Vollverarbeitetes rekombinantes KRAS4b: Isoliert und charakterisieren das farnesylierte und methylierte Protein

Zusammenfassung

Prenylierung ist eine wichtige Modifikation an peripheren Membranbindungsproteinen. Insektenzellen können manipuliert werden, um farnesylierte und carboxymethylierte KRAS4b in Mengen zu produzieren, die biophysikalische Messungen von Protein-Protein- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen ermöglichen

Zusammenfassung

Proteinpränylierung ist eine wichtige Modifikation, die für die Ausrichtung von Proteinen auf intrazelluläre Membranen verantwortlich ist. KRAS4b, das bei 22% der menschlichen Krebsarten mutiert ist, wird durch Farnesylierung und Carboxymethylierung durch das Vorhandensein eines CAAX-Boxmotivs am C-Terminus verarbeitet. Ein technisches Baculovirus-System wurde verwendet, um farnesylierte und carboxymethylierte KRAS4b in Insektenzellen auszudrücken und wurde zuvor beschrieben. Hier beschreiben wir die detaillierte, praktische Reinigung und biochemische Charakterisierung des Proteins. Insbesondere wurden Affinität und Ionenaustauschchromatographie verwendet, um das Protein auf Homogenität zu reinigen. Intakte und native Massenspektrometrie wurde verwendet, um die korrekte Modifikation von KRAS4b zu validieren und die Nukleotidbindung zu überprüfen. Schließlich wurde die Membranassoziation von farnesylierter und carboxymethylierter KRAS4b zu Liposomen mittels Oberflächen-Plasmonresonanzspektroskopie gemessen.

Einleitung

Posttranslationale Modifikationen spielen eine Schlüsselrolle bei der Definition der funktionellen Aktivität von Proteinen. Modifikationen wie Phosphorylierung und Glykosylierung sind gut etabliert. Lipidmodifikationen sind jedoch weniger gut charakterisiert. Es wird geschätzt, dass bis zu 0,5% aller zellulären Proteine pränylatiert sein können¹. Pränylierung ist die Übertragung eines 15-Kohlenstoff-Farnesyls oder einer 20-Kohlenstoff-Geranylgeranyl-Lipidkette auf ein Akzeptorprotein, das das CAAX-Motiv²enthält. Pränylate Proteine wurden in das Fortschreiten mehrerer menschlicher Krankheiten verwickelt, einschließlich vorzeitiger Alterung³, Alzheimer⁴, Herzfunktionsstörungen⁵, Choroiderämie⁶und Krebs⁷. Die kleinen GTPases, HRAS, NRAS und KRAS¹, Kernlamine und die Kinetochores CENP-E und F sind farnesylierte Proteine unter dem basalen Zustand. Andere kleine GTPases, nämlich RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42 und RRAS sind geranylgeranylated⁸, während RhoB farnesyliert oder geranylgeranyatd⁹sein kann.

Der kleine GTPase KRAS4b fungiert als molekularer Schalter und überträgt im Wesentlichen extrazelluläre Wachstumsfaktoren signalet an intrazelluläre Signaltransduktionswege, die das Zellwachstum und die Zellproliferation über mehrere Protein-Protein-Wechselwirkungen stimulieren. Es gibt zwei Schlüsselaspekte der KRAS4b Biochemie, die für ihre Aktivität unerlässlich sind. Erstens, die Proteinzyklen zwischen einem inaktiven BIP und einem aktiven GTP gebundenen Zustand, wobei es aktiv mit Effektoren engagiert. Zweitens leiten eine C-terminale Polylysinregion und ein farnesyliertes und carboxymethyliertes Cystein das Protein auf die Plasmamembran, was die Rekrutierung und Aktivierung nachgeschalteter Effektoren ermöglicht. Mutant KRAS4b ist ein onkogener Treiber bei Bauchspeicheldrüsen-, Dickdarm- und Lungenkrebs¹⁰, und als solche, therapeutische Intervention hätte einen großen klinischen Nutzen. Die Herstellung von authentisch modifiziertem rekombinantem Protein, das farnesyliert und carboxymethyliert ist, würde ein biochemisches Screening mit KRAS4b in Kombination mit Membransurrogaten wie Liposomen oder Lipid-Nanoscheiben^{ermöglichen 11,12}.

