JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Грамотрицательные бактерии производят две пространственно сегрегированные мембраны. Внешняя мембрана разделена из внутренней мембраны периплазмой и пептидогликанским слоем. Способность изолировать двойные двуслойные эти микробы имеет решающее значение для понимания их физиологии и патогенеза.

Аннотация

Этот метод работает путем раздела оболочки грамотрицательных бактерий на общую, внутреннюю и внешнюю мембрану (ОМ) фракции и завершается анализами для оценки чистоты двуслойных. ОМ имеет повышенную общую плотность по сравнению с внутренней мембраной, в основном из-за присутствия липулигосахаридов (LOS) и липополисахаридов (LPS) в пределах внешней листовки. Молекулы LOS и LPS являются амфипатические гликолипииды, которые имеют аналогичную структуру, которая состоит из липидов-а disaccharolipid и ядра-олигосахарида заменить. Однако, только молекулы LPS украшены третьим субединицей, известной как O-полисахарид, или O-антиген. Тип и количество гликолипидов, присутствующих будет влиять на плотность ОМ организма. Поэтому мы проверили, могут ли мембраны бактерий с разнообразным содержанием гликолипидов быть также изолированы с помощью нашей техники. Для LPS-производящих организмов, Salmonella enterica serovar Typhimurium и Escherichia coli, мембраны были легко изолированы и LPS O-антигена moiety не повлияло на расставание двухслойных. Acinetobacter baumannii производит молекулы LOS, которые имеют аналогичную массу O-антигена, недостаточное молекулы LPS; однако, мембраны этих микробов не могли первоначально быть разделены. Мы рассудили, что ОМ A. baumannii был менее плотным, чем у Enterobacteriaceae, поэтому градиент сахарозы был скорректирован и мембраны были изолированы. Таким образом, метод может быть адаптирован и модифицирован для использования с другими организмами.

Введение

Грамотрицательные бактерии производят две мембраны, которые разделены периплазмическим пространством и пептидогликанской клеточной стенкой1. Внутренняя мембрана (IM) заключает цитозол и является симметричным двухслойным фосфолипидами. Пептидогликан защищает от тургорского давления и обеспечивает бактерию клеточной формой, а также крепится к внешней мембране (ОМ) липопротеинами2,,3. ОМ окружает периплазм и преимущественно асимметрично. Внутренняя листовка состоит из фосфолипидов и внешняя листовка состоит из гликолипидов, известных как липулигосахариды (LOS) или липополисахариды (LPS)4,5. Липидная асимметрия и биохимия молекул LOS/LPS во внешней листовке придают барьерные свойства поверхности клетки, которые защищают бактерию от опасностей в ее окружающей среде6,,7.

Молекулы LPS состоят из трех составляющих: липидный дизакчаролип, ядро олигосахарида и О-полисахарид или O-антиген. Липид А является умножить acylated disaccharolipid. Core-oligosaccharides состоят из 10-15 сахаров, известных как грубые LPS или R-LPS. Ядро подразделяется на внутреннюю область, состоящую из 2-кето-3-дезокси-D-манно-восьмилозоновой кислоты (кдо) и одного или нескольких остатков гептоза, а также внешней области, которая состоит, как правило, из гексосов (глюкоза или галактоза) и гептозов, или ацетамамидо сахара5. Область внешнего ядра более изменчива по своим компонентам и структуре, чем внутреннее ядро. В Salmonella spp., только одна основная структура была описана; однако, в Escherichia coli есть пять различных основных структур (обозначенных K-12, R1, R2, R3 и R4)8. E. coli K-12 DH5, который мы используем в этой процедуре несет мутации, что приводит к производству R-LPS9. Молекулы R-LPS не имеют O-антигена moiety и имеют аналогичный молекулярный вес молекул LOS.

