados y sacrificados anualmente^1,2. En los últimos años, el bienestar de los animales en la industria porcina se ha convertido cada vez más en una gran preocupación pública, que impone una presión sustancial, proveniente de clientes, legisladores y otras partes interesadas, para hacer cambios en la gestión para mejorar el bienestar de estos animales. Varios estudios demostraron que proporcionar enriquecimiento ambiental a los cerdos se asocia con una reducción del estrés y una mejor producción y bienestar, ya que permite a los cerdos expresar su comportamiento natural, como el enraizamiento y la exploración, así como la anidación antes de farrowing^3,4,5,6,7.

Los cerdos son considerados animales inteligentes, y tienen una naturaleza altamente inquisitiva; por lo tanto, si no se proporciona un entorno adecuado, los cerdos probablemente demostrarán comportamiento estereotípico y comportamiento social manipulador directo hacia las parejas de plumas, lo que puede conducir a mordeduras de cola, así como otras lesiones y estrés^8,9. Por lo tanto, proporcionar un enriquecimiento ambiental significativo es asesorado por profesionales, y en algunos países incluso impuesto por reglamentos y legislaciones, como la Directiva 2008/120/CE del Consejo de la Unión Europea^.

Proporcionar un enriquecimiento ambiental significativo puede ser un desafío; debe satisfacer las necesidades naturales de comportamiento de los cerdos en cada etapa de sus vidas, así como tener en cuenta las limitaciones prácticas y técnicas. Antes del desgarramiento, el suministro de material de anidación se asocia con una duración de cría más corta, así como una mayor tasa de supervivencia de los lechones recién nacidos durante el desgarramiento y durante todo el período de lactancia. Además, en corrales libres con enriquecimiento ambiental, se mejora el comportamiento materno, así como el rendimiento cognitivo y el aumento de peso de los lechones^{3,10,11,12,13}. Después del destete, agrupar cerdos (destetes, crecimientos o rematadores) de diferentes camadas o corrales puede ser estresante y causar agresividad hacia otros compañeros de pluma, lo que puede provocar lesiones^14,15. Por lo tanto, al mezclar cerdos desconocidos, proporcionar un enriquecimiento ambiental significativo puede reducir potencialmente la ocurrencia de comportamientos no deseados resultantes de la frustración y la agresividad o la redirección del comportamiento de enraizamiento.

De conformidad con la Directiva 2008/120/CE del Consejo de la Unión Europea (establecida en 2001/93/CE), se requiere que los cerdos tengan acceso permanente a una cantidad suficiente de material, para permitir actividades adecuadas de investigación y manipulación, como paja, heno, madera, aserrín, compost de setas, turba o una mezcla de estos^5,6. Sin embargo, el uso de estos materiales puede ser inmanejable en muchas granjas, ya que puede causar obstrucción de los sistemas de drenaje y alcantarillado, particularmente en granjas con pisos de listón. Aun así, de acuerdo con la Directiva del Consejo de la UE, los agricultores pueden proporcionar materiales de enriquecimiento alternativos, siempre que permita a los cerdos realizar actividades adecuadas de investigación y manipulación.

La falta de enriquecimiento ambiental puede conducir potencialmente a la frustración y el estrés³, que puede activar el eje suprarrenal hipofisario hipotalámico (HPA). En cerdos, así como en seres humanos y otros animales, el estrés normalmente conduce a la secreción de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) de la glándula pituitaria. ACTH se une a sus receptores en la corteza suprarrenal y estimula la liberación suprarrenal del cortisol glucocorticoides, que se considera como un biomarcador importante del estrés y se puede medir en sangre, orina, saliva y cabello. Saliva cortisol es un marcador de estrés agudo, ya que refleja su concentración biológicamente activa en la sangre⁴. Tiene la ventaja de una recogida de muestras no invasiva, sin manipulación de los animales, por medio de cuerdas de algodón proporcionadas como enriquecimiento ambiental^16,17. El cortisol capilar se utiliza como marcador para el estrés crónico, ya que el cortisol se acumula en el cabello con el tiempo y se puede extraer y medir^18,19; sin embargo, requiere manipulación de animales, el número de muestreos repetidos está limitado por la tasa de crecimiento del cabello, y el análisis es más engorroso ya que requiere un largo proceso de extracción. Sin embargo, tanto la saliva como el cortisol capilar pueden proporcionar información complementaria al bienestar animal de los asnos.