Farnesyltransferase (FNT) katalysiert die Zugabe von Farnesylpyrophosphat zum C-Terminal Cystein im CAAX-Motiv in KRAS4b. Nach der Pränylierung wird das Protein zum endoplasmatischen Retikulum (ER) geschmuggelt, wo das Ras-Converting-Enzym (RCE1) die drei C-Terminal-Rückstände spaltet. Der letzte Schritt in der Verarbeitung ist die Methylierung des neuen C-Terminal-Farnesylcystein-Rückstandes durch das ER-Membranprotein Isoprenylcystein-Carboxylmethyltransferase (ICMT). Die Expression des rekombinanten KRAS4b in E. coli führt zur Produktion eines unveränderten Proteins. Frühere Versuche, verarbeitetes KRAS4b herzustellen, waren aufgrund unzureichender Erträge für Struktur- oder Arzneimittelscreening-Experimente begrenzt oder konnten das native vollwertige ausgereifte Protein^13,14nicht rekapitulieren. Das hier vorgestellte Protokoll verwendet ein entwickeltes Baculovirus-basiertes Insektenzellexpressionssystem und Reinigungsmethode, das hochgereinigtes, vollständig verarbeitetes KRAS4b bei einer Ausbeute von 5 mg/L Zellkultur erzeugt.

Eine sorgfältige Proteincharakterisierung ist unerlässlich, um die Qualität rekombinanter Proteine zu validieren, bevor sie mit Strukturbiologie- oder Arzneimittelscreeningstudien beginnen. Zwei wichtige Parameter der vollständig verarbeiteten KRAS4b sind die Validierung der korrekten Pränylmodifikation und die Verfügbarkeit des farnesylierten und carboxymethylierten C-Terminus (FMe) für die Interaktion mit Membranersatzstoffen oder Lipiden. Die Elektrospray-Ionisationsmassenspektrometrie (ESI-MS) des KRAS4b-FMe wurde verwendet, um das Molekulargewicht zu messen und das Vorhandensein der Farnesyl- und Carboxymethylmodifikationen zu bestätigen. Die native Massenspektrometrie, bei der Proben mit nicht denatierenden Lösungsmitteln besprüht werden, wurde verwendet, um zu zeigen, dass KRAS4b-FMe auch an seinen BIP-Kofaktor gebunden war. Schließlich wurde die Oberflächen-Plasmonresonanzspektroskopie verwendet, um die direkte Bindung von KRAS4b-FMe mit immobilisierten Liposomen zu messen.

Protokoll

1. Proteinreinigung

1. Vorbereiten der Puffer A–H, wie in Tabelle 1zu sehen ist.

Pufferlösung	Puffer-Agent (alle 20 mM)	pH	NaCl (mM)	Imidazol (mM)	MgCl2	TCEP
Eine	HEPES	7.3	300	-	5	1
B	HEPES	7.3	300	35	5	1
C	HEPES	7.3	300	500	5	1
D	Mes	6.0	200	-	5	1
E	Mes	6.0	-	-	5	1
F	Mes	6.0	100	-	5	1
G	Mes	6.0	1000	-	5	1
H	HEPES	7.3	300	-	1	1