Добавление O-антигена к R-LPS превращает эту молекулу в гладкую LPS, или S-LPS. O-антигены построены из коротких 3-4 углеводных субъединиц и состоят из нескольких методов с различной длиной цепи10. Некоторые LPS-производящих бактерий, как Salmonella enterica серовар Typhimurium (S. Typhimurium), дисплей тримодального распределения молекул LPS на их поверхности10,11. Очень длинная цепь O-антигенов может содержать более ста субъединиц и весить более ста килодальтонов. O-антигены обеспечивают поверхностные свойства бактерии, которые необходимы, чтобы противостоять антибиотикам, уклоняться от хипризавания бактериофагами, и вызывать болезни.

Виды Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria и другие генерируют молекулы ЛОС вместо молекул LPS на их поверхности12. Молекулы LOS состоят из липидов А и ядра олигосахаридов, но не хватает O-антигена. Эти типы грамотрицательных бактерий модифицировать их основные олигосахариды с дополнительными сахарами и комбинациями сахаров, чтобы изменить свойства поверхности12. Как LOS, так и LPS-производящие микробы произвностируют фосфаты на липидных и основных молекулах с катионными муатиами7. Эти дополнения включают фосфоэтаноламин, галактозамин и аминоарабиноззамены, которые функционируют путем нейтрализации анионического поверхностного заряда и тем самым защиты от катионных антимикробных пептидов. Грамотрицательные бактерии также изменить структуру ядра олигосахарида с переменной не-stoichiometric замены сахара, или дополнительные молекулы кдо, и изменить количество ацил цепи на липид-A disaccharolipids7.

Способность изолировать чат от ОМ Грам-отрицательных бактерий сыграла важную роль для понимания роли клеточной оболочки в устойчивости к противомикробным препаратам и патогенезаболезни 11,12. Выводы этого подхода были использованы для вывода механизмов сборки, обслуживания и реконструкции белка, фосфолипида и гликолипидов для ОМ.

Наша лаборатория регулярно выполняет бактериальные липидомные анализы для изучения белково-опосредованной липидной регуляции и липидной функции в различных грамотрицательных видов. Объемы, используемые в протоколе, отражают рутинное использование этой процедуры для анализа нерадиомаркированных фосфолипидов тонким слоем хроматографии и жидкой хроматографии тандемной масс-спектрометрии13,14.

Протокол начинается с разоблачения охлажденной подвески грамотрицательных бактерий к высокому осмолялярному раствору сахарозы и добавлению лизозима, чтобы отделить ОМ от основного пептидогликанского слоя (Рисунок 1)12. EDTA затем добавляется для облегчения проникновения лизозима, так как распущенный секвестр катионов нарушает боковое электростатическое взаимодействие между соседними молекулами LOS/LPS15. Первоначальный протокол, из которого был адаптирован наш, требовал образования сферопластов, грамотрицательных бактериальных клеток, которые состоят из плазменной мембраны и цитозола, но не имеют пептидогликанского слоя и ОМ. Не исключено, что сферопласты производятся адаптированным методом; однако, техника не полагается или предназначаю на их образовании для успеха. Вместо этого, лизозим-EDTA обработанные бактерии быстро собирают центрифугирование и повторно подвешены в сахарозный раствор меньшей концентрации перед давлением лизиса. OMs, которые могли бы быть освобождены путем формирования сферопластов, теоретически должны быть собраны из супернатантов обработанных клеток, но этот подход не подробно описан в настоящем. В конечном счете, обработанные клетки подвергаются обычной гомогенизации и лизис, что повышает эффективность и воспроизводимость процедуры разделения мембраны16.

После лизиса, общая мембраны собираются ультрацентрифугации и применяется к прерывистой сахарозы градиент плотности для фракции IM и Омс. Классический подход использует более непрерывный градиент, который состоит по крайней мере из пяти различных решений сахарозы11,12. Прерывистый градиент в нашем протоколе состоит из трех сахарозных растворов и разделов двухслойных на две отдельные фракции17. Молекулы LOS и LPS в пределах OMs Грам-отрицательных бактерий диск конверт для раздела в верхней коричневой низкой плотности IM фракции и нижней белой высокой плотности OM фракции(Рисунок 1 и рисунок 2).

