Separación del sobre celular para bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

Resumen

Las bacterias gramnegativas producen dos membranas segregadas espacialmente. La membrana externa se divide a partir de la membrana interna por una periplasma y una capa de peptidogglicano. La capacidad de aislar las bicapas duales de estos microbios ha sido fundamental para entender su fisiología y patogénesis.

Resumen

Este método funciona dividiendo la envoltura de bacterias Gram-negativas en fracciones totales, internas y externas de membrana (OM) y concluye con ensayos para evaluar la pureza de las bicapas. El OM tiene una mayor densidad global en comparación con la membrana interna, en gran parte debido a la presencia de lipooligosacáridos (LOS) y lipopolisacáridos (LPS) dentro del prospecto exterior. Las moléculas LOS y LPS son glucólidos anfipááticos que tienen una estructura similar, que consiste en un disanolípido lípido-A y un sustituito de oligosacárido central. Sin embargo, sólo las moléculas lpS están decoradas con una tercera subunidad conocida como O-polisacárido, o oantígeno. El tipo y la cantidad de glucólidos presentes afectarán la densidad OM de un organismo. Por lo tanto, probamos si las membranas de bacterias con contenido variado de glucólidos podrían aislarse de manera similar utilizando nuestra técnica. Para los organismos productores de LPS, Salmonella enterica serovar Typhimurium y Escherichia coli, las membranas fueron fácilmente aisladas y la mitad del antígeno O-antígeno LPS no impactó la partición bicapa. Acinetobacter baumannii produce moléculas LOS, que tienen una masa similar a las moléculas LPS deficientes de O-antígeno; sin embargo, las membranas de estos microbios no podían separarse inicialmente. Razonamos que el OM de A. baumannii era menos denso que el de Enterobacteriaceae, por lo que el gradiente de sacarosa se ajustó y las membranas fueron aisladas. Por lo tanto, la técnica puede ser adaptada y modificada para su uso con otros organismos.

Introducción

Las bacterias gramnegativas producen dos membranas que están separadas por un espacio periférico y una pared celular de peptidoglycan¹. La membrana interna (IM) encierra el citosol y es una bicapa simétrica de fosfolípidos. Peptidoglycan protege contra la presión del turgencia y proporciona a la bacteria una forma celular, y está unido a la membrana externa (OM) por lipoproteínas^2,,3. El OM rodea la periferia y es predominantemente asimétrico. El prospecto interno se compone de fosfolípidos y el prospecto externo consiste en glucólidos conocidos como lipooligosacáridos (LOS) o lipopolisacáridos (LPS)^4,5. La asimetría lipídica y la bioquímica de las moléculas LOS/LPS en el prospecto exterior confieren propiedades de barrera a la superficie celular que protegen la bacteria contra los peligros en su entorno^6,7.

Las moléculas de LPS se componen de tres componentes: el disacárido lipídico A, el oligosacárido central y el o-polisacárido u antígeno O. El lípido A es un disacárido acilado multiplicado. Los oligosacáridos de núcleo consisten en 10-15 azúcares conocidos como LPS áspero sordos o R-LPS. El núcleo se subdivide en la región interna, compuesto por ácido 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic (kdo) y uno o más residuos de heptosa, y una región externa que consiste generalmente de hexosis (glucosa o galactosa) y heptoses, o azúcares acetamido⁵. La región del núcleo exterior es más variable en sus componentes y estructura que el núcleo interno. En Salmonella spp., sólo se ha descrito una estructura central; sin embargo, en Escherichia coli hay cinco estructuras centrales diferentes (designadas K-12, R1, R2, R3 y R4)⁸. E. coli K-12 DH5, que utilizamos en este procedimiento lleva una mutación que resulta en la producción R-LPS⁹. Las moléculas R-LPS carecen de la mitad del antígeno O y tienen un peso molecular similar a las moléculas LOS.