2. Vorbereiten der Reinigungsmaterialien (siehe Materialtabelle):Protease-Inhibitor-Cocktail ohne EDTA oder andere Chelatoren; immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) Säule; Kationenaustauschchromatographie (CEX)-Säule; 0,45 m Spritzenfilter; 2 M Imidazol (pH = 7,5); Ultrazentrifuge in der Lage 100.000 x g; Hochgeschwindigkeits-Tischzentrifuge von 4.000 x g; Zentrifugalfiltereinheiten (10 KDa NMWL); Spektralphotometer, das bei 280 nm ablesen kann; His6-Tabak-Ätzvirus (TEV) Protease; und Chromatographie-Instrumentierung, die in der Lage ist, zwei Pufferlösungen zu mischen, Lösungen auf Spalten anzuwenden, Gradienteneluionen aus Spalten zu erstellen und Brüche aus Spalten zu sammeln.
3. Tauen Sie Zellen aus der Insektenzellkultur von 2 L, die zuvor bei -80 °C gelagert wurden, oder verwenden Sie frisch geerntete Zellen. Siehe Gillette et al. 2019¹⁵ für Details über die Tni.FNL Insektenzelllinie und Expressionsprotokolle. Die Zellen mit 200 ml Puffer A mit einem zusätzlichen Protease-Inhibitor von 1:200 v/v vorsichtig wieder aussetzen, ohne Luft einzuschleusen oder Schaum zu erzeugen.
   HINWEIS: Schritt 1.3 und nachfolgende Schritte (außer wie angegeben) sollten bei Raumtemperatur (ca. 22 °C) durchgeführt werden. Es ist wichtig, dass die Probe homogen ist, um eine vollständige Lyse im nächsten Schritt zu ermöglichen.
4. Lyse-Zellpellet in einem Mikrofluidizer bei 7.000 psi für zwei Durchgänge oder in einem gleichwertigen Lysesystem. Alternative Methoden der Lyse wurden nicht erforscht.
5. Die Klärung von Insektenzelllysaten ist aufgrund des Vorhandenseins von Verbindungen, die Filter verstopfen, problematisch. Daher ist die Ultrazentrifugation (100.000 x g für 30 min bei 4 °C) sehr wichtig. Ein weißer Lipidrückstand auf der Oberfläche des Überstandes sollte vermieden werden und kann mit Wattestäbchen entfernt oder reduziert werden. Filtern Sie den dekantierten Überstand durch einen 0,45-m-PES-Filter. Verwenden Sie die geklärte Probe sofort oder lagern Sie bei -80 °C.
   HINWEIS: Die Rückstände blockieren Filter schnell und viele Filter können notwendig sein. Wenn die Menge dieses Materials nicht reduziert wird, führt dies in den folgenden Schritten zu einem hohen Säulenrückdruck.
6. Bestimmen Sie das Volumen des geklärten Lysats und passen Sie die Probe durch Zugabe von 2 M Imidazolbestand auf 35 mM Imidazol an. Laden Sie die Probe mit 3 ml/min auf eine 20 ml IMAC-Säule (HisPrep FF 16/10-Spalte), die in Puffer B für drei Spaltenvolumes (CVs) ausgeglichen wurde.
7. Obwohl das Zielprotein in der Regel quantitativ an die Spalte adsorbiert wird, ist es am besten, den Spaltenfluss für die nachfolgende Analyse zu sammeln. Waschen Sie die Säule, bis der Abs₂₈₀ eine stabile Ausgangsbasis (<100 Milliabsorbance Units [mAU]) mit Puffer B bei 3 ml/min für 20 ml (1 CV) und dann für 3 CV bei 4 ml/min für den Rest des Waschschritts erreicht. In der Regel werden 60–80 ml Puffer B benötigt, um eine Basisabsorption zu erreichen.
8. Elute das Protein mit einem 400 ml (20 CV) Gradienten von Puffer B zu Puffer C, während 8 ml Brüche sammeln. Typischerweise eluiert das Zielprotein in der ersten Hälfte des Gradienten(Abbildung 1A;nicht alle späteren Fraktionen werden angezeigt).