Los objetivos de este documento son :1) proporcionar información metodológica sobre cómo proporcionar un enriquecimiento ambiental significativo relativamente simple y práctico para los cerdos alojados en pisos de listón durante las diferentes etapas de sus vidas (farrowing y lactancia, destetadores a los remates), y (2) para demostrar cómo recoger de forma no invasiva muestras de saliva para la medición de las concentraciones de cortisol, como biomarcador para el estrés agudo.

Protocolo

El protocolo de estudio fue aprobado éticamente por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Hebrea (MD-16-14754-2). El estudio se llevó a cabo durante 2017, en el Instituto de Investigación Animal de Lahav y la Universidad Hebrea de Jerusalén, Israel.

1. Protocolo de enriquecimiento ambiental durante el período de aleteo y lactancia

NOTA: En este estudio, las cerdas se alojaban en corrales de farrowing/lactation, bajo restricción por un tiempo limitado, de 3 a 5 días antes de la fecha de aleteo esperada y hasta 10 días después del agrandado; a partir de entonces, se retiraron las barras de confinamiento, para permitir la libre circulación y la interacción entre la cerda y sus lechones (ilustrado en la Figura 1A). Sin embargo, el siguiente protocolo también es adecuado para las cajas de granallado convencionales, en las que la cerda se restringe durante todo el período de lactancia.

1. Cuelgue los materiales de enriquecimiento (cuerdas de yute y algodón) en la pluma de cría antes de que la cerda se mueva en ella, con el fin de permitir el comportamiento de anidación de las cerdas antes de la cría.
2. Para cada pluma/caja, prepare dos piezas de yute (20 cm de ancho, un metro de largo) y dos piezas de cuerdas de algodón 100% naturales y sin color (2-3 cm de diámetro), aproximadamente de un metro de largo cada una.
3. Ate las cuerdas de yute y algodón (doble nudo de mano) a las barras de la pluma /cajas, como se ilustra en la Figura 1,desde su centro, permitiendo colgar los dos extremos libres de cada pieza hacia el suelo. La altura de los nudos de cuerdas de yute y algodón debe ser inferior al hombro de las cerdas, mientras que sus extremos libres están justo por encima del suelo(Figura 1B-C).
4. Las cerdas suelen estar interesadas en las cuerdas de yute y algodón; a menudo tiran y lo mastican. Por lo tanto, reemplace o rellene los materiales cuando estén sucios o terminados.
   NOTA: En este estudio, los materiales fueron inspeccionados cada 4-5 días, y reemplazados o rellenados cuando fue necesario.
5. Después de nacer los lechones, cuelgue las cuerdas de yute y algodón para que sean accesibles tanto para la cerda como para sus lechones, en un lugar seguro. Típicamente, cuando los materiales son accesibles para ambos, los lechones imitan sus presas desde una edad muy temprana.
   NOTA: Como adición, el papel triturado también se puede proporcionar como enriquecimiento ambiental para las cerdas y lechones, en el suelo de lama. Sin embargo, la compatibilidad de los sistemas de drenaje y alcantarillado debe examinarse críticamente en la granja específica.