La adición de antígeno O a R-LPS convierte esta molécula en LPS liso, o S-LPS. Los antígenos O se construyen a partir de subunidades cortas de carbohidratos de 3-4 y consisten en múltiples modalidades con diferentes longitudes de cadena^10. Algunas bacterias productoras de LPS, como Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), muestran una distribución trimodal de moléculas LPS en su superficie^10,11. Los antígenos O de cadena muy larga pueden contener más de cien subunidades y pesar más de cien kilodaltones. Los antígenos O proporcionan propiedades superficiales a la bacteria que son necesarias para resistir los antibióticos, evadir la depredación por bacteriófagos y causar enfermedades.

Las especies de Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria y otras generan moléculas LOS en lugar de moléculas LPS en su superficie^12. Las moléculas LOS consisten en lípidos A y oligosacáridos centrales, pero carecen del antígeno O. Estos tipos de bacterias Gram-negativas modifican sus oligosacáridos principales con azúcares adicionales y combinaciones de azúcares para alterar las propiedades superficiales^12. Tanto los microbios productores de LOS como los LPS derivan los fosfatos en el lípido A y las moléculas centrales con mitades catiónicas^7. Estas adiciones incluyen sustituciones de fosfoetanolamina, galactosamina y aminoarabinosa, que funcionan neutralizando la carga superficial aniónica y protegiendo así contra los péptidos antimicrobianos catiónicos. Las bacterias gramnegativas también modifican la estructura del oligosacárido central con sustituciones variables no estequiométricas de azúcares, o moléculas de kdo adicionales, y alteran el número de cadenas de acil en los disanolípidos lípidos-A⁷.

La capacidad de aislar el IM del OM de las bacterias Gram-negativas ha sido fundamental para entender el papel de la envoltura celular en la resistencia a los antimicrobianos y la patogénesis de la enfermedad^11,12. Las derivaciones de este enfoque se han utilizado para deducir mecanismos de montaje, mantenimiento y remodelación de la proteína, fosfolípidos y componentes glucólidos para el OM.

Nuestro laboratorio realiza rutinariamente análisis lipidomicos bacterianos para estudiar la regulación de lípidos mediada por proteínas y la función de lípidos en una variedad de especies Gram-negativas. Los volúmenes utilizados en el protocolo reflejan el uso rutinario de este procedimiento para analizar fosfolípidos no radiomarcados mediante cromatografía de capa delgada y cromatografía líquida espectrometría de masas en tándem^13,14.

El protocolo comienza exponiendo una suspensión refrigerada de bacterias Gram-negativas a una solución osmolar alta de sacarosa y añadiendo lisozyme para disociar el OM de la capa subyacente de peptidoglycan(Figura 1)¹². EDTA se añade entonces para facilitar la penetración de la lisozyme, ya que el secuestro de cationes divalentes interrumpe las interacciones de puente electrostático lateral entre las moléculas adyacentes los PÉRDIDA/LPS¹⁵. El protocolo original del que se ha adaptado el nuestro requería la formación de esferoplastias, una forma celular bacteriana Gram-negativa que consiste en una membrana plasmática y citosol, pero carece de la capa de peptidoglicano y un OM. Es posible que las esferoplastias se produzcan por el método adaptado; sin embargo, la técnica no se basa ni pretende su formación para el éxito. En su lugar, las bacterias tratadas con lisozyme-EDTA se cosechan rápidamente por centrifugación y se vuelven a suspender en una solución de sacarosa de menor concentración antes de la lisis presurizada. Los oMs que podrían haber sido liberados mediante la formación de esferoplastias deberían, en teoría, ser cosechables de los sobrenadores de las células tratadas, pero este enfoque no se detalla en este documento. En última instancia, las células tratadas se someten a homogeneización y lisis convencionales, lo que mejora la eficiencia y reproducibilidad del procedimiento de separación de^{membranas 16}.

