KRAS4b recombinante totalmente procesado: Aislamiento y caracterización de la proteína farnesilada y metilada

Resumen

La prenilación es una modificación importante en las proteínas de unión de membrana periférica. Las células de insectos se pueden manipular para producir KRAS4b farnesilado y carboximetilado en cantidades que permiten mediciones biofísicas de interacciones proteína-proteína y proteína-lípidos

Resumen

La prenilación proteica es una modificación clave que es responsable de dirigir las proteínas a las membranas intracelulares. KRAS4b, que está mutado en el 22% de los cánceres humanos, es procesado por farnesylation y carboximetilación debido a la presencia de un motivo de caja 'CAAX' en la terminal C. Se utilizó un sistema de baculovirus diseñado para expresar KRAS4b farnesylated y carboxymethylated en células de insectos y se ha descrito anteriormente. Aquí, describimos la purificación detallada y práctica y la caracterización bioquímica de la proteína. Específicamente, la afinidad y la cromatografía de intercambio iónico se utilizaron para purificar la proteína a la homogeneidad. Se utilizó espectrometría de masas intacta y nativa para validar la correcta modificación de KRAS4b y para verificar la unión de nucleótidos. Finalmente, la asociación de membranas de KRAS4b farnesylated y carboximetilado a liposomas se midió utilizando espectroscopía de resonancia plasmórica superficial.

Introducción

Las modificaciones posttranslacionales desempeñan un papel clave en la definición de la actividad funcional de las proteínas. Modificaciones como la fosforilación y la glicosilación están bien establecidas. Sin embargo, las modificaciones de lípidos están menos bien caracterizadas. Se estima que hasta el 0,5% de todas las proteínas celulares pueden ser preniladas¹. La prenilación es la transferencia de una farnesil de 15 carbonoos o una cadena de lípidos de geranylgeranilo de 20 carbono a una proteína de recepción que contiene el motivo CAAX^2. Las proteínas preniladas se han implicado en la progresión de varias enfermedades humanas incluyendo el envejecimiento prematuro³, Alzheimer⁴, disfunción cardíaca⁵, choroideremia⁶, y cáncer⁷. Las pequeñas GTPases, HRAS, NRAS y KRAS^1,lamininses nucleares y los quinetocoros CENP-E y F son proteínas farnesyladas bajo la condición basal. Otras pequeñas GTPases, a saber, RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, y RRAS son geranylgeranylated⁸, mientras que RhoB puede ser farnesylated o geranylgeranylated⁹.

La pequeña GTPase KRAS4b funciona como un interruptor molecular, esencialmente transmitiendo la señalización del factor de crecimiento extracelular a las vías de transducción de señal intracelular que estimulan el crecimiento celular y la proliferación, a través de múltiples interacciones proteína-proteína. Hay dos aspectos clave de la bioquímica KRAS4b que son esenciales para su actividad. En primer lugar, los ciclos proteicos entre un PIB inactivo y un estado vinculado a GTP activo mediante el cual se involucra activamente con los efectores. En segundo lugar, una región de polilisina C-terminal y una cisteína farnesilada y carboximetilada dirigen la proteína a la membrana plasmática, permitiendo el reclutamiento y activación de efectos aguas abajo. Mutant KRAS4b es un conductor oncogénico en el cáncer de páncreas, colorrectal y pulmón^10,y como tal, la intervención terapéutica tendría un enorme beneficio clínico. La producción de proteína recombinante auténticamente modificada que esté farnesilada y carboximetilada permitiría el cribado bioquímico utilizando KRAS4b en combinación con sustitutos de membrana como liposomas o nanodiscos lipídicos^11,12.