9. Analysieren Sie Proteinfraktionen mit SDS-PAGE/Coomassie-Färbung. Pool Spitzenfraktionen und dialyze das Becken über Nacht gegen 2 L Puffer D bei 4 °C.
   HINWEIS: Ein niedriger pH-Wert ist entscheidend, um die Proteinbindung im nächsten Schritt sicherzustellen. Allerdings tritt die pH-Änderung während dieser Dialyse langsam auf, und dies ist ein bequemer Schritt für die nächtliche Inkubation. Alternative Pufferaustauschstrategien (z. B. höhere Pufferkonzentration zur Beschleunigung der pH-Änderung) wurden nicht untersucht. Das Protein beginnt im Laufe der Zeit langsam bei niedrigeren pH-Wert und niedrigeren Salzkonzentrationen auszufallen und eine kleine Menge an Niederschlag ist während dieses Schritts normal. Aus diesem Grund vermeiden wir den Austausch des Puffers in die 100 mM NaCl, die für die Bindung an die nächste Spalte während der Dialyse erforderlich ist. Vielmehr wird eine NaCl-Konzentration von 200 mM für die Dialyse verwendet und das Protein wird unmittelbar vor der Anwendung auf die Säule auf 100 mM (siehe unten) verdünnt. Wir haben nicht untersucht, ob dieser Niederschlag spezifisch für KRAS4b ist, aber das Protein, das ausfällt, wurde als KRAS4b-FMe bestätigt. Aus diesem Grund schlagen wir vor, die höhere NaCl-Konzentration im Dialysepuffer vorsorglich für jedes Protein von Interesse zu verwenden, bis die Stabilität des Zielproteins im Bindungspuffer bestimmt werden kann.
10. Entfernen Sie die Probe von Dialyse und Zentrifuge bei 4.000 x g für 10 min, um alle Niederschlagsmittel zu entfernen. Die abschließende dialyzierte, geklärte Probe ist an dieser Stelle noch oft trübe, kann aber ohne weitere Verarbeitung auf die nachfolgende CEX-Säule aufgetragen werden.
11. Bereiten Sie eine 20 ml Kationenaustauschspalte (siehe Materialtabelle) vor, indem Sie mit drei Lebensläufen des Puffers G und dann mit drei Lebensläufen des Puffers F waschen.
    HINWEIS: Obwohl wir andere Harze nicht sorgfältig bewertet haben, haben mehrere Kollegen eine schlechte Auflösung mit anderen Harzen als SP Sepharose High Performance Harz gefunden.
12. 20 ml der dialysierten Probe auf eine endgültige NaCl-Konzentration von 100 mM verdünnen, indem 20 ml Puffer E hinzugefügt werden, und die verdünnte Probe auf die Kationenaustauschsäule auftragen.
13. Laden Sie die Säule weiter, indem Sie dem Lastrohr, wie oben beschrieben, frisch verdünnte Proben hinzufügen, da sich die vorherige Verdünnung dem Ende der Last nähert.
    HINWEIS: Die gleichzeitige Verdünnung der gesamten Probe auf 100 mM NaCl hat zu einem signifikanten Verlust des Zielproteins durch Niederschlag geführt.
14. Waschen Sie die Spalte mit Puffer F auf Basisabs_280. Dies erfordert in der Regel 3 CV. Das Protein wird aus der Säule während eines 400 ml (20 CV) Gradienten von Puffer F auf 65% Puffer G eluiert, gesammelt in 6 ml Fraktionen (Abbildung 1B).
15. Fahren Sie mit dem Waschen der Säule für einen zusätzlichen 1,5 CV (65% Puffer G) fort, sobald der Farbverlauf abgeschlossen ist. Wählen Sie positive Brüche basierend auf sDS-PAGE/Coomassie blau Fleckenanalyse und Inspektion der UV-Spur des Chromatogramms.