Después de la lisis, las membranas totales se recogen por ultracentrifugación y se aplican a un gradiente discontinuo de densidad de sacarosa para fraccionar los MN y oMs. El enfoque clásico utiliza un gradiente más continuo que consiste en al menos cinco soluciones de sacarosa diferentes^11,12. El gradiente discontinuo de nuestro protocolo consta de tres soluciones de sacarosa y divide las bicapas en dos fracciones diferenciadas^17. Las moléculas LOS y LPS dentro de los OMs de las bacterias Gram-negativas impulsan la envolvente a dividirse en una fracción IM de baja densidad marrón superior y una fracción OM de alta densidad blanca inferior(Figura 1 y Figura 2).

Acinetobacter baumannii son importantes patógenos humanos multirresistentes que producen moléculas LOS en su OM y erigen una envoltura celular que es difícil de separar^18,,19. Los trabajos recientes sugieren que una derivación del protocolo que presentamos aquí se puede utilizar para dividir las bicapas de estos organismos²⁰. Por lo tanto, probamos nuestro protocolo en A. baumannii 17978. Inicialmente, el procedimiento era inadecuado. Sin embargo, modificamos la concentración de sacarosa de la solución de densidad media y mejoramos en gran medida la separación(Figura 2). Se utilizó un ensayo de deshidrogenasa NADH y un procedimiento de extracción y detección de LOS/LPS para confirmar la separación de A. baumannii,tipo salvaje S. Typhimurium y dos genotipos enterobacterianos con deficiencia de o-antígeno; a saber, galE-mutant S. Typhimurium y una cepa de laboratorio, E. coli DH5 (Figura 3 y Figura 4).

La intención de este trabajo es proporcionar un enfoque simplificado para aislar reproduciblemente las membranas de las bacterias Gram-negativas. El protocolo se puede utilizar para estudiar muchos tipos de moléculas asociadas a la membrana para estos microbios.