Farnesyl transferase (FNT) cataliza la adición de pirofosfato de farnesil a la cisteína Terminal C en el motivo CAAX en KRAS4b. Después de la prenilación, la proteína se trafica al retículo endoplasmático (ER) donde la enzima conversora Ras (RCE1) corta los tres residuos C-terminal. El último paso en el procesamiento es la metilación del nuevo residuo de farnesilcisteína C-terminal por la proteína de membrana ER, isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase (ICMT). La expresión de KRAS4b recombinante en E. coli da como resultado la producción de una proteína no modificada. Los intentos anteriores de producir KRAS4b procesado han sido limitados debido a rendimientos insuficientes para experimentos estructurales o de detección de drogas o no han podido recapitular la proteína madura nativa de longitud completa^13,14. El protocolo presentado aquí utiliza un sistema de expresión de células de insectos basado en baculovirus de ingeniería y un método de purificación que genera KRAS4b altamente purificado y completamente procesado a rendimientos de 5 mg/L de cultivo celular.

La caracterización cuidadosa de las proteínas es esencial para validar la calidad de las proteínas recombinantes antes de embarcarse en la biología estructural o en estudios de detección de fármacos. Dos parámetros clave de KRAS4b completamente procesado son la validación de la correcta modificación prenilo y la disponibilidad de la termino C farnesylated y carboxymethylated C-terminus (FMe) para la interacción con sustitutos de membrana o lípidos. La espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) del KRAS4b-FMe se utilizó para medir el peso molecular y confirmar la presencia de las modificaciones de farnesilo y carboximetil. La espectrometría de masas nativa, donde las muestras se pulverizan con disolventes no desnaturalizantes, se utilizó para demostrar que KRAS4b-FMe también estaba vinculado a su cofactor del PIB. Finalmente, se utilizó espectroscopia de resonancia de plásmo superficial para medir la unión directa de KRAS4b-FMe con liposomas inmovilizados.

Protocolo

1. Purificación de proteínas

1. Prepare los buffers A–H, como se ve en la Tabla 1.

Solución de búfer	Agente de almacenamiento en búfer (todos 20 mM)	pH	NaCl (mM)	imidazol (mM)	MgCl2	TCEP
Un	HEPES	7.3	300	-	5	1
B	HEPES	7.3	300	35	5	1
C	HEPES	7.3	300	500	5	1
D	MES	6.0	200	-	5	1
E	MES	6.0	-	-	5	1
F	MES	6.0	100	-	5	1
G	MES	6.0	1000	-	5	1
H	HEPES	7.3	300	-	1	1