    HINWEIS: Die UV-Spur enthält in der Regel fünf Spitzen. Ab niedrigeren Salzkonzentrationen ist der anfangse Höhepunkt in der Regel unverarbeitetes und/oder proteolysiertes Protein. Der zweite und dritte Gipfel sind eine Mischung aus zwei Formen von verarbeitetem Protein: Der zweite Peak ist in erster Linie ein farnesyliertes Zwischenprodukt (FARN), während der dritte in erster Linie das voll verarbeitete FMe-Protein von Interesse ist. Peaks vier und fünf repräsentieren His6-MBP-KRAS4b Fusionsproteine (das gesamte Protein ist zu diesem Zeitpunkt in diesem Format, da keine TEV-Verdauung stattgefunden hat). Diese sind nicht N-acetyliert am N-Terminus und werden farnesyliert (Spitze vier) und farnesyliert und carboxymethyliert (Spitze fünf) am C-Terminus. Als Peak two und Peak Four werden nach der Tagentfernung identische Proteine (d.h. KRAS4b-FARN) produziert, diese können in diesem Stadium auf Wunsch gepoolt werden. In ähnlicher Weise können Peak three und Peak Five kombiniert werden, um eine einzelne Menge KRAS4b-FMe zu erzeugen (Abbildung 1B, Abbildung 2). Es wird jedoch empfohlen, diese Pooling nur zu tun, wenn die Art des Proteins in den einzelnen Spitzen bestätigt wurde.
16. Verdauen Sie das in Schritt 1.15 gepoolte Protein mit His6-TEV-Protease (ca. 200 g Protease/ml Probe.
    HINWEIS: Wir machen His6-TEV Protease mit dem Plasmid und Protokolle verfügbar von Addgene (https://www.addgene.org/92414). Dialysieren Sie den TEV-Digest gegen Puffer A (10 kDa MWCO Dialyseschläuche mit mindestens 40 ml Puffer A pro ml Probe) für 2 h bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4 °C.
17. Nach Verdauung und Dialyse das Protein direkt auf eine 20 ml IMAC-Säule laden, die mit Puffer A bei 3 ml/min ausgeglichen wird.
    HINWEIS: Sammeln Sie während dieser gesamten Chromatographie 7 ml-Fraktionen, da das Zielprotein eine geringe Affinität für die Säule hat, aber möglicherweise nicht vollständig an das Harz gebunden ist. Waschen Sie die Säule bei 3 ml/min mit Puffer A für insgesamt 3 Lebensläufe oder bis eine Basisabsorption erreicht ist.
18. Das Zielprotein wird mit einem 5 CV Gradienten von Puffer C von 0%–10% eluiert und sammelt 7 ml-Fraktionen. Vorsorglich können zusätzliche gebundene Proteine mit 100% Puffer C eluiert werden. Positive Fraktionen werden nach Analyse durch SDS-PAGE identifiziert (Abbildung 1C). Typischerweise elutiert das Zielprotein bei einer niedrigen Imidazolkonzentration (d. h. im Gradienten 0%–10% Puffer C), aber manchmal elutiert es in der Durchfluss- oder Säulenwäsche.
19. Dialyze den letzten Pool gegen Puffer H. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration durch Spektrophotometrie bei 280 nm.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, das Vorhandensein des Nukleotids bei der Bestimmung des Für diese Berechnung zu verwendenden Aussterbekoeffizienten zu berücksichtigen.
20. Das Protein kann mit einer Zentrifugalfiltereinheit (10 K NMWL) ohne signifikanten Proteinverlust auf 2–5 mg/ml konzentriert werden. Filter mit einem Spritzenfilter mit 0,22 m. Messen Sie die Lösungsabsorption bei A_280, um die endgültige Proteinkonzentration zu berechnen (Abbildung 1D). Einfrieren von Aliquoten in flüssigem Stickstoff einfrieren und gefrorene Proben bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Das gereinigte Protein ist an das BIP gebunden. KRAS4b-FMe kann mit den zuvor veröffentlichten Protokollen¹⁶in GppNHp ausgetauscht werden.