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Protocolo

1. Reactivos generales y preparación de medios para la extracción de membranas

1. Medios de crecimiento bacteriano: Preparar y esterilizar 1 L de medios de caldo en un matraz de 2 L completamente limpiado y autoclave.
2. Tampón de resuspensión general (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): Disolver 6,05 g de base Tris en 30 ml de H₂O. Ajuste el pH a 7,5 con 5 M HCl. Ajuste el volumen final a 50 mL con Ultrapure H₂O.
3. Stock maestro de solución de quelación de cationes divalentes (0,5 M EDTA pH 8; 100 mL): Añadir 18,6 g de tetraacetato de etileno disódico 2H₂O a 80 ml de H₂O. Agitar vigorosamente y ajustar el pH a 8,0 con NaOH. Ajuste el volumen final a 100 ml con Ultrapure H₂O.
   NOTA: La sal disódica de EDTA no se disolverá hasta que el pH de la solución se ajuste a 8,0 sin embargo mediante la adición de NaOH.
4. Tampón osmótico A (sacarosa de 0,5 M, Tris pH de 10 mM 7,5; 1 L): Pesar 171,15 g de sacarosa y transferirlo a un cilindro de 1 L. Añadir 10 mL de 1 M Tris pH 7.5. Ajustar a un volumen final de 1 L con ultrapuro H₂O. Almacenar a 4 oC.
5. Lysozyme (10 mg/ml; 5 mL): Pesar 50 mg de (huevo de pollo blanco) lisozima y disolver en 5 ml ultrapuro H₂O. Almacenar a 4 oC.
6. Solución de quelación de cationes divalentes diluidas (1,5 mM EDTA; 500 mL): Añadir 1,5 ml de 0,5 M EDTA (paso 1,3) a 497,5 ml ultrapuro H₂O. Almacenar a 4 oC.
7. Tampón osmótico B (sacarosa de 0,2 M, Tris pH de 10 mM 7,5; 2 L): Pesar 136,8 g de sacarosa y transferirlo a un cilindro de 2 L. Añadir 20 mL de 1 M Tris pH 7.5. Ajuste el volumen final a 2 L con Ultrapure H₂O. Almacenar a 4 oC.
8. Cofactor de nucleasa (1 M MgCl₂; 10 mL): Disolver 2,03 g de MgCl₂x 6H₂O en 8 ml de ultrapuro H₂O. Ajuste el volumen a 10 ml. Conservar a temperatura ambiente.
9. Cóctel de solución de nucleasa, incluidas las enzimas RNase y DNase: Ver Tabla de Materiales. Conservar a -20oC.
10. Cóctel inhibidor de la proteasa: Ver Tabla de Materiales. Conservar a 4oC.
11. Solución de gradiente de sacarosa isopycnic de baja densidad (20% p/v sacarosa, EDTA de 1 mM, Solución Tris pH 7,5 de mM; 100 ml): Pesar 20 g de sacarosa y transferirlo a un cilindro de 200 ml. Añadir 100 l de 1 M Tris Buffer pH 7.5 y 200 éL de 0,5 M EDTA pH 8. Ajuste el volumen final a 100 ml con Ultrapure H₂O. Almacenar a temperatura ambiente.
12. Solución de gradiente de sacarosa isopycnic de densidad media (53% p/v sacarosa, 1 mM EDTA, 1mM Tris pH 7.5 Solución; 100 mL): Pesar 53 g de sacarosa y transferira a un cilindro graduado de 200 ml. Añadir 100 l de 1 M Tris Buffer pH 7.5 y 200 éL de 0,5 M EDTA pH 8. Ajuste el volumen final a 100 ml con Ultrapure H₂O. Almacenar a temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare esta solución en un cilindro graduado para garantizar la precisión debido al alto porcentaje de sacarosa. Agregue una barra de agitación magnética y revuelva hasta que la sacarosa se disuelva completamente en solución. Este proceso puede tardar varias horas.
13. Solución de gradiente de sacarosa isopycnic de alta densidad (73% w/v sacarosa, EDTA de 1 mM, Solución tris pH 7,5 de mM; 100 ml): Pesar 73 g de sacarosa y transferirlo a un cilindro graduado de 200 ml. Añadir 100 l de 1 M Tris Buffer pH 7.5 y 200 éL de 0,5 M EDTA pH 8. Ajuste el volumen final a 100 ml con Ultrapure H₂O. Almacenar a temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare esta solución en un cilindro graduado para garantizar la precisión debido al alto porcentaje de sacarosa. Agregue una barra de agitación magnética y revuelva hasta que la sacarosa se disuelva por completo. Este proceso puede tardar varias horas.
14. Búfer de almacenamiento de membrana aislada (10 mM Tris Buffer pH 7.5; 1 L): Añadir 1 mL de 1 M Tris Buffer pH 7.5 a un matraz de 1 L y ajustar el volumen final a 1 L con Ultrapure H₂O.
15. -Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) (10 mg/ml solución): Resuspend 10 mg de NADH en Ultrapure H₂O. Preparar existencias frescas, semanalmente. Conservar a -20oC.
16. Solución fenol equilibrada con 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA: Ver Tabla de Materiales. Conservar la solución a 4oC.
17. Kit de manchas de gel de lipopolisacáridos: Ver Tabla de Materiales.
18. Reactivo Bradford: Véase Tabla de materiales.
    NOTA: Todas las soluciones y medios deben prepararse dentro de la semana de realizar el ensayo para garantizar resultados consistentes.