Acinetobacter baumannii являются важными мультирезистентными человеческими патогенами, которые производят молекулы LOS в их ОМ и возводят клеточную оболочку, которую трудно отделить18,,19. Последние работы показывают, что производные протокола мы представляем здесь могут быть использованы для раздела двухслойных этих организмов20. Поэтому мы протестировали наш протокол на A. baumannii 17978. Первоначально эта процедура была неадекватной. Тем не менее, мы изменили концентрацию сахарозы раствора средней плотности и значительно улучшили разделение(рисунок 2). Тест NADH дегидрогеназы и LOS / LPS добычи и обнаружения процедура была использована для подтверждения разделения для A. baumannii, дикий тип S. Тифимурий и два O-антигена дефицитных энтеробактериальных генотипов; а именно, galE-мутант S. Тифимурий и лабораторный штамм, E. coli DH5 "(рисунок 3 и рисунок 4).

Цель этой работы заключается в обеспечении рационализированный подход для воспроизводимой изоляции мембран грамотрицательных бактерий. Протокол может быть использован для изучения многих типов мембранных молекул для этих микробов.

протокол

1. Общие реагенты и медиаподготовка для извлечения мембраны

  1. Бактериальный рост средств массовой информации: Подготовка и стерилизовать 1 л бульона средств массовой информации в тщательно очищены и autoclaved 2 L колбы.
  2. Общий буфер повторной подвески (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 мл): Растворите 6,05 г базы Tris в 30 мл H2O. Отрегулируйте рН до 7,5 с 5 M HCl. Отрегулируйте окончательный объем до 50 мл с ультрачистым H2O.
  3. Мастер ский запас раствора хелации divalent cation (0.5 M EDTA pH 8; 100 мл): Добавьте 18,6 г динатрия этилен тетраацетата 2H2O до 80 мл H2O. Перемешайте и отрегулируйте рН до 8,0 с NaOH. Отрегулируйте окончательный объем до 100 мл с помощью ультрапюры H2O.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соль динатрия ЭДТА не растворится до тех пор, пока рН раствора не будет скорректирован до 8,0 евро за счет добавления NaOH.
  4. Осмотический буфер А (0,5 М сахароза, 10 мм Tris pH 7.5; 1 L): Вес 171,15 г сахарозы и перенос на цилиндр 1 л. Добавьте 10 мл 1 M Tris pH 7.5. Отрегулируйте к окончательному тому 1 L с ультрачистым H2O. Храните на 4 c.
  5. Лисозим (10 мг/мл; 5 мл): Взвесить 50 мг (куриное яйцо-белое) лизозимима и растворить в 5 мл ультрачистый H2O. Хранить при 4 градусах Цельсия.
  6. Разбавленный раствор хелации divalent (1,5 мм EDTA; 500 мл): Добавить 1,5 мл 0,5 М ЭДТА (Шаг 1,3) до 497,5 мл ультрапюры H2O. Хранить при 4 градусах По Цельсию.
  7. Осмотический буфер B (0,2 М сахароза, 10 мм Tris pH 7.5; 2 L): Вес 136,8 г сахарозы и передача на 2 л цилиндра. Добавьте 20 мл 1 М Tris pH 7.5. Отрегулируйте окончательный том до 2 л с ультрачистым H2O. Храните при 4 градусах Цельсия.
  8. Со-фактор Nuclease (1 M MgCl2; 10 мл): Растворите 2,03 г MgCl2No6H2O в 8 мл ультрачистых H2O. Отрегулируйте объем до 10 мл. Хранить при комнатной температуре.
  9. Коктейль Nuclease раствор, включающий ферменты RNase и DNase: Смотрите Таблица материалов. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  10. Коктейль-ингибитор протеазы: Смотрите Таблица Материалов. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
  11. Изопикно-сахарозный градиентный раствор низкой плотности (20% w/v сахарозы, 1 мМ EDTA, 1 мМ Tris pH 7.5 Solution; 100 мл): Взвешивание 20 г сахарозы и передача в цилиндр 200 мл. Добавьте 100 зл и 1 М Tris Buffer pH 7.5 и 200 Л л 0,5 М EDTA pH 8. Отрегулируйте конечный объем до 100 мл с помощью ультрачистых H2O. Store при комнатной температуре.
  12. Изопикно-сахарозный градиентный раствор средней плотности (53% w/v сахарозы, 1 мМ EDTA, 1мМ Tris pH 7.5 Solution; 100 мл): Взвешивание 53 г сахарозы и передача в цилиндр мощностью 200 мл. Добавьте 100 зл и 1 М Tris Buffer pH 7.5 и 200 Л л 0,5 М EDTA pH 8. Отрегулируйте конечный объем до 100 мл с помощью ультрачистых H2O. Store при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте это решение в градуированном цилиндре, чтобы обеспечить точность из-за высокого процента сахарозы. Добавить магнитный перемешать бар и перемешать, пока сахароза полностью растворяется в растворе. Этот процесс может занять несколько часов.
  13. Изопикно-сахарозный градиент ный двигатель (73% w/v сахарозы, 1 мМ EDTA, 1 мМ Tris pH 7.5 Solution; 100 мл): Вес 73 г сахарозы и передача в цилиндр мощностью 200 мл. Добавьте 100 зл и 1 М Tris Buffer pH 7.5 и 200 Л л 0,5 М EDTA pH 8. Отрегулируйте конечный объем до 100 мл с помощью ультрачистых H2O. Store при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте это решение в градуированном цилиндре, чтобы обеспечить точность из-за высокого процента сахарозы. Добавить магнитный перемешать бар и перемешать, пока сахароза полностью растворяется. Этот процесс может занять несколько часов.
  14. Изолированные мембраны хранения буфера (10 мм Tris Buffer рН 7,5; 1 L): Добавить 1 мл 1 M Tris Buffer рН 7,5 на 1 l колбу и настроить окончательный объем до 1 L с ультрачистым H2O.
  15. -Никотинамид аденин динуклеотид (NADH) (10 мг/мл раствор): Отстранить 10 мг NADH в ультрачистых H2O. Подготовка свежих запасов, еженедельно. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  16. Фенол раствор уравновеш— с 10 мм Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA: Смотрите Таблица материалов. Храните раствор при 4 градусах По Цельсию.
  17. Липополисахарид гель пятно комплект: Смотрите Таблица материалов.
  18. Брэдфорд реагент: Смотрите Таблица материалов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все решения и средства массовой информации должны быть подготовлены в течение недели после выполнения асссы для обеспечения последовательных результатов.