2. Preparar los materiales de purificación (ver Tabla de Materiales):cóctel inhibidor de la proteasa sin EDTA u otros quelantes; columna de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC); columna de cromatografía de intercambio catiónico (CEX); Filtro de jeringa de 0,45 m; 2 M imidazol (pH a 7,5); ultracentrífuga capaz de 100.000 x g; centrífuga de sobremesa de alta velocidad capaz de 4.000 x g; unidades de filtro centrífugos (10 KDa NMWL); espectrofotómetro capaz de leer a 280 nm; His6-virus de la ecjma del tabaco (TEV) proteasa; e instrumentación cromatografía capaz de mezclar dos soluciones de búfer, aplicar soluciones a columnas, crear eluciones de gradiente a partir de columnas y recopilar fracciones de columnas.
3. Descongelar las células de 2 L de cultivo de células de insectos previamente almacenadas a -80 oC o utilizar células recién cosechadas. Para obtener más información sobre la línea de células de insectos Tni.FNL y los protocolos de expresión. Resuspenda cuidadosamente las células con 200 ml de Tampón A con el inhibidor de la proteasa de 1:200 v/v añadido sin introducir aire ni crear espuma.
   NOTA: El paso 1.3 y los pasos subsiguientes (excepto como se indica) deben realizarse a temperatura ambiente (22 oC). Es importante que la muestra sea homogénea para permitir la lisis completa en el siguiente paso.
4. Pellet de célula silense en un microfluidizador a 7.000 psi para dos pasadas o en un sistema de lisis equivalente. No se han explorado métodos alternativos de lisis.
5. La aclaración de los lysates de células de insectos es problemática debido a la presencia de compuestos que obstruyen los filtros. Por lo tanto, la ultracentrifugación (100.000 x g durante 30 min a 4 oC) es muy importante. Se debe evitar un residuo de lípidos blancos en la superficie del sobrenadante y se puede eliminar o reducir con hisopos de algodón. Filtre el sobrenadante decanado a través de un filtro PES de 0,45 m. Utilice la muestra clarificada inmediatamente o guárdela a -80 oC.
   NOTA: El residuo bloquea los filtros rápidamente y muchos filtros pueden ser necesarios. Si no se reduce la cantidad de este material, se producirá una alta contrapresión de la columna en los pasos posteriores.
6. Determinar el volumen del lisato clarificado y ajustar la muestra a 35 mM de imidazol mediante la adición de 2 M de stock de imidazol. Cargue la muestra a 3 ml/min en una columna IMAC de 20 ml (columna HisPrep FF 16/10) preequilibrada en el búfer B para volúmenes de tres columnas (CSV).
7. Aunque la proteína objetivo normalmente se adsorbe cuantitativamente a la columna, es mejor recopilar el flujo de columna para su posterior análisis. Lave la columna hasta que el Abs₂₈₀ alcance una línea de base estable (<100 unidades de miliabsorba [mAU]) con Buffer B a 3 ml/min para 20 ml (1 CV) y luego para 3 CV a 4 ml/min para el resto del paso de lavado. Normalmente, se necesitan entre 60 y 80 ml de tampón B para lograr la absorbancia de línea de base.
8. Eluir la proteína con un gradiente de 400 ml (20 CV) del tampón B al tampón C mientras recoge fracciones de 8 ml. Típicamente, la proteína objetivo eluye en la primera mitad del gradiente(Figura 1A; no se muestran todas las fracciones posteriores).
9. Analice las fracciones proteicas utilizando la tinción SDS-PAGE/Coomassie. Fracciones de pico de piscina y dializar la piscina durante la noche contra 2 L de Buffer D a 4 oC.
   NOTA: El pH bajo es fundamental para garantizar la unión a proteínas en el siguiente paso. Sin embargo, el cambio de pH durante esta diálisis ocurre lentamente, y este es un paso conveniente para la incubación durante la noche. No se han investigado estrategias alternativas de intercambio de tampón (por ejemplo, una mayor concentración de tampón para acelerar el cambio de pH). La proteína comenzará a precipitarse lentamente con el tiempo a concentraciones de pH más bajas y sal más bajas y una pequeña cantidad de precipitación es normal durante este paso. Debido a esto, evitamos cambiar el búfer a los 100 mM NaCl necesarios para enlazar a la siguiente columna durante la diálisis. Más bien, se utiliza una concentración de NaCl de 200 mM para diálisis y la proteína se diluye a 100 mM (ver más abajo) inmediatamente antes de la aplicación de la columna. No hemos investigado si esta precipitación es específica de KRAS4b, pero la proteína que se precipita se ha confirmado como KRAS4b-FMe. Por esta razón, sugerimos utilizar la mayor concentración de NaCl en el tampón de diálisis para cualquier proteína de interés como precaución hasta que se pueda determinar la estabilidad de la proteína diana en el tampón de unión.
10. Retire la muestra de diálisis y centrífuga a 4.000 x g durante 10 minutos para eliminar cualquier precipitado. La muestra final dializada y clarificada en este momento es todavía a menudo brumosa, pero se puede aplicar sin más procesamiento en la columna CEX subsiguiente.