2. Probenvorbereitung für intakte Massenanalyse und native Massenanalyse

1. Probenvorbereitung für intakte Massenanalyse
   1. Vor der Analyse auf Eis auftauen. Für eine intakte Massenanalyse das Protein auf 0,1 mg/ml in 20 mM Ammoniumbicarbonat (pH = 8,4) verdünnen. Für die native Massenanalyse verdünnen Sie das Protein auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml in 50 mM Ammoniumacetat (pH = 7,5). Wirbel jede Probe für 5-10 s, dann Zentrifuge bei 12.500 x g für 1 min, um jedes feste Material in der Lösung zu pellet. Entfernen Sie 10–20 l von jedem Überstand und übertragen Sie ihn in eine Glas-Autosampler-Durchstechflasche. Jede Durchstechflasche fest verschließen, um Eine Kontamination oder Verdunstung zu verhindern.
      HINWEIS: Für die intakte Massenanalyse oder die native Massenanalyse kann die Probe vor der Analyse mit einem 10 kDa MWCO Cellulosemembranfilter entsalzt werden, um den Pufferinpol in den endgültigen Verdünnungspuffer zu puffern.
2. Vorbereitung der Massenspektroskopie des erweiterten Massenbereichs (EMR) zur Massenanalyse
   HINWEIS: Stellen Sie vor dem Ausführen einer Analyse des Massenspektrometers sicher, dass es kürzlich kalibriert wurde. Tragen Sie auch immer Handschuhe und andere persönliche Schutzausrüstungen, wenn dies erforderlich ist, um schädliche Chemikalien zu vermeiden und um eine Kontamination von Proben und Lösungsmitteln zu vermeiden. Die Kalibrierung erfolgt mit einer kommerziell erhaltenen Kalibrierlösung und einer 2 mg/ml Cäsiumjodidlösung, die im eigenen Haus hergestellt wird.
   1. Öffnen Sie die Analysesoftware, und laden Sie die entsprechende Instrumentenmethodesdatei. Für die intakte Massenanalyse von KRAS4b-Proteinen sind die geeigneten Ausgangsparameter wie folgt: positive Detektionsmethode; drei Mikroscans, Auflösung = 70.000; AGC-Ziel = 3e⁶; maximale Integrationszeit = 200 ms; und einen Scanbereich = 70–1.800 Massen-Zu-Lade-Verhältnis (m/z). Für die native Massenanalyse von KRAS4b-Proteinen sind die geeigneten Ausgangsparameter wie folgt: positive Detektionsmethode; 10 Mikroscans, Auflösung = 17.500; in-source kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) = 20 eV; AGC-Ziel = 3e⁶; Kollisionsenergie (CE) = 20; maximale Integrationszeit = 200 ms; und einen Scanbereich = 500–10.000 m/z.
3. Herstellung von chromatographischen Lösungsmitteln und Säulen
   1. Bereiten Sie die Lösungsmittel vor, die für eine intakte Massenanalyse erforderlich sind. Lösungsmittel A ist Wasser mit 0,1% Ameisensäure. Lösungsmittel B ist 80% Acetonitril und 0,1% Ameisensäure in Wasser.
   2. Bereiten Sie die Lösungsmittel vor, die für die native Massenanalyse erforderlich sind. Lösungsmittel A ist 0,1 M Ammoniumacetat in Wasser und Lösungsmittel B ist Wasser.
   3. Nachdem die entsprechenden Lösungsmittel vorbereitet sind, spülen Sie das System so, dass der Schlauch mit den entsprechenden Lösungsmitteln gefüllt wird und alle Luftblasen aus den Leitungen entfernt werden.
   4. Installieren Sie die entsprechende Spalte (eine Reverse-Phase-Spalte für intakte Massenanalyse und eine Größenausschlussspalte für die systemeigene Massenanalyse). Für die intakte Massenanalyse beträgt die Durchflussmenge 0,5 ml/min und die Säulentemperatur (mit Einem Säulenheizer) 50 °C. Equilibrate die Säule für 15-20 min. Bei der nativen Massenanalyse beträgt die Durchflussrate 0,25 ml/min.