2. Подготовка бактерий для извлечения мембраны

  1. Полоса бактерий из замороженных запасов глицерола на свежие пластины агара. Храните пластины при 4 градусах Цельсия, как только колонии развиваются. Прививать одну колонию в трубку 5 мл, наполненную бульонными носителями и культурой бактерий по желанию на ночь.
  2. Обратно разбавлять ночь бактериальной культуры в 1 L предпочтительных бульон амприсии и культуры бактерий до желаемой оптической плотности достигается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прививка одной бактериальной колонии в 1 l бульонных носителей рекомендуется для мутантных генотипов, которые склонны к подавлению фенотипов роста, но некоторые грамотрицательные бактерии просто растут медленнее, чем другие. Если невозможно достичь достаточной плотности культуры путем прививки одной колонии, обратно разбавления ночной культуры в 1 L средств массовой информации является одной стратегией для синхронизации роста. Бактерино-мембрановый состав варьируется в зависимости от фазы роста культуры (логарифмический против стационарной фазы)13. Кривые роста, измеряющие изменение оптической плотности для бактериальных культур в качестве функции времени, должны выполняться со всеми штаммами, чтобы соотнести плотность культуры с фазой роста.
  3. Установите колбы, содержащие культуры бульона на льду. Прочитайте оптическую плотность на уровне 600 нм (OD600)и вычислите объем культуры, эквивалентный между 6,0 и 8,0 х 1011 бактериальных колоний, образующих единицы (cfu). Для С. Typhimurium, это соответствует 1 L культуры на OD600 между 0.6-0.8, в виду того что OD600 из 1.0 равен грубо 1.0x109 cfu/mL. Добавьте этот том в центрифуговую трубку и убедитесь, что остальные культуры остаются на льду до тех пор, пока они не будут использоваться.
  4. Пеллет бактерии центрифугирование при 4 градусах по Цельсию при 7000-10000 х г в фиксированном углу высокоскоростной центрифуги в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно охладить и поддерживать центрифуги при низкой температуре. Поддерживайте пробы на льду в течение всей процедуры.
  5. Декант и отбросить супернатант тщательно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы могут быть флэш-заморожены и/или храниться при -80 градусах По Цельсию, если мембранные фракции не будут извлечены немедленно. Тем не менее, рекомендуется приступить непосредственно с плазмолиза в тот же день клетки собирают, и особенно рекомендуется для не-энтеробактериальных видов.