2. Protocolo de enriquecimiento ambiental para destetes (cuando no se puede proporcionar paja)

NOTA: En este estudio, después del destete, cada camada se agrupaba en una pluma de destetes. De manera óptima, los grupos deben permanecer estáticos hasta el sacrificio, sin mezclar ni introducir nuevos compañeros de pluma en la pluma, para evitar problemas y lesiones relacionados con la jerarquía. La asignación de espacio en la pluma estaba de acuerdo con la Directiva 2008/120/CE del Consejo Europeo y la legislación israelí, con aproximadamente 20 cerdos por grupo, y 0,3^m2 de superficie de suelo sin obstrucciones disponibles por cerdo. Por razones técnicas, no se podía proporcionar paja para los destetes, ni siquiera en bastidores. Cuando se pueda proporcionar paja, utilice el protocolo de los remates desde el destete hasta el sacrificio, como se detalla en la sección 3 del protocolo.

1. Para cada pluma, prepare trozos de un metro de largo de cuerdas de algodón 100% naturales y sin color, de 2-3 cm de diámetro; al menos una pieza por cada 10 cerdos. Ate las cuerdas de algodón a una cadena colgada del techo o a un poste colgante (para distanciarlo de la pared), como se muestra en la Figura 2B.
   1. Coloque las cuerdas preferentemente en el centro del área "activa" de la pluma, cerca del alimentador y de los bebedores, y lejos de la pared de los bolígrafos (como se indica en la Figura 2A)para permitir el acceso de 360o, lo que se espera que impida un comportamiento agresivo debido a la Competencia.
2. Cuelgue las cuerdas a una altura que permita a los cerdos alcanzarlas con la boca fácilmente. Típicamente, el nudo debe ser más bajo que el hombro de los cerdos, mientras que los extremos libres de las cuerdas deben estar justo por encima del suelo, sin tocarlo(Figura 2).
3. Reemplace o rellene las cuerdas cuando estén sucias o acabadas.
   NOTA: En este estudio los materiales fueron inspeccionados cada 4-5 días, y reemplazados o rellenados cuando fue necesario.
4. Además de las cuerdas de algodón, proporcione palos de silicona masticables o dispositivos masticables similares(Figura 2). El dispositivo utilizado (ver la Tabla de Materiales)contiene cuatro palos masticables que permiten que al menos cuatro cerdos interactúen con el dispositivo simultáneamente. Proporcione un dispositivo por cada 10 a 15 cerdos.
5. Cuelgue el dispositivo masticable con una cadena del techo (incluido en el kit) para permitir el movimiento de balanceo del dispositivo; esto aumenta la actividad y el desafío a los cerdos, y también permite que más cerdos participen a la vez.
   1. Coloque el dispositivo en el centro del área activa de la pluma, lejos de las paredes de la pluma para permitir el acceso de 360o, lo que se espera que evite un comportamiento agresivo debido a la competencia. El extremo de los palos de silicona debe estar a una altura de 10 a 20 cm por encima del suelo.
6. Cambie los palos de silicona cuando haya terminado o esté sucio.
   NOTA: En este estudio, los palos de silicona solo deben cambiarse cuando se mueven de las plumas de los destetes a las plumas de los remates.

3. Protocolo de enriquecimiento ambiental para acabadores

NOTA: Cuando la paja se pueda proporcionar durante todo el período, comience a usar este protocolo desde el destete hasta el sacrificio, en lugar de solo en los bolígrafos de los remates.