11. Prepare una columna de intercambio catiónico de 20 ml (ver Tabla de Materiales)lavándolo con tres CV de Buffer G, luego con tres CV de Buffer F.
    NOTA: Aunque no hemos evaluado meticulosamente otras resinas, varios colegas han encontrado una resolución deficiente con resinas distintas de la resina SP Sepharose High Performance.
12. Diluir 20 ml de la muestra dializada a una concentración final de NaCl de 100 mM añadiendo 20 ml de tampón E y aplicar la muestra diluida a la columna de intercambio catiónico.
13. Continúe cargando la columna añadiendo muestras recién diluidas preparadas como se describió anteriormente al tubo de carga, ya que la dilución anterior se acerca al final de la carga.
    NOTA: La dilución de toda la muestra a la vez a 100 mM NaCl ha dado lugar a una pérdida significativa de proteína diana debido a la precipitación.
14. Lave la columna hasta la línea de base Abs₂₈₀ con Buffer F. Esto normalmente requiere 3 CV. La proteína se eluye de la columna durante un gradiente de 400 ml (20 CV) del búfer F al 65% De búfer G, recogido en fracciones de 6 ml(Figura 1B).
15. Continúe lavando la columna durante 1,5 CV adicionales (65% de tampón G) una vez completado el degradado. Elija fracciones positivas basadas en el análisis de manchas azules SDS-PAGE/Coomassie y la inspección de la traza UV del cromatograma.
    NOTA: El seguimiento UV normalmente contiene cinco picos. Comenzando en concentraciones más bajas de sal, el pico inicial generalmente no se procesa y/o proteólica. Los picos segundo y tercero son una mezcla de dos formas de proteína procesada: el segundo pico es principalmente un intermedio farnesylado (FARN), mientras que el tercero es principalmente la proteína FMe totalmente procesada de interés. Los picos cuatro y cinco representan las proteínas de fusión His6-MBP-KRAS4b (toda la proteína está en este formato en este punto, ya que no se ha producido ninguna digestión TEV). Estos no son N-acetilados en el N-terminus y son farnesylated (pico cuatro) y farnesylated y carboximetilado (pico cinco) en el C-terminus. Como pico dos y pico cuatro produciráproteínas idénticas después de la eliminación de la etiqueta (es decir, KRAS4b-FARN) estas se pueden agrupar en esta etapa si se desea. Del mismo modo, el pico tres y el pico cinco se pueden combinar para producir un solo lote de KRAS4b-FMe(Figura 1B, Figura 2). Sin embargo, se aconseja que esta agrupación sólo se realice cuando se haya confirmado la naturaleza de la proteína en los picos separados.
16. Digerir la proteína agrupada en el paso 1.15 con His6-TEV proteasa (200 g de proteasa/ml de muestra.
    NOTA: Hacemos proteasa His6-TEV usando el plásmido y los protocolos disponibles en Addgene (https://www.addgene.org/92414). Dializar el digerido TEV contra el tampón A (10 kDa MWCO tubos de diálisis con un mínimo de 40 ml de tampón A por ml de muestra) durante 2 h a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4 oC.
17. Después de la digestión y la diálisis, cargue la proteína directamente en una columna IMAC de 20 ml equilibrada con Tampón A a 3 ml/min.
    NOTA: Recoja fracciones de 7 ml durante toda esta cromatografía, ya que la proteína diana tiene una baja afinidad por la columna, pero podría no estar completamente ligada a la resina. Lave la columna a 3 ml/min con el búfer A para un total de 3 CV o hasta que se alcance una absorbancia de línea base.
18. La proteína diana se eluye con un gradiente de 5 CV de Tampón C de 0%-10%, recogiendo fracciones de 7 ml. Como precaución, las proteínas unidas adicionales se pueden eludar con 100% Tampón C. Las fracciones positivas se identifican después del análisis por SDS-PAGE (Figura 1C). Típicamente, la proteína diana eluye a una baja concentración de imidazol (es decir, en el gradiente de Tampón C 0%-10%) pero a veces eluyentes en el lavado de flujo o columna.
19. Dialyze la piscina final contra Buffer H. Determinar la concentración de proteínas por espectrofotometría a 280 nm.
    NOTA: Asegúrese de tener en cuenta la presencia del nucleótido al determinar el coeficiente de extinción que se utilizará para este cálculo.
20. La proteína se puede concentrar a 2-5 mg/ml utilizando una unidad de filtro centrífugo (10 K NMWL) sin pérdida significativa de proteínas. Filtrar con un filtro de jeringa de 0,22 m. Mida la absorbancia de la solución en A₂₈₀ para calcular la concentración final de proteína(Figura 1D). Alícuotas de congelación a presión en nitrógeno líquido y almacenar muestras congeladas a -80 oC.
    NOTA: La proteína purificada está vinculada al PIB. KRAS4b-FMe se puede intercambiar a GppNHp utilizando protocolos publicados previamente¹⁶.

