Preparación de sistemas eutécticos profundos binarios y ternarios

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo estandarizar la preparación de sistemas eutécticos profundos en toda la comunidad científica para que estos sistemas puedan ser reproducidos.

Resumen

La preparación de sistemas eutécticos profundos (DES) es a priori un procedimiento simple. Por definición, dos o más componentes se mezclan en una relación molar dada para formar un DES. Sin embargo, a partir de nuestra experiencia en el laboratorio, es necesario estandarizar el procedimiento para preparar, caracterizar e informar las metodologías seguidas por diferentes investigadores, para que los resultados publicados puedan ser reproducidos. En este trabajo, probamos diferentes enfoques reportados en la literatura para preparar sistemas eutécticos y evaluamos la importancia del agua en la preparación exitosa de sistemas líquidos a temperatura ambiente. Estos sistemas eutécticos publicados estaban compuestos de ácido cítrico, glucosa, sacarosa, ácido málico, alanina, ácido L-tartárico y betaína y no todos los métodos de preparación descritos podrían reproducirse. Sin embargo, en algunos casos, fue posible reproducir los sistemas descritos, con la inclusión del agua como tercer componente de la mezcla eutéctica.

Introducción

Los disolventes eutécticos profundos han sido nombrados disolventes para el siglo XXI y se consideran una nueva generación de disolventes. Se definen como una mezcla de dos o más compuestos químicos a una proporción molar particular para dar lugar a una disminución significativa en la temperatura de fusión de los componentes individuales, convirtiéndose en líquido a temperatura ambiente^{1,2, 3}. En este sentido, la preparación de los disolventes no requiere ninguna reacción química y por lo tanto el rendimiento de producción es del 100%. En 2011, Choi y sus compañeros de trabajo informaron de la posibilidad de DES de origen natural y los nombraron, disolventes eutécticos profundos naturales (NADES)^3,4,5. NADES se puede preparar a partir de diferentes combinaciones de azúcares, aminoácidos, ácidos orgánicos y derivados de la colina; y estos sistemas preparados a partir de componentes naturales son intrínsecamente biocompatibles y biodegradables, presentando una toxicidad considerablemente menor en comparación con otros disolventes alternativos (por ejemplo, líquidos iónicos)^{5,6, 7,8}. Desde 2015, el número de publicaciones en el campo ha aumentado exponencialmente y las posibles aplicaciones de NADES son muy amplias^3. A pesar de que se han publicado muchos manuscritos y reseñas, hay preguntas fundamentales que persisten, y los científicos aún no han encontrado la respuesta a preguntas intrigantes como los mecanismos subyacentes a la formación DES. Comprender el mecanismo de formación de DES conduciría a un enfoque consolidado hacia el desarrollo de nuevos sistemas, en lugar del enfoque actual de ensayo y error. Además, las oportunidades en el campo están creciendo cada día, a medida que los consumidores se vuelven más conscientes de la sostenibilidad de sus productos, no sólo en términos de su vida útil final, sino también en términos de procesamiento en sí^{8,9, 10}. Para impulsar grandes innovaciones en el campo de los disolventes eutécticos profundos, primero se requiere la estandarización de los métodos de producción y caracterización. La falta de reproducibilidad de algunos de los sistemas reportados en la literatura fue la motivación para desarrollar este trabajo a medida que nos enfrentamos a este problema varias veces. En este documento, demostramos la necesidad y la importancia crucial para describir con precisión los materiales y métodos y demostramos que aunque la preparación de DES es un procedimiento simple y directo, hay algunos aspectos clave (por ejemplo, la presencia / cantidad de agua) que siempre debe ser discutido.

Protocolo

NOTA: Los NADES estudiados fueron betaína:L-(+)-ácido tartárico (2:1), ácido -alanina:dl-malic (3:2), glucosa:sacarosa (1:1) y ácido cítrico:glucosa (2:1). Estos sistemas fueron preparados por diferentes métodos: secado por congelación (FD), evaporación al vacío (VE), y calor y agitación (HS) con y sin agua. Por ejemplo, se da el protocolo para el sistema ácido cítrico:glucosa (2:1). Los NADES se caracterizaban por calorimetría de escaneo diferencial (DSC), microscopía óptica polarizada (POM), contenido de agua y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN).