      HINWEIS: Überwachen Sie immer den Säulen-Gegendruck, um sicherzustellen, dass er nicht über die Obergrenze steigt, was auf eine verstopfte Linie hindeuten könnte oder dass die Spaltenmatrix kompromittiert ist. Ersetzen Sie ggf. die Spalte.
4. Beispielanalyse
   1. Die vorbereitete Proteinprobe in die Glas-Autosampler-Durchstechflasche in das entsprechende Fläschgeregal im Autosampler der LC-Systeme legen. Erstellen Sie eine Musterliste im Softwareprogramm mit der entsprechenden Instrumentenmethode für die gewünschte Analyse. Sobald die Beispielliste abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe, um die Analyse zu starten.
   2. Injektion von 1 bis 2 l Probe pro Analyse, mit einem Wasserrohling vor und nach jeder Probe, um sicherzustellen, dass kein Übertrag vorhanden ist.
      HINWEIS: Die intakte Massenanalyse unterscheidet sich stark von der nativen Massenanalyse und erfordert sehr unterschiedliche Gerätemethodeneinstellungen. Denn mit der intakten Massenanalyse wird das Protein in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels "entspannt" und kann somit mehr Ladungen akzeptieren. Es ist einfacher, die Isotopenverteilung der Ladungszustände zu dekonvoluten und aufzulösen. Die native Massenanalyse bietet eine enge Ladungsverteilung der Proteinionen und erfordert auf Der Grundlage des Proteins unterschiedliche Spannungs- und Kollisionsenergieeinstellungen.
5. Datenanalyse und Proteindekonvolution
   1. Exportieren Sie das Spektrum der Probe in Software, wo sie in das entwirrte Spektrum umgewandelt werden kann, das die intakte Masse (oder native Masse) des Proteins anzeigt. Die intakte Masse wird aufgrund der hohen Fülle geladener Spektralspitzen eine isotopenspitze Verteilung haben. Die native Masse wird in der Regel sehr wenige Spitzen aufgrund der geringen Fülle der geladenen Spektralspitzen haben (Abbildung 3D).
   2. Erweitern Sie den Massen-Zu-Lade-Verhältnis(m/z) Bereich des Peaks d, um zu bestätigen, dass die gemessene Masse mit der vorhergesagten Masse übereinstimmt. Gelegentlich kann es aufgrund der Zugabe von Ladungen zum Protein zu einer leichten Variation zwischen dem erwarteten Molekulargewicht (MW) und dem beobachteten MW kommen. Wie bei vielen Massenspektrometrieanalysen können auch bei sorgfältig entsalzten Proben Addukte wie Natrium zum Auftreten zusätzlicher Spitzen in den Daten beitragen. Manchmal werden niedrigere reichliche Spitzen mit einem m/z beobachtet, der niedriger ist als erwartet. Dies ist höchstwahrscheinlich auf einen neutralen Verlust zurückzuführen, der der Verlust einer funktionellen Gruppe aufgrund des Ionisationsprozesses ist.
      HINWEIS: Wie erwartet, wird es Unterschiede zwischen der intakten Masse und den nativen Massenspitzen geben. Die intakte Massenanzeige zeigt die erwartete MW des Proteins an. Es wird nicht die zusätzliche MW des beigefügten Nukleotids oder andere Modifikationen haben. Der native Massepeak zeigt jedoch das Protein mit einem zugesetzten Nukleotid.