2. Preparación de muestras para análisis de masas intactos y análisis de masas nativas

1. Preparación de muestras para análisis de masa intacto
   1. Descongelar la muestra de proteína en hielo antes del análisis. Para el análisis de masa intacto, diluya la proteína a 0,1 mg/ml en bicarbonato de amonio de 20 mM (pH a 8,4). Para el análisis de masas nativas, diluya la proteína a una concentración de 0,1 mg/ml en acetato de amonio de 50 mM (pH a 7,5). Vortex cada muestra para 5-10 s, luego centrifugar a 12.500 x g durante 1 min para peletizar cualquier material sólido en la solución. Retire de 10 a 20 ml de cada sobrenadante y transfiera a un vial de automuestreador de vidrio. Tapar cada vial firmemente para evitar la contaminación o evaporación.
      NOTA: Para el análisis de masa intacto o el análisis de masa sin nativo, la muestra puede ser desazónada antes del análisis utilizando un filtro de membrana de celulosa MWCO de 10 kDa para el intercambio de tampón en el búfer de dilución final.
2. Preparación de la espectroscopia de masas ampliada (EMR) para el análisis de masas
   NOTA: Antes de ejecutar cualquier análisis sobre el espectrómetro de masas, asegúrese de que se ha calibrado recientemente. Además, use siempre guantes y otros equipos de protección personal según sea necesario para evitar cualquier producto químico nocivo y para evitar contaminar muestras y disolventes. La calibración se realiza utilizando una solución de calibración obtenida comercialmente y una solución de yoduro de cesio de 2 mg/ml preparada internamente.
   1. Abra el software de análisis y cargue el archivo de método de instrumento adecuado. Para el análisis de masa intacto de proteínas KRAS4b, los parámetros de arranque adecuados son los siguientes: modo positivo de detección; tres microescaneos, resolución 70.000; Objetivo del AGC 3e⁶; tiempo máximo de integración a 200 ms; y un rango de escaneo de 70–1.800 de relación masa-carga (m/z). Para el análisis de masas nativas de proteínas KRAS4b, los parámetros de arranque adecuados son los siguientes: modo positivo de detección; 10 microescaneos, resolución 17.500; disociación inducida por colisión en origen (CID) - 20 eV; Objetivo del AGC 3e⁶; energía de colisión (CE) - 20; tiempo máximo de integración a 200 ms; y un rango de escaneo de 500–10.000 m/z.
3. Preparación de disolventes cromatográficos y columna
   1. Preparar los disolventes necesarios para el análisis de masa intacto. El disolvente A es agua con 0,1% de ácido fórmico. El disolvente B es 80% acetonitrilo y 0,1% ácido fórmico en agua.
   2. Preparar los disolventes necesarios para el análisis de masas nativas. El disolvente A es un acetato de amonio de 0,1 M en agua y el disolvente B es agua.
   3. Después de preparar los disolventes adecuados, purgue el sistema para que el tubo se llene con los disolventes apropiados y todas las burbujas de aire se retiren de las líneas.