1. Proporcione a cada pluma paja la paja colocada en un estante, en una red colgada o en una torre, como se ilustra en la Figura 2C. Cuando se proporciona en estos dispositivos, sólo pequeñas cantidades de la paja están disponibles para los cerdos a la vez, y la mayor parte de ella se está masticando. Por lo tanto, este enriquecimiento se puede utilizar en pisos de lamidos, cuando la paja no se puede proporcionar como ropa de cama.
   NOTA: En este estudio, la paja se proporcionó en bastidores comerciales(Figura 2C).
2. Cuelgue los estantes de paja a una altura que sea accesible para todos los cerdos, por lo general justo por debajo del nivel del hombro. Adjúntelos a la pared con el acceso más fácil para el mayor número posible de cerdos, preferiblemente dentro de la "zona activa". Asegúrese de que los bastidores estén bien fijados y fijados de forma segura a la pared para evitar roturas y lesiones en el dispositivo.
3. Asegúrese de que los estantes estén completamente llenos de paja al principio; una pequeña cantidad adicional de paja fresca se puede añadir cada 1-3 días. Alternativamente, rellene cuando el bastidor esté vacío, normalmente cada 7-10 días.
   NOTA: La paja larga es mejor que la paja picada para reducir la agresividad en el grupo y satisfacer las necesidades de comportamiento de los cerdos para enraizar y explorar²⁰.
4. Cuando corresponda, considere colocar una bandeja de recogida o una estera debajo del bastidor, cuando el suelo esté lamido, para evitar que la paja se disperse y bloquee los sistemas de drenaje y alcantarillado(Figura 2C). Dado que la paja se proporciona para que los cerdos cumplan principalmente su comportamiento de enraizamiento y exploración, una estera puede permitir la presencia de algo de paja libre para ser explorada a nivel del suelo.
5. Además de la paja, proporcione dispositivos masticables, como se detalla en la sección 2.
6. Cuando se utilizan cuerdas de algodón para la recolección de saliva, como se detalla en la siguiente sección, deje las cuerdas en las plumas después de la recolección de saliva, como un enriquecimiento adicional. También se pueden proporcionar otras cuerdas de algodón, como se detalla en la sección 2.

4. Recogida de muestras de saliva para el análisis de concentraciones de cortisol

NOTA: Esta sección proporciona información sobre cómo recoger de forma no invasiva saliva para el análisis de la concentración de cortisol, como biomarcador para el estrés agudo; sin embargo, las muestras de saliva también se pueden utilizar para el análisis de otros biomarcadores e incluso para el cribado de patógenos potenciales. Además, el cortisol capilar debe medirse cuando corresponda.