3. Validierung der KRAS4b-FMe-Bindung an Liposomen

1. Membran-Liposomen-Präparat
   1. Bereiten Sie einen Puffer bestehend aus 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl und 1 mM TCEP vor.
   2. Liposomen-Präparationsmaterialien umfassen 25 mM 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-Glycero-3-Phosphocholin (POPC) und 10 mM 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serin (POPS)-Bestände in Chloroform; ein Lipidextruder-Set mit Halter und Heizblock; Argongas und flüssiger Stickstoff; ein Ultraschallbad; Glasschraube Gewindefläschchen mit PTFE-Schaumstofflinern; und ein Plattenleser, der in der Lage ist, dynamische Lichtstreuungzuerkennen.
   3. Lipidvorräte in Chloroform bei Raumtemperatur 30 min auftauen. Bereiten Sie 1 ml 5 mM 70:30 POPC: POPS-Liposomen vor, indem Sie 106 l von 25 mM POPC (Lager) und 118 l von 10 mM POPS (Lager) in eine Glasdurchstechflasche einfließen lassen.
      HINWEIS: Fette nicht mit einer Kunststoffspitze aliquoten, da die Chloroform bestimmte Kunststoffspitzen auflösen könnte.
   4. Trockene Lipide unter einem stetigen Strom von Argongas. Drehen Sie die Glasflasche langsam, wenn Sie das Argongas auftragen, um eine dünne Schicht aus trockener Folie zu bilden.
   5. Legen Sie Proben über Nacht unter einen Vakuumlyophilisator, um überschüssiges Chloroform zu entfernen.
   6. Rekonstituieren Sie die Lipide, indem Sie dem getrockneten Film 1 ml Puffer hinzufügen und die Mischungen für 5 min wirbeln. Hydratieren Sie die Lipidmischungen durch Schaukeln für 1 h bei 25 °C.
      HINWEIS: Die Probe wird sehr trüb sein, wenn der Puffer der getrockneten Folienschicht von Lipiden zuzufüdert wird.
   7. Führen Sie fünf Gefrier-/Tauzyklen durch, indem Sie die Probendurchstechsons abwechselnd zwischen einem Eiswasser (4 °C oder niedriger) und einem Warmwasserbad (25 °C oder höher) platzieren.
   8. Legen Sie die Probendurchstechsin in das Ultraschallbad und beschallen Sie die Probe etwa 0,5 h oder bis die Probe halbtransparent wird.
   9. Extrudieren Sie die Proben mit dem Lipidextrudersatz. Montieren Sie den Extrusionssatz, wie in den Anweisungen des Herstellers gezeigt. Extrudieren Sie die Proben mit 0,1 m Filterpapier. Die Proben in eine Glasspritze geben und an einem Ende des Extrusionsgeräts befestigen. Fügen Sie eine leere Spritze am anderen Ende des Extrusionsgeräts hinzu. Drücken Sie 10–20x hin und her, bis Ihre Proben vollständig transparent werden.
   10. Drehen Sie die letzten Proben für 30 min bei 20.000 x g, um große Aggregate zu entfernen.
   11. Verwenden Sie die dynamische Lichtstreuung (DLS), um die Größe und Homogenität der Liposomen zu bestimmen (optional). Legen Sie 30 l der Liposomen in einen 384 Wellplattenleser. Drehen Sie die Platte bei 1.000 x g für 30 min. Legen Sie die Platte in einen Plattenleser und sammeln Sie 10 Lichtstreumessungen.
2. Charakterisierung der KRAS4b-FMe-Bindung an Liposomen über Oberflächenplasmonresonanz (SPR)
   1. Montieren Sie die benötigten Materialien: ein SPR-Instrument; Sensorchip L1; 7 x 14 mm Durchstechflasche; und CHAPS.
   2. Bereiten Sie einen Puffer mit 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP vor. Bereiten Sie eine 2:1-Verdünnungsserie von KRAS4b-FMe von 60 m–0,06 m bei einem Gesamtvolumen von 200 l (insgesamt 10 Titrationen) vor. Die endgültigen verdünnten Proben in Durchstechflasche (siehe Materialtabelle)übertragen, die Durchstechflasche in ein Rack legen und in das SPR-Instrument einlegen.
   3. Stecken Sie den L1-Sensorchip in das SPR-Instrument. Schließen Sie den Puffer an und grunden Sie das System mit puffer für 7 min.
   4. Richten Sie eine automatisierte Methode wie folgt ein:
      1. Stellen Sie die Gerätetemperatur auf 25 °C ein.
      2. Aktivieren Sie den Sensorchip L1, indem Sie ihn mit zwei 1 min Injektionen von 20 mM CHAPS in Wasser bei 30 l/min Durchfluss abspülen.
      3. Führen Sie Anlaufzyklen von zehn 1 min Injektionen von Laufpuffer, um die Chipoberfläche zu hydratisieren.
         1. Legen Sie die Liposomen auf den Sensorchip L1 ab, indem Sie die Liposomen auf die Durchflusszelle (FC)-2 des L1-Chips mit 2 Min Injektionen bei 5 l/min injizieren. Ziel für eine Erfassungsstufe von mindestens 3.000 USD Ansprecheinheiten (RUs).
            HINWEIS: Erhöhen Sie die Injektionszeit, bis