   4. Instale la columna adecuada (una columna de fase inversa para el análisis en masa intacto y una columna de exclusión de tamaño para el análisis en masa nativo). Para el análisis de masa intacto, el caudal es de 0,5 ml/min y la temperatura de la columna (utilizando un calentador de columna) es de 50 oC. Equilibrar la columna durante 15-20 min. Para el análisis de masas nativo, el caudal es de 0,25 ml/min.
      NOTA: Supervise siempre la contrapresión de la columna para asegurarse de que no se eleva por encima del límite superior, lo que podría indicar una línea obstruida o que la matriz de columnas está comprometida. Reemplace la columna si es necesario.
4. Análisis de muestras
   1. Coloque la muestra de proteína preparada en el vial del automuestreador de vidrio en el estante del vial adecuado en el muestreador automático de sistemas LC. Cree una lista de muestras en el programa de software con el método de instrumento adecuado para el análisis deseado. Una vez completada la lista de muestras, haga clic en el botón Reproducir para iniciar el análisis.
   2. Inyectar de 1 a 2 ml de muestra por análisis, con un agua en blanco antes y después de cada muestra, para asegurarse de que no haya arrastre.
      NOTA: El análisis de masa intacto es muy diferente al análisis de masas nativo y requiere ajustes de método de instrumento muy diferentes. Esto se debe a que con el análisis de masa intacto, la proteína está "relajada" en presencia de un disolvente orgánico, y por lo tanto es capaz de aceptar más cargas. Es más fácil desconvisponer y resolver la distribución isotópica de los estados de carga. El análisis de masa nativo proporciona una distribución de carga estrecha de los iones proteicos, y basado en la proteína, requiere diferentes ajustes de voltaje y energía de colisión.
5. Análisis de datos y desconvolución de proteínas
   1. Exporte el espectro de la muestra al software donde se pueda transformar al espectro desenrevado que mostrará la masa intacta (o masa nativa) de la proteína. La masa intacta tendrá una distribución de pico isotópico debido a la alta abundancia de picos espectrales cargados. La masa nativa típicamente tendrá muy pocos picos debido a la baja abundancia de los picos espectrales cargados(Figura 3D).
   2. Expanda el rango de relación masa-carga (m/z) del pico d para confirmar que la masa medida es coherente con la masa pronosticada. Ocasionalmente, debido a la adición de cargas a la proteína, puede haber una ligera variación entre el peso molecular esperado (MW) y el MW observado. Además, al igual que con muchos análisis de espectrometría de masas, los aductos como el sodio pueden contribuir a la aparición de picos adicionales en los datos, incluso con muestras cuidadosamente desaladas. A veces se observan picos abundantes más bajos con un m/z que es más bajo de lo esperado. Esto es más probable debido a una pérdida neutral, que es la pérdida de un grupo funcional debido al proceso de ionización.
      NOTA: Como era de esperar, habrá diferencias entre la masa intacta y los picos de masa nativos. La pantalla de masa intacta mostrará el MW esperado de la proteína. No tendrá el MW adicional del nucleótido adjunto u otras modificaciones. Sin embargo, el pico de masa nativa mostrará la proteína con cualquier nucleótido añadido.