3. Диссоциация внешней мембраны и плазмолиз

  1. Оттепель клеточных гранул на льду, если ранее хранится при -80 градусов по Цельсию и сохранить образцы на льду на оставшуюся часть процедуры. Приостановите каждую клетку гранулы в центрифуге трубки в 12,5 мл буфера A. Добавить магнитный перемешивание бар сподвеской клеток.
  2. Добавьте 180 л из 10 мг/мл lysozyme (окончательная концентрация 144 мкг/мл) к каждой повторной подвеске клеток. Держите образцы на льду, помешивая в течение 2 мин.
  3. Добавьте 12,5 мл 1,5 мм EDTA раствор для каждой повторной подвески клеток и продолжайте перемешивать на льду еще 7 минут.
  4. Декант подвески в 50 мл конической трубки и центрифуги на 9000-11000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
  5. Отбросьте супернатанты в контейнер для отходов биологической опасности и сохраняйте гранулы на льду.
  6. Добавьте 25 мл буфера B в пеллету ячейки.
  7. Добавьте 55 Зл 1 M MgCl2, 1 Зл RNase/DNase nuclease реагент (чтобы избежать проблем вязкости, связанные с бактериями, проходящими плазмолиз до гомогениза), и 1 Зл ингибитора протеазы коктейль к объему буфера B, который сидит на вершине клетки гранулы
  8. Приостановите действие гранул ы в буферной смеси B. Энергично пипетка и вихрь до наблюдения однородного раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно иметь однородное решение, прежде чем перейти к шагу 4 этого протокола. Переведоки клеток должны иметь вязкий торт-тесто, как внешний вид и консистенция.
  9. Vortex каждый образец для 15 s. Сохранить подвески на льду и перейти к шагу 4.

4. Гмогенизация под давлением и лизис

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько методов могут быть использованы для lysis. Соникация не является идеальным из-за генерации тепла. Осмотический лисис может быть достигнут, но часто неэффективен. Поэтому мы рекомендуем лизас высокого давления. Лиза высокого давления может быть достигнуто с помощью различных инструментов. Мы предлагаем гомогенизации машины, такие как французская пресса или Emusliflex. Мы работаем со многими типами грамотрицательных бактерий, реакция которых на высокоосмолярные растворы сахарозы варьируется. Шаг гомогенизации высокого давления повышает эффективность, воспроизводимость и урожайность.

  1. Прехлл французской пресс-клетки при 4 градусах Цельсия или вставить металлическую катушки из машины гомогенизатора на льду.
  2. Налейте образец во французскую ячейку давления или цилиндр гомогенизатора и довести клетку под желаемым давлением гомогенизации (10000 пси должно быть адекватным при использовании французской прессы или 20000 пси при использовании гомогенизатора).
  3. Отрегулируйте скорость потока розетки примерно до одной капли в секунду, сохраняя при этом давление при использовании французской прессы.
  4. Соберите клеточный лисат в 50 мл конических труб, сохраняя при этом образцы на льду.
  5. Повторите шаги 4.2-4.4 три-пять раз для достижения полного лиза, как правило, указывается постепенным повышением прозрачности выборки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец камеры следует мыть и уравновешивать с буфером B между образцами.
  6. Держите лисицированные клетки на льду.