1. Planificar el muestreo de saliva para la misma hora del día, para evitar el sesgo, como la secreción de cortisol cambia a lo largo del día debido al ritmo circadiano fisiológico, o debido a la alimentación²¹. El muestreo suele ser más fácil antes de alimentarse, preferiblemente antes de la segunda alimentación del día.
2. Utilice cuerda de algodón 100% sin color (2-3 cm de diámetro). Una cuerda es típicamente necesaria por 12-15 cerdos.
   NOTA: En este estudio, se utilizaron kits comerciales y listos para usar para la recolección de muestras de saliva.
3. Ate la cuerda cerca del centro de la pluma, lejos de la pared de los bolígrafos. Asegúrese de que el cable que se utiliza para colgar (entre la cuerda de algodón y la barra) no es accesible para masticar por los cerdos, y que los extremos libres de las cuerdas de algodón no tocan el suelo, por razones de higiene(Figura 3A).
4. Desentrañar el extremo libre de la cuerda, para aumentar la superficie masticable disponible(Figura 3B).
5. Deje la cuerda colgando durante 15-30 min. Típicamente, los cerdos están interesados en las cuerdas recién proporcionadas y la masticarían durante este tiempo. Típicamente, la gran mayoría de los cerdos se acercan a la cuerda.
6. Para extraer la saliva de la cuerda, coloque la parte libre de la cuerda en una bolsa de plástico estéril (como se ilustra en la Figura 3D)y apriete la cuerda aplicando presión desde el exterior de la bolsa, de arriba a abajo, hasta que haya suficiente líquido (sugerido en al menos 2 ml) se acumula en la parte inferior de la bolsa(Figura 3E)y luego retire la cuerda de la bolsa.
   NOTA: En este estudio se incluyó una bolsa de 30 cm x 40 cm en el kit. Si es posible, este paso debe realizarse en la pluma sin cortar el cable colgante. De esta manera, la extracción de saliva suele ser más fácil, y las cuerdas se pueden dejar en la pluma como un enriquecimiento. Si no hay suficiente saliva, se puede utilizar un escurridor (no fue necesario en este estudio).
7. Para transferir la saliva de la bolsa a un tubo estéril, tire de la cuerda y corte cuidadosamente la esquina inferior de la bolsa por encima de un tubo de plástico estéril de 50 ml (aunque normalmente sólo se requieren 400 l para cada análisis en duplicados, se recomiendan al menos 2 ml para collectio n; Figura 3F). Sellar el tubo y marcarlo con un marcador permanente o una pegatina pre-preparada (animales/lápiz, fecha, hora, granja, etc.).
8. Almacene las muestras de saliva en un recipiente aislado con compresas de hielo hasta que se entreguen al laboratorio.
9. En el laboratorio, centrífuga muestramuestras de saliva hasta que la suciedad se pueda separar (durante 8 min a 3000 x g). La saliva limpia debe transferirse con una pipeta Pasteur desechable limpia en tubos estériles premarcados de menor volumen (por ejemplo, tubos congeladores de tapa de tornillo de 2 ml) para mayor comodidad. Las muestras se pueden analizar inmediatamente, o se pueden mantener congeladas a una temperatura de -20 oC o por debajo hasta el análisis.
10. Antes del análisis de la concentración de cortisol, se debe confirmar la identidad de las muestras pertinentes y las muestras deben descongelarse a temperatura ambiente si se congelan. Mezcle suavemente cada muestra y, a continuación, centrifugarla de nuevo antes del análisis para eliminar la posible suciedad sobrante que puede interferir con el ensayo (8 min a 3000 x g).
11. Realizar análisis de concentraciones de cortisol con un ensayo validado, de acuerdo con el protocolo específico del kit.
    NOTA: En este estudio, las muestras de cortisol de saliva se midieron en duplicados mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de acuerdo con las directrices del fabricante. Para los cerdos que anteriormente se les proporcionaban cuerdas como enriquecimientos, recoger saliva sería muy fácil ya que los cerdos muestran un gran interés en las cuerdas. Sin embargo, para los cerdos que no están familiarizados con las cuerdas, puede tomar tiempo para el entrenamiento; por lo tanto, la recolección de saliva adecuada puede no ser posible desde la primera vez. Si es necesario, las cuerdas se pueden empapar en jugo de manzana para el entrenamiento (obviamente, en tal caso, la saliva no se puede utilizar para el análisis). Si se necesitan muestras de saliva de cerdos alojados individualmente, la recolección puede ser más difícil que de un grupo, y normalmente se requieren sesiones de entrenamiento con cuerdas empapadas con jugo de manzana. La masticación de cuerdas de recolección también puede ser fomentada por muestreo de individuos uno al lado del otro debido a la imitación.

Resultados

En el estudio actual, 16 camadas (170 lechones) se asignaron aleatoriamente en dos grupos de tratamiento; en un grupo, el enriquecimiento ambiental se proporcionó a ocho camadas ("Grupo enriquecido", como se describe en las secciones 1-3 del protocolo), mientras que no se proporcionó a las otras ocho camadas ("Grupo no enriquecido"). Después del destete, cada dos camadas se agruparon en un grupo de unos 20 cerdos. Se recogieron y analizaron muestras de saliva para las concentraciones d...

Discusión

Aquí, describimos protocolos que detallan cómo proporcionar un enriquecimiento ambiental simple y práctico para los cerdos que se alojan en el suelo de latigazo durante las diferentes etapas de su vida, y cómo recoger de forma no invasiva muestras de saliva para la medición del cortisol concentraciones, como biomarcador para el estrés agudo. La paja como ropa de cama se considera como uno de los enriquecimientos ambientales más adecuados para los cerdos, pero puede ser poco práctica en suelos de lamas. Sin embarg...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bite-Rite	Ikadan System USA Inc.		Consider ordering additional replaceable silicone sticks
ELISA; Saliva Cortisol Kit	DRG International Inc. NJ, USA	Slv2930
HALM 60/80 CM	W. Domino A/S, DK	49084/ 85
TEGO Swine Oral Fluids Kit	ITL BioMedical, USA	A100930	Including everything needed for the saliva sampling protcol