3. Validación de la unión KRAS4b-FMe a liposomas

1. Preparación de liposomas de membrana
   1. Preparar un tampón que consista en 20 mM HEPES (pH a 7,3), 150 mM de NaCl y 1 mM de TCEP.
   2. Los materiales de preparación de liposomas incluyen 25 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) y 10 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serina (POPS) stocks en cloroformo; un extrusor de lípidos con un soporte y un bloque de calentamiento; gas argón y nitrógeno líquido; un baño ultrasónico; viales de rosca de tornillo de vidrio con revestimientos de espuma de PTFE; y un lector de placas capaz de la detección dinámica de dispersión de luz.
   3. Almacenar lípidos de descongelación en cloroformo a temperatura ambiente durante 30 min. Preparar 1 ml de 5 mM 70:30 POPC: liposomas POPS mediante la alícuota de 106 ml de 25 mM de POPC (stock) y 118 ml de 10 mM POPS (stock) en un vial de vidrio.
      NOTA: No alícuota los lípidos con una punta de plástico, porque el cloroformo podría disolver ciertas puntas de plástico.
   4. Lípidos secos bajo un flujo constante de gas argón. Gire lentamente el vial de vidrio al aplicar el gas de argón para formar una fina capa de película seca.
   5. Ponga las muestras bajo un liofilizador al vacío durante la noche para eliminar el exceso de cloroformo.
   6. Reconstituir los lípidos añadiendo 1 ml de tampón a la película seca y vórtice las mezclas durante 5 min. Hidratar las mezclas de lípidos balanceándose durante 1 h a 25oC.
      NOTA: La muestra será muy turbia al agregar el tampón a la capa de película seca de lípidos.
   7. Realice cinco ciclos de congelación/descongelación alternando la colocación del vial de muestra entre un agua helada (4 oC o inferior) y un baño de agua tibia (25 oC o superior).
   8. Coloque el vial de muestra en el baño ultrasónico y sonice la muestra durante aproximadamente 0,5 h o hasta que la muestra se vuelva semitransparente.
   9. Extruya las muestras utilizando el conjunto de extrusores de lípidos. Monte el kit de extrusión como se muestra en las instrucciones del fabricante. Extruya las muestras con papel de filtro de 0,1 m. Cargue las muestras en una jeringa de vidrio y adjúntelas a un extremo del aparato de extrusión. Agregue una jeringa vacía en el otro extremo del aparato de extrusión. Empuje hacia atrás y adelante de 10 a 20 veces hasta que sus muestras se vuelvan completamente transparentes.
   10. Gire las muestras finales durante 30 min a 20.000 x g para eliminar los agregados grandes.
   11. Utilice la dispersión dinámica de la luz (DLS) para determinar el tamaño y la homogeneidad de los liposomas (opcional). Coloque 30 s de los liposomas en un lector de placas de pozo 384. Gire la placa a 1.000 x g durante 30 minutos.
2. Caracterización de la unión KRAS4b-FMe a liposomas a través de resonancia de plasmón superficial (SPR)
   1. Montar los materiales requeridos: un instrumento SPR; chip de sensor L1; 7 tubos viales de 14 mm; y CHAPS.
   2. Prepare un tampón que contenga 20 mM HEPES (pH a 7,3), 150 mM de NaCl, 1 mM TCEP. Preparar una serie de dilución 2:1 de KRAS4b-FMe de 60 m a 0,06 m en un volumen total de 200 ol (10 valoraciones en total). Transfiera las muestras diluidas finales a los tubos del vial (ver Tabla de materiales), coloque los tubos del vial en un bastidor e inserte las muestras en el instrumento SPR.
   3. Inserte el chip del sensor L1 en el instrumento SPR. Conecte el búfer y prima el sistema con el búfer durante 7 min.
   4. Configure un método automatizado de la siguiente manera:
      1. Ajuste la temperatura del instrumento a 25 oC.
      2. Active el chip del sensor L1 engitándolo con dos inyecciones de 1 min de CHAPS de 20 mM disueltas en agua a un caudal de 30 l/min.
      3. Realice ciclos de puesta en marcha de diez inyecciones de 1 min de tampón de funcionamiento para hidratar la superficie de la viruta.
         1. Deposite los liposomas en el chip del sensor L1 inyectando los liposomas en la célula de flujo (FC)-2 del chip L1 con inyecciones de 2 min a 5 l/min. Apunte a un nivel de captura de al menos 3.000 unidades de respuesta (RUs).
            NOTA: Aumente el tiempo de inyección hasta que alcance el nivel de captura adecuado.
      4. Inyectar tres ciclos de búfer en FC-1 y FC-2 con inyecciones de 1 min a 30 l/min.
         1. Inyectar las diversas valoraciones KRAS4b-FMe de la serie de concentración más baja a la más alta. Inyectar las proteínas utilizando inyecciones de 1 min para la fase de asociación y 2 min de inyecciones para la fase de disociación a un caudal de 30 l/min en ambos FEC.
         2. Regenere el chip del sensor L1 engsuándolo con dos inyecciones de 1 min de CHAPS de 20 mM a 30 l/min.
   5. Ajuste los datos utilizando el software de evaluación SPR utilizando un modelo de enlace de un solo sitio para obtener afinidades de enlace aparentes (consulte la sección Discusión para obtener una explicación de la conexión de datos).