1. Preparación de NADES

1. Secado por congelación
   1. En recipientes separados, añadir 2 g de ácido cítrico monohidrato y 0,9530 g de glucosa monohidrato. Añadir 10 ml de agua desionizada a cada uno y remover hasta que los compuestos se disuelvan por completo.
   2. Mezcle las dos soluciones y garantice la homogeneización de la solución final. Coloque la solución en un matraz inferior redondo.
   3. Congele con nitrógeno líquido. Coloque el matraz en un secador de congelación durante 48 horas para asegurarse de que se retira toda el agua de la muestra.
2. Evaporación de vacío
   1. Pesar 2 g de ácido cítrico monohidrato y 0,9530 g de glucosa monohidrato en recipientes separados. Añadir 10 ml de agua desionizada a cada uno y remover hasta que los compuestos se disuelvan por completo.
   2. Mezcle las dos soluciones y garantice la homogeneización de la solución. Coloque la solución en un matraz inferior redondo.
   3. Con un evaporador rotativo, seque la muestra hasta que se forme un líquido transparente y viscoso.
3. Calefacción y agitación
   1. Pesar 2 g de ácido cítrico monohidrato y 0,9530 g de glucosa monohidrato en el mismo vial. Añadir 278 s de agua.
   2. Coloque el vial con una barra de agitación magnética en un baño de agua de 50 oC.
   3. Deje la muestra hasta que se forme un líquido transparente y viscoso.

2. Caracterización de NADES

1. Microscopía óptica polarizada (POM)
   1. Coloque una gota de NADES en un portaobjetos de vidrio del microscopio para observación.
   2. Utilizando el modo de transmisión de un microscopio, realice la caracterización óptica de la muestra a temperatura ambiente.
2. Valoración de Karl-Fisher
   1. Recoger 100 sL de NADES en una jeringa, y luego limpiar el exceso de líquido en el exterior.
   2. Coloque la jeringa en una báscula y arare.
   3. Presione START en el equipo KF y agregue una pequeña gota de la muestra al recipiente.
   4. Pesar la jeringa, introducir la masa en el equipo KF y pulse ENTER. El resultado aparecerá en la pantalla en ppm de agua.
3. Calorimetría de escaneo diferencial (DSC)
   1. Coloque 3-10 mg de cada muestra en una bandeja hermética de aluminio con una tapa de recubrimiento. Cierre la sartén con una prensa de muestra.
   2. Analizar las muestras utilizando un DSC con un rango de temperatura de -90 oC hasta la temperatura de degradación, con una velocidad de calentamiento de 10 oC/min. Realizar dos ciclos con una retención isotérmica de 2 min y analizar bajo una atmósfera de nitrógeno (50 ml/min).
4. Resonancia magnética nuclear (NMR)
   1. Preparar un tubo de RMN de 5 mm disolviendo 250 ml de NADES con 250 ml de dimetil sulfóxido-d6 (DMSO-d₆).
   2. Adquiera los espectros ^{de 1}H y NOESY a 25 oC en un espectrómetro de 400 MHz.
   3. Utilice un software adecuado para analizar los espectros y utilice el desplazamiento químico de DMSO-d6 (2,50 ppm) para asignar todas las señales de cada componente.

Resultados

A partir de la preparación de NADES, los resultados que esperamos obtener se muestran en la Figura 1. A continuación se hace una descripción de cada sistema. Usando el método de secado por congelación, el resultado debe ser una pasta sólida o muy densa ya que toda el agua se elimina del sistema. Utilizando el método de evaporación, el resultado debe ser un líquido transparente y viscoso. Utilizando el método de calentamiento y agitación con la adición de pequeñas cantidades de agua, el resultado debe ser un líquido claro y muy viscoso.

Los resultados obtenidos de POM se pueden ver en la Figura 1. Cuando un NADES está completamente formado, esperamos ver una imagen negra, que indica que la muestra es completamente amorfo y que no quedan cristales en el sistema. Los resultados obtenidos de la valoración KF se describen en la Tabla 2. Además de la cantidad de agua que se añade a los sistemas, el porcentaje de agua de la mezcla final también depende del contenido de agua de los reactivos.