5. Общая фракция Мембраны

  1. Centrifuge лизоватые бактериальные образцы на 6169 х г в течение 10 мин при 4 кв С, чтобы гранулы оставшиеся нетронутыми клеточного материала. (например, неизлещенные бактериальные клетки).
  2. Распределите оставшуюся часть супернатанта, которая теперь содержит гомогенизированные мембраны в поликарбонатную бутылку для ультрацентрифугации.
    ПРЕДЕКТО: При необходимости образцы клеток можно сбалансировать путем разбавления буфером В.
  3. Ультрацентрифуги клеточной лисаты при 184 500 х г, по крайней мере 1 ч, при 4 градусах По Цельсию. Этот шаг может быть выполнен в одночасье, не влияя на качество мембран.
  4. Откажитесь от оставшихся супернатантов, присутствующих в ультрацентрифуге трубки и сохранить мембранные гранулы на льду(рисунок 1).
  5. Оттачивать мембранные гранулы в 1 мл изопикника-сахарозного градиентного раствора низкой плотности с помощью гомогенизатора со стеклянным унцией. Используйте стеклянную пипетку Pasteur для переноса образца гомената в микроцентрифугную трубку 1,5 мл и удержания на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется только тотальный анализ состава мембраны, замените 1 мл изопикно-сахарозного градиентного раствора низкой плотности на 1 мл изолированно-мембранного буфера хранения. Шаг 5.5 является конечной точкой изоляции, если только полностью бактериальные образцы мембраны желательно. Храните образцы при -20 градусах По Цельсию до дальнейшего анализа ниже по течению.

6. Плотность градиента Ультрацентрифугация для отделения двойных мембран

  1. Соберите соответствующее количество 13 мл полипропилена или ультра-прозрачных трубок с открытым верхом, указанных для качающегося ротора ведра и ультрацентрифуга.
  2. Держите трубку в слегка наклоненом положении и подготовьте градиент сахарозы, медленно добавляя сахарозные растворы от более высокой плотности до более низкой плотности в следующем порядке:
    2 мл 73% ж/v сахароза,1 мМ EDTA, 1 мМ Трис рН 7,5
    4 мл 53% ж/в сахарозе, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ Трис рН 7,5
    1. Затем добавьте общую мембранную фракцию (1 мл), которая была переsuspendedа в 20% раствор е/в сахарозе (шаг 5.5). Избегайте смешивания фракции мембраны с сахарозным раствором, который лежит под ним. Между каждым из этих слоев должны быть видны разделения.
    2. Наконец, заполните трубку раствором градиента изопикника-сахарозы низкой плотности (около 6 мл). Полипропилен и ультра-прозрачные трубки с открытым верхом должны быть заполнены как можно более полными (2 или 3 мм от верхней трубки) для поддержки трубки.
  3. Корректировка для Acinetobacter baumannii 17978
    1. Адаптируйте скорректированный градиент сахарозы для использования с различными бактериальными образцами. Для A. baumannii, следующий градиент сахарозы позволил более полное разделение мембран(Рисунок 2).
      2 мл 73% w/v сахароза, 1 мМ EDTA, 1 мМ Трис рН 7.5
      4 мл 45% w/v сахароза, 1 мМ EDTA, 1 мМ Трис рН 7.5
    2. Затем добавьте общую мембранную фракцию (1 мл), которая была переsuspendedа в 20% раствор е/в сахарозе (шаг 5.5). Избегайте смешивания фракции мембраны с сахарозным раствором, который лежит под ним. Между каждым из этих слоев должны быть видны разделения.
    3. Наконец, заполните трубку раствором градиента изопикника-сахарозы (около 6 мл). Полипропилен и ультра-прозрачные трубки с открытым верхом должны быть заполнены как можно более полными (2 или 3 мм от верхней трубки) для поддержки трубки.
  4. Ultracentrifuge образцы с помощью размахивая ведро ротора на 288000 х г и 4 кв- с ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для объемов, используемых в предыдущих шагах, мы рекомендуем время центрифугирования между 16 ч и 23 ч.
  5. Вырезать конец P1000 пипетка отзыв около 5 мм от точки. Удалите верхний коричневый слой IM с помощью пипетки. Перенесите фракцию в поликарбонатную бутылку для ультрацентрифугации.
  6. Оставьте около 2 мл сахарозы раствора выше 53-73% интерфейса, чтобы гарантировать, что нижняя белая OM не пересекает загрязненных с IM фракции. Повторите процедуру трубачирования с шага 6.4 для фракции OM(рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мембраны также могут быть собраны путем проколов центрифуговых труб на дне с помощью иглы и сбора мембран в виде фракций.
  7. Заполните оставшуюся пустоту ультрацентрифуге трубки изолированным мембрановым буфером хранения и смешайте путем инверсии или пипетки. Сохранить образцы на льду.
  8. Соберите теперь промываются и изолированные мембраны ультрацентрифугации на 184500 х г для 1 ч и 4 КС.
  9. Откажитесь от супернатанта и отрепримите мембраны путем выбросить гомогенизацию. Добавьте 500-1000 л буфера хранения. Сбор образцов в 2 мл микроцентрифуговых труб.
  10. Храните образцы бактериальной мембраны при -20 градусов по Цельсию.