Resultados

Una de las variables más grandes en el protocolo es la cantidad de proteína diana expresada (His6-MBP-tev-KRAS4b). Este protocolo fue desarrollado utilizando un aislado de una línea celular Trichoplusia ni, Tni-FNL^17,adaptada para el crecimiento de la suspensión y destetado del suero. Dada la amplia gama de resultados reportados a través de las diversas líneas celulares de insectos con el sistema de expresión de baculovirus, es aconsejable que Tni-FNL se utilice, al menos inicialme...

Discusión

Como se indica en la sección Resultados representativos, el paso más crítico durante la purificación es el manejo de la muestra durante el tiempo que se encuentra en sal más baja. Limitar el tiempo que la muestra está expuesta a menos de 200 mM NaCl ayudará a reducir la precipitación y aumentar el rendimiento de la muestra. La interpretación de los resultados del CEX puede ser difícil si el perfil no coincide con las expectativas (véase la figura 2). Hasta que el protocolo se haya...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural	Eppendorf	22363204
11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials	Thermo Scientific	30211SS-1232
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	AVANTI POLAR LIPIDS	850457	purchase as liquid stocks in chloroform
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)	AVANTI POLAR LIPIDS	840034	purchase as liquid stocks in chloroform
5427R Centrifuge	Eppendorf
Acetonitrile, HPLC Grade	Fisher Chemical	A998-1 1L
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	09689-250g
Argon gas	Airgas	ARUP
Assay Plate 384	CORNING	3544
Biacore T200 Instrument	GE Healthcare
Blue Snap-It Seals, T/S	Thermo Scientific	C4011-54B
Branson Ultrasonic Bath	Thermo Fisher	15-336-1000
Cation Exchange Chromatography (CEX) column	GE Healthcare Life Sciences	29018183	HiPrep SP Sepharose High Performance
CHAPS	Sigma	C3023
Dyna Pro Plate Reader	Wyatt Technologies
Exactive Plus EMR Mass Spectrometer	Thermo Scientific
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500Ml	Use Reagent Grade or better
Gilson vials 7x14 mm Tubes	GE Healthcare	BR-1002-12
Glass screw thread vials with PTFE foam liners	Scientific Specialities	B69302
High speed/benchtop centrifuge	Thermo Fischer Scientific	05-112-114D	capable of up to 4,000 xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease	Addgene	92414	Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column	GE Healthcare Life Sciences	28-9365-51	HisPrep FF 16/10
In-House Water Supply, Arium Advance	Sartorius Stedim		Resistivity of 18 MΩ0-cm
Lipid extruder set with holder	AVANTI POLAR LIPIDS	610023
Liquid nitrogen	Airgas	NI-DEWAR
M110-EH microfluidizer	Microfluidics
MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm	Thermo Scientific	088645
MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm	Thermo Scientific	088790
MagTran software	Thermo Scientific
Methanol, HPLC Grade	VWR Chemicals	BDH20864.400
NGC Chromatography System	BioRad	78880002	NGC QuestTM 100 Chromatography system
Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators	Millipore Sigma	P8849
Rubber Caps type 3	GE Healthcare	BR-1005-02
Series S Sensor Chip L1	GE Healthcare	29104993
Spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific	13-400-519	Absorbace at 280nm
Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL	Millipore Sigma	UFC901008	PES membrane
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters	Amicon	UFC501024
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima - L80K	capable of 100,000 xg
Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)	Thermo Scientific
Vortex Genie 2	Fisher	12-812
Water, HPLC Grade	Sigma-Aldrich	270733-1L	May use in-house water source (see below)
Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter	GE Healthcare - Whatman	6994-2504
Xcalibur QualBrowser	Thermo Scientific		proteomics software