2. Preparación de bacterias para la extracción de membranas

1. Raya las bacterias de las existencias de glicerol congelado en placas de agar frescas. Conservar las placas a 4oC una vez que se desarrollen las colonias. Inocular una sola colonia en un tubo de 5 ml lleno de medios de caldo y cultivar las bacterias como se desea durante la noche.
2. Diluir de nuevo el cultivo bacteriano durante la noche en 1 L de medios de caldo preferidos y cultivar las bacterias hasta que se logre la densidad óptica deseada.
   NOTA: Inocular una sola colonia bacteriana en 1 L de medios de caldo se recomienda para los genotipos mutantes que son propensos a suprimir los fenotipos de crecimiento, pero algunas bacterias Gram-negativas simplemente crecen más lentamente que otras. Si no es posible lograr una densidad de cultivo suficiente por inoculación de una sola colonia, diluir de nuevo un cultivo nocturno en 1 L de medios es una estrategia para sincronizar el crecimiento. La composición bacteriana-membrana varía dependiendo de la fase de crecimiento del cultivo (fase logarítmica vs estacionaria)¹³. Las curvas de crecimiento que miden el cambio en la densidad óptica para los cultivos bacterianos en función del tiempo deben realizarse con todas las cepas para correlacionar la densidad de cultivo con la fase de crecimiento.
3. Ponga los frascos que contienen los cultivos de caldo sobre hielo. Lea la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) y calcule el volumen de cultivo que es equivalente a entre 6,0 y 8,0 x 10¹¹ unidades formadoras de colonias bacterianas (cfu). Para S. Typhimurium, esto corresponde a 1 L de cultivo en una OD₆₀₀ de entre 0.6-0.8, ya que una OD₆₀₀ de 1.0 es igual a aproximadamente 1.0x10⁹ cfu/mL. Agregue este volumen a un tubo de centrífuga y asegúrese de que los cultivos restantes permanezcan en hielo hasta que se utilicen.
4. Peletizar las bacterias por centrifugación a 4 oC a 7.000-10.000 x g en una centrífuga de alta velocidad de ángulo fijo durante 10 min.
   NOTA: Preenfriar y mantener las centrífugas a baja temperatura. Mantenga las muestras sobre hielo durante todo el procedimiento.
5. Decantar y desechar el sobrenadante cuidadosamente.
   NOTA: El pellet puede ser congelado y/o almacenado a -80 oC si las fracciones de membrana no se van a extraer inmediatamente. Sin embargo, se recomienda proceder directamente con la plasmolisis el mismo día en que se cosechan las células, y se recomienda especialmente para especies no enterobacterianas.

3. Disociación de la Membrana Externa y Plasmolisis

1. Descongelar los gránulos celulares en hielo si se almacenan previamente a -80 oC y conservar las muestras en hielo durante el resto del procedimiento. Resuspenda cada pellet celular dentro del tubo de centrífuga en 12,5 ml del tampón A. Agregue una barra de agitación magnética a la suspensión de las células.
2. Añadir 180 sl de lisozima de 10 mg/ml (concentración final de 144 g/ml) a cada resuspensión celular. Mantenga las muestras sobre hielo mientras revuelve durante 2 min.
3. Añadir 12,5 ml de solución EDTA de 1,5 mM a cada resuspensión celular y continuar revolviendo sobre hielo durante 7 min adicionales.
4. Decantar la suspensión en un tubo cónico de 50 ml y centrífuga a 9.000-11.000 x g durante 10 min a 4 oC.
5. Deseche los sobrenatolentes en un contenedor de residuos de riesgo biológico y conserve los pellets en hielo.
6. Agregue 25 ml de tampón B al pellet de célula.
7. Añadir 55 ml de 1 M MgCl₂, 1 l de reactivo de nucleasa RNase/DNase (para evitar problemas de viscosidad asociados con bacterias sometidas a plasmolisis antes de la homogeneización), y 1 l de cóctel inhibidor de proteasa al volumen de tampón B que se encuentra encima del pellet celular
8. Vuelva a suspender el pellet en la mezcla tampón B. Pipeta y vórtice vigorosamente hasta observar una solución homogénea.
   NOTA: Es muy importante tener una solución homogénea antes de proceder al paso 4 de este protocolo. Las células resuspendidas deben tener una masa de pastel viscosa como la apariencia y la consistencia.
9. Vortex cada muestra durante 15 s. Conservar las suspensiones sobre hielo y proceder al paso 4.

4. Homogeneización presurizada y lisis

NOTA: Se pueden utilizar varios métodos para la lisis. La sonicación no es ideal debido a la generación de calor. La lisis osmótica se puede lograr, pero a menudo es ineficiente. Por lo tanto, recomendamos lisis de alta presión. La lisis de alta presión se puede lograr utilizando una variedad de instrumentos. Sugerimos máquinas de homogeneización, como la Prensa Francesa o la Emusliflex. Trabajamos con muchos tipos de bacterias Gram-negativas cuya respuesta a soluciones de sacarosa alta osmolar varía. El paso de homogeneización de alta presión mejora la eficiencia, la reproducibilidad y el rendimiento.