En cuanto al DSC, el objetivo de esta técnica es también confirmar que el sistema es líquido en el rango de temperatura que se aplicará, por lo que el resultado esperado es tener un termograma que no muestre eventos térmicos en el rango de temperatura de interés(Tabla 2 ). La técnica NMR se utiliza para confirmar la existencia de la formación de enlaces de hidrógeno, que es la característica principal de los sistemas NADES. Esto puede ser confirmado por la observación del cambio en los cambios químicos de cada señal, y por el análisis de los espectros NOESY, que muestra correlaciones espaciales e intermoleculares(Figura 2).

Componente 1	Componente 2	Método de preparación	Referencia
Betaína (Bet)	L-(+)-ácido tartárico (LTA)	Evaporación al vacío (VE)	(2013)5 y Espino et al. (2016)6
- Alanina (A-A)	Acido DL-Málico (MA)	Evaporación al vacío (VE)	(2013)5 y Espino et al. (2016)6
Glucosa (Gluc)	Sacarosa (Suc)	Secado por congelación (FD)	(2011)4 y Espino et al. (2016)6
Acido cítrico (CA)	Glucosa (Gluc)	Secado por congelación (FD)	(2011)4 y Espino et al. (2016)6

Tabla 1: Sistemas reportados en la literatura y su método de preparación.

NADES	Método de preparación	Contenido de agua (%)
		Medida Karl Fischer
Apuesta:LTA (2:1 + 20% agua)	Calentar y agitar, añadiendo agua	19,94 x 1,28
Apuesta:LTA (2:1)	Evaporación al vacío	11,36 á 0,78
A-A:MA (3:2 + 11% agua)	Calentar y agitar, añadiendo agua	11,45 á 0,25
A-A:MA (3:2)	Evaporación al vacío	18,84 á 1,78
Gluc:Suc (1:1 + 21% agua)	Calentar y agitar, añadiendo agua	20,88 a 0,13
Gluc:Suc (1:1)	Evaporación al vacío	22,56 a 0,48
CA:Gluc (2:1 + 17% agua)	Calentar y agitar, añadiendo agua	17,33 a 0,68
CA:Gluc (2:1)	Evaporación al vacío	20,04 a 0,26

Cuadro 2: Contenido de agua (%) de los sistemas preparados por diferentes métodos.

Figura 1: Resultados representativos de los NADES cuando se preparan por a) liofilización, b) evaporación al vacío y c) calentamiento y agitación con adición de agua. La imagen muestra que cuando el sistema se liofiliza, el resultado obtenido es un cristal ya que toda el agua se elimina de la mezcla, mientras que cuando se utilizan métodos VE y HS, la cantidad de agua necesaria para que los NADES se formen y el resultado obtenido sea un hom líquido ógeno a temperatura ambiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Microscopía óptica polarizada de CA:Glu (2:1) preparada por diferentes métodos, con polarizadores cruzados (imagen izquierda) y polarizadores paralelos (imagen derecha) – 100 m (amplificación de 10x). Las imágenes negras muestran que la muestra es un líquido a temperatura ambiente. La muestra de FD está completamente cristalizada ya que el resultado obtenido de esta técnica no fue un líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: a) Superposición de ¹espectros de RMN H del sistema (A) NADES ácido cítrico:glucosa:agua (2:1:4), (B) glucosa y (C) ácido cítrico; b) Espectro NOESY del sistema NADES ácido cítrico:glucosa:agua (2:1:4). Los espectros superpuestos muestran la diferencia en los cambios químicos de cada componente tras la formación de DES, originados por el establecimiento de enlaces de hidrógeno entre ellos. El espectro NOESY muestra la interacción entre el protón OH del ácido cítrico con los protones restantes de ambos componentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Las diferentes metodologías reportadas en la literatura para la preparación de NADES son un método de calentamiento y agitación (HS), evaporación al vacío (VE) y liofilización (FD). Los sistemas que hemos preparado en esta obra son descritos por diferentes autores en la literatura^4,5,6,10,11. La Tabla 1 enumera los componentes de cada mezcla, como se indica en el manuscrito original, así como su método de preparación.