7. Подтверждение разделения двухслоев

ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное разделение двухслойных может произойти из-за технической ошибки или уникального состава клеточного конверта некоторых видов. Чтобы подтвердить разделение, мы советуем использовать два независимых анализа для количественной оценки степени перекрестного загрязнения между двухслойными. Первый ассай обнаруживает ферментативную активность Дегидрогеназы NADH, которая существует исключительно в IM. Второй асссговорит определяет наличие LOS или LPS, которое преимущественно существует в ОМ.

  1. Подтверждение того, что ОМ изолированы от IMs
    1. Измерьте концентрацию белка в каждой изолированной фракции мембраны с помощью протеина Брэдфорда.
    2. Добавьте объем образца, соответствующий от 50 до 500 мкг белка, в пустую микроцентрифугную трубку 2 мл. Концентрация будет варьироваться в зависимости от вида, но 50 мкг, как правило, достаточно для Enterobacteriaceae. Добавьте соответствующий объем 10 мМ Tris-буфер для достижения общего объема 990 л. Перенесите содержимое в кювет для спектрофотометрии.
    3. Добавьте в образец 10 qL раствора NADH размером 10 мг/мл и измерьте начальную абсорбцию на уровне 340 нм.
    4. Продолжайте измерять абсорбцию каждые 30 с в течение 5 минут.
    5. Составить данные и составить график изменения в абсорбции (y-оси) по сравнению с изменением времени (x-оси) для каждой мембранной фракции(рисунок 3).
  2. Подтверждение того, что ОМ изолированы от ОМ
    1. Добавьте объем образца, соответствующий от 50 до 500 мкг белка, в пустую микроцентрифугную трубку 2 мл. Концентрация будет варьироваться в зависимости от бактериальных видов, но 50 мкг, как правило, достаточно для Enterobacteriaceae. Заполните до окончательного объема 100 л с фосфатами буферного сольения, который в дальнейшем называют вавной фазы.
    2. Добавьте 5 qL Протеиназа K (запас 800 U/mL) к воднуй фазе и инкубировать на ночь при 59 градусах Цельсия.
    3. Разогрейте аликот 10 мл насыщенного Трисом фенола в течение 10 мин при 68 градусах Цельсия.
    4. Спин вниз aqueous фазы образцов, которые были обработаны с Proteinase K и добавить "горячий" Трис насыщенных фенол в соотношении 1:1 с aqueous фазы, вихрь энергично и инкубировать при 68 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
    5. Перенесите теперь молочно-белые образцы от 68 градусов по Цельсию к ледяной водяной бане и инкубировать в течение 10 минут.
    6. Центрифуги образцы на 2100 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
    7. Перенесите верхнюю ваковую фазу в новую трубку и храните трубку при -20 градусов по Цельсию, если образец не будет использоваться немедленно.
    8. Разбавить образцы в SDS-загрузке буфера и загрузить скважины 4-20% Tris-глицин градиент гель.
    9. Электрофорез в течение 45 минут или до тех пор, пока краситель фронт находится в нижней части геля.
    10. Пятно гель с помощью LPS окрашивающий комплект в соответствии с инструкциями производителя.