1. Preenfriar la celda de prensa francesa a 4 oC o insertar la bobina metálica de la máquina homogeneizadora sobre hielo.
2. Vierta la muestra en la celda de presión francesa o en el cilindro homogeneizador-muestra y lleve la célula bajo la presión de homogeneización deseada (10.000 psi deben ser adecuadas cuando se utiliza una prensa francesa o 20.000 psi cuando se utiliza un homogeneizador).
3. Ajuste el caudal de salida a aproximadamente una caída por segundo mientras mantiene la presión si utiliza una prensa francesa.
4. Recoger el lisado celular en tubos cónicos de 50 ml mientras mantiene las muestras en hielo.
5. Repita los pasos 4.2-4.4 de tres a cinco veces para lograr una lisis completa, normalmente indicada por un aumento gradual de la transparencia de la muestra.
   NOTA: La cámara de muestra debe lavarse y equilibrarse con el tampón B entre muestras.
6. Mantenga las células lysed en hielo.

5. Fraccionamiento total de membrana

1. Centrifugar las muestras bacterianas lysed a 6.169 x g durante 10 min a 4 oC a pellet sin material celular intacto. (por ejemplo, células bacterianas no lilizadas).
2. Distribuir la parte restante del sobrenadante, que ahora contiene las membranas homogeneizadas en una botella de policarbonato para la ultracentrifugación.
   PRECAUCION: Si es necesario, las muestras de células se pueden equilibrar diluyendo con tampón B.
3. Ultracentrifure los lysates celulares a 184.500 x g durante al menos 1 h, a 4 oC. Este paso se puede realizar durante la noche sin afectar la calidad de las membranas.
4. Deseche el sobrenadante restante presente en el tubo de ultracentrífuga y retenga los gránulos de membrana en hielo(Figura 1).
5. Resuspenda los pellets de membrana en 1 ml de la solución degradada isopycnic-sucrose de baja densidad utilizando un homogeneizador de dounce de vidrio. Utilice una pipeta Pasteur de vidrio para transferir el homogeneato de muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y retenersobre sobre hielo.
   NOTA: Si sólo se desea un análisis de la composición total de la membrana, sustituya 1 ml de solución de gradiente isopycnic-sucrose de baja densidad por 1 ml de tampón de almacenamiento de membrana aislada. El paso 5.5 es el punto final del aislamiento si sólo se desean muestras de membrana totalmente bacteriana. Almacene las muestras a -20 oC hasta que se requiera un análisis posterior.

6. Ultracentrifugación de gradiente de densidad para separar las membranas dobles

1. Reúna el número adecuado de tubos de polipropileno de 13 ml o ultra-claro sin gas especificados para un rotor de cucharón oscilante y ultracentrífuga.
2. Sostenga el tubo en una posición ligeramente inclinada y prepare el gradiente de sacarosa añadiendo lentamente soluciones de sacarosa de mayor densidad a menor densidad en el siguiente orden:
   2 mL de 73% p/v sacarosa, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
   4 mL de 53% p/v sacarosa, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
   1. A continuación, añadir la fracción de membrana total (1 ml), que ha sido resuspendida en la solución de sacarosa del 20% p/v (paso 5.5). Evite mezclar la fracción de membrana con la solución de sacarosa que se encuentra debajo de ella. Las divisiones deben ser visibles entre cada una de estas capas.
   2. Por último, llene el tubo con la solución de gradiente isopycnic-sucrose de baja densidad (aprox. 6 ml). Los tubos de polipropileno y ultra-claro abierto deben llenarse lo más lleno posible (2 o 3 mm de la parte superior del tubo) para el soporte del tubo.
3. Ajuste para Acinetobacter baumannii 17978
   1. Adaptar un gradiente de sacarosa ajustado para su uso con diferentes muestras bacterianas. Para A. baumannii, el siguiente gradiente de sacarosa ofrece una separación más completa de las membranas(Figura 2).
      2 mL de 73% p/v sacarosa, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7,5
      4 mL de 45% p/v sacarosa, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5
   2. A continuación, añadir la fracción de membrana total (1 ml), que ha sido resuspendida en la solución de sacarosa del 20% p/v (paso 5.5). Evite mezclar la fracción de membrana con la solución de sacarosa que se encuentra debajo de ella. Las divisiones deben ser visibles entre cada una de estas capas.
   3. Por último, llene el tubo con una solución de gradiente isopycnic-sucrose de baja densidad (aprox. 6 ml). Los tubos de polipropileno y ultra-claro abierto deben llenarse lo más lleno posible (2 o 3 mm de la parte superior del tubo) para el soporte del tubo.
4. Ultracentrifure las muestras utilizando un rotor de cucharón oscilante a 288.000 x g y 4 oC durante la noche.
   NOTA: Para los volúmenes utilizados en los pasos anteriores, recomendamos tiempos de centrifugación entre 16 h y 23 h.
5. Corte el extremo de una punta de pipeta P1000 a unos 5 mm del punto. Retire la capa de mensajería instantánea de color marrón superior con la pipeta. Transfiera la fracción IM en una botella de policarbonato para ultracentrifugación.
6. Deje aproximadamente 2 ml de la solución de sacarosa por encima de la interfaz del 53-73% para asegurarse de que el OM blanco inferior no esté contaminado con la fracción IM. Repita el procedimiento de pipeteo del paso 6.4 para la fracción OM(Figura 1).
   NOTA: Las membranas también se pueden recoger pinchando los tubos de centrífuga en la parte inferior usando una aguja y recogiendo las membranas como fracciones en forma de gota.
7. Llene el vacío restante del tubo de ultracentrífuga con tampón de almacenamiento de membrana aislada y mezcle por inversión o pipeteo. Conserve las muestras en hielo.
8. Recoger las membranas ahora lavadas y aisladas por ultracentrifugación a 184.500 x g durante 1 h y 4 oC.
9. Deseche el sobrenadante y resuspenda las membranas por onza-homogeneización. Agregue 500-1000 l de búfer de almacenamiento. Recoger muestras en tubos de microcentrífuga de 2 ml.
10. Almacene las muestras de membrana bacteriana a -20 oC.

7. Confirmación de la separación de las bicapas

NOTA: La separación incompleta de las bicapas puede ocurrir debido a un error técnico o la composición única de la envolvente celular de algunas especies. Para confirmar la separación, aconsejamos utilizar dos ensayos independientes para cuantificar el grado de contaminación cruzada entre las bicapas. El primer ensayo detecta la actividad enzimática de NADH deshidrogenasa, que existe exclusivamente en el IM. El segundo ensayo detecta la presencia de LOS o LPS, que existe predominantemente en el OM.

1. Confirmando que los OM están aislados de los MN
   1. Mida la concentración de proteínas en cada fracción de membrana aislada utilizando un ensayo de proteína Bradford.
   2. Añadir el volumen de la muestra correspondiente a entre 50 y 500 g de proteína a un tubo de microcentrífuga vacío de 2 ml. La concentración variará dependiendo de la especie, pero 50 g es típicamente suficiente para Enterobacteriaceae. Añadir el volumen adecuado de 10 mM Tris-buffer para lograr un volumen total de 990 l. Transfiera el contenido a una cubeta para espectrofotometría.
   3. Añadir 10 l de una solución de 10 mg/ml de NADH a la muestra y medir la absorbancia inicial a 340 nm.
   4. Continúe midiendo la absorbancia cada 30 s durante 5 min.
   5. Compile los datos y grafique el cambio en la absorbancia (eje y) frente al cambio de tiempo (eje x) para cada fracción de membrana(Figura 3).
2. Confirmando que los mandis están aislados de los om
   1. Añadir el volumen de la muestra correspondiente a entre 50 y 500 g de proteína a un tubo de microcentrífuga vacío de 2 ml. La concentración variará dependiendo de la especie bacteriana, pero 50 g es típicamente suficiente para Enterobacteriaceae. Llene a un volumen final de 100 l con solución salina tamponada de fosfato, que en adelante se conoce como la fase acuosa.
   2. Añadir 5 l de Proteinase K (stock 800 U/ml) a la fase acuosa e incubar durante la noche a 59oC.
   3. Calienta una alícuota de 10 ml de Fenol saturado de Tris durante 10 min a 68oC.
   4. Espíe las muestras de fase acuosa que fueron tratadas con la Proteinase K y agregue el Fenol "caliente" Tris-saturado en una proporción de 1:1 con la fase acuosa, vórtice vigorosamente e incubar a 68 oC durante 10 minutos.
   5. Transfiera las muestras ahora de color blanco lechoso de 68 oC a un baño de agua helada e incubar durante 10 minutos.
   6. Centrifugar las muestras a 2.100 x g durante 10 min a 4oC.
   7. Transfiera la fase acuosa superior a un tubo nuevo y almacene el tubo a -20 oC si la muestra no debe utilizarse inmediatamente.
   8. Diluir las muestras en el búfer de carga SDS y cargar los pozos de un 4-20% Tris-glycine gel degradado.
   9. Electroforresa durante 45 minutos o hasta que el tinte frontal esté en la parte inferior del gel.
   10. Mancha el gel con el kit de tinción LPS siguiendo las instrucciones del fabricante.

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Resultados

Esta técnica proporciona un medio eficaz para aislar los HIM y OMs para bacterias Gram-negativas. Se ilustra un esquema de todo el procedimiento (Figura 1). En general, la normalización de cultivos a una DO₆₀₀ de 0,6-0,8 en 1 L de medios, o la cosecha entre 6,0 y 8,0 x 10¹¹ células bacterianas garantizará que se recoja la cantidad adecuada de material de membrana para su posterior separación.

Al lijar las bacterias y ultracentricar el li...

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Discusión

Este método continuará ayudando a los investigadores en la comprensión del papel de la envolvente celular en la fisiología bacteriana y la patogénesis. Siguiendo los pasos secuenciales de ultracentrifugación se puede obtener una fracción total, interna y OM purificada. Estas membranas se pueden analizar de forma aislada para probar hipótesis relacionadas con la localización y función de las proteínas de membrana, el transporte y el tráfico a través de la periferia, y la composición de las bicapas individual...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene	VWR	525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap	VWR	10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth	VWR	10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well	BIORAD	4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mL	BIORAD	1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes	VWR	89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles	VWR	71000-518
70 mL polycarbonate bottle assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355622
Agar Powder	VWR	A10752
B10P Benchtop pH Meter with pH Probe	VWR	89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)	ThermoFisher Scientific	50136146
Benzonase Nuclease	MilliporeSigma	70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker	VWR	4040-01
EmulsiFlex-C3	Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor	ThermoFisher Scientific	75006526
Hydrochloric acid 6.0 N	VWR	BDH7204
IBI Scientific Orbital Platform Shaker	Fischer Scientific	15-453-211
LB Broth Miller	VWR	214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade	VWR	VWRV0063
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
NADH	Sigma Aldrich	10107735001
Optima XPN-80 - IVD	Beckman Coulter Life Sciences	A99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS	Fischer Scientific	NC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology	Sigma - Millipore	P4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit	Thermofisher	23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit	Thermofisher	P20495
Proteacease -50, EDTA free	G Biosciences	786-334
Proteinase K, Molecular Biology Grade	New England Biolabs	P8107S
Sodium hydroxide ≥99.99%	VWR	AA45780-22
Sorval RC 6 Plus Centrifuge	ThermoFisher Scientific	36-101-0816
Sucrose	MilliporeSigma	SX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter Life Sciences	331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker	VWR	JT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	Beckman Coulter Life Sciences	339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm	Beckman Coulter Life Sciences	344059
Vortex-Genie 2	VWR	102091-234