Tras nuestras investigaciones para reproducir los sistemas descritos, nos dimos cuenta de que en algunos casos no era posible lograr un NADES similar, como una muestra líquida clara, viscosa, a temperatura ambiente. La preparación de un NADES se basa en muchos factores. Algunos se pueden controlar fácilmente, pero otros son más difíciles de estandarizar. Lo más importante a tener en cuenta es que el producto final no puede depender de factores externos como el equipo utilizado.

Los sistemas preparados por diferentes métodos se caracterizaron entonces. Con la microscopía óptica polarizada (POM), se observó que con el método HS sin agua, incluso a diferentes temperaturas, el NADES no formaba un líquido claro y viscoso. Sin embargo, se observó un líquido homogéneo y claro y viscoso representado en la Figura 1 al aplicar el método del SA con pequeñas cantidades de agua y el método VE para la preparación del NADES.

DSC se utilizó para determinar los eventos térmicos de la mezcla. Los resultados mostraron que el sistema es líquido a temperatura ambiente y de hasta 130 oC, ya que el termograma no muestra eventos térmicos. El contenido de agua de cada muestra se midió mediante la valoración karl-Fischer, y los resultados se representan en el Cuadro 2. Deberá indicarse el contenido de agua de los sistemas, ya que es el parámetro que más influye en las propiedades del líquido obtenido, como la viscosidad y la polaridad. Estos cambios tienen un gran impacto en el resultado de la aplicación para la que está diseñado el NADES.

La RMN también se utilizó para confirmar la formación de los sistemas NADES mencionados, a través de la formación de enlaces de hidrógeno entre las moléculas de cada sistema. Un ejemplo se da en la Figura 2 para el sistema NADES ácido cítrico:glucosa (2:1) con 17% de agua obtenida por el SA donde el espectro de protones de este NADES y los materiales de partida (ácido cítrico y glucosa) están superpuestos(Figura 2a). A partir de esto, es posible observar cambios en los cambios químicos de algunos protones de cada molécula. El cambio principal es el cambio del protón OH del ácido cítrico. Originalmente, esta señal aparece a 5,16 ppm, pero esta señal se desplaza a 6,22 ppm debido a la formación de enlaces de hidrógeno. Esto es confirmado por el espectro NOESY(Figura 2b),donde la fuerte interacción entre el OH del ácido cítrico y los protones restantes es visible. Se observó una interacción similar para los otros sistemas NADES.

En este estudio observamos que la descripción del método de preparación para los sistemas eutécticos reportados en la literatura a veces son incompletas, debido a la falta de información sobre el contenido de agua de la mayoría de los sistemas. En el método VE, el agua se añade mediante la preparación de soluciones de diferentes componentes y la mezcla a una temperatura que conduce a la formación de sistemas eutécticos; sin embargo, no podemos estar seguros del contenido mínimo de agua requerido. Por lo tanto, se considera el conocimiento del porcentaje de agua necesaria para formar los sistemas, un punto crucial que siempre debe notificarse, para que otros puedan reproducir la preparación de las diferentes mezclas eutécticas.

El mejor método a utilizar es el método HS con agua añadida, ya que se tarda menos tiempo en prepararse, para los casos en los que el contenido de agua ya está descrito. Sin embargo, si esta información no está disponible, el método más fácil es el método VE, donde se elimina toda el agua disponible y sólo el agua que interactúa con los componentes NADES permanece en el sistema. En cualquier caso, los investigadores deben dejar que los sistemas se evaporen durante el tiempo suficiente para garantizar que el agua libre se elimina del sistema. Este tiempo depende del equipo y por lo tanto no es suficiente describir en la sección de materiales la duración del método VE, pero el contenido de agua siempre tiene que ser reportado.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mm NMR tube	Norell
Acid citric monohydrate	Sigma-Aldrich
Advance III spectrometer	Bruker
Deionized water
dimethyl sulfoxide-d6	Sigma-Aldrich
DSC Q200	TA Instruments, USA
Freeze-dryer CHRIST ALPHA 1-4	Braun Biotec International
Glucose monohydrate	Cmd chemicals
Karl Fisher Coulometer	Metrohm
Olympus BX-51 polarized optical microscope	Olympus