Результаты

Этот метод обеспечивает эффективное средство для изоляции ИМ и ОМ для грамотрицательных бактерий. Иллюстрирован контур всей процедуры(рисунок 1). В целом, нормализация культур до OD600 0,6-0,8 в 1 l носителей, или уборка между 6,0 и 8,0 х 1011 бактериальных клеток будет г?...

Обсуждение

Этот метод будет продолжать помогать исследователям в понимании роли клеточной оболочки в бактериальной физиологии и патогенеза. После последовательных ультрацентрриффирования шаги очищенной общей, внутренней и ОМ фракции могут быть получены. Эти мембраны могут быть анализированы ?...

Раскрытие информации

Конфликта интересов не было заявлено.

Благодарности

Эта работа была профинансирована P20GM10344 и R01AI139248, присужденными З.Д. Далебру.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, NalgeneVWR525-0466
1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature CapVWR10416-312
2,000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow MouthVWR10545-844
4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 wellBIORAD4561095
4x Laemmli Sample Buffer 10 mLBIORAD1610747
50 mL sterile polypropylene centrifuge tubesVWR89049-174
7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass PestlesVWR71000-518
70 mL polycarbonate bottle assemblyBeckman Coulter Life Sciences355622
Agar PowderVWRA10752
B10P Benchtop pH Meter with pH ProbeVWR89231-664
Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)ThermoFisher Scientific50136146
Benzonase NucleaseMilliporeSigma70746-3
EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. BakerVWR4040-01
EmulsiFlex-C3Avestin, Inc.
Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle RotorThermoFisher Scientific75006526
Hydrochloric acid 6.0 NVWRBDH7204
IBI Scientific Orbital Platform ShakerFischer Scientific15-453-211
LB Broth MillerVWR214906
Lysozyme, Egg White, Ultra Pure GradeVWRVWRV0063
Magnesium chloride hexahydrateSigma AldrichM2670
NADHSigma Aldrich10107735001
Optima XPN-80 - IVDBeckman Coulter Life SciencesA99839
Pharmco Products PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS Fischer ScientificNC1624582
Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biologySigma - MilliporeP4557
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay KitThermofisher23238
Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain KitThermofisherP20495
Proteacease -50, EDTA freeG Biosciences786-334
Proteinase K, Molecular Biology GradeNew England BiolabsP8107S
Sodium hydroxide ≥99.99%VWRAA45780-22
Sorval RC 6 Plus CentrifugeThermoFisher Scientific36-101-0816
SucroseMilliporeSigmaSX1075-3
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Coulter Life Sciences331362
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) ≥99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. BakerVWRJT4109-6
Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium RotorBeckman Coulter Life Sciences339160
Ultra-Clear Tube ,14 x 89mmBeckman Coulter Life Sciences344059
Vortex-Genie 2VWR102091-234

Ссылки

  1. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).
  2. Egan, A. J., Vollmer, W. The physiology of bacterial cell division. Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).
  3. Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes. Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).
  4. Raetz, C. R. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).
  5. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  6. Needham, B. D., Trent, M. S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).
  7. Simpson, B. W., Trent, M. S. Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences. Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).
  8. Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides. Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).
  9. Liu, D., Reeves, P. R. Escherichia coli K12 regains its O antigen. Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).
  10. Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen. FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).
  11. Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane. Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).
  12. Osborn, M. J., Munson, R. Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria. Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).
  13. Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia. Infection and Immunity. , (2019).
  14. Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia. Infection and Immunity. 86, (2018).
  15. Nikaido, H. Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances. Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).
  16. Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).
  17. Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).
  18. Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).
  19. Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability. Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).
  20. Kamischke, C., et al. The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane. Elife. 8, (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

158Salmonella enterica Escherichia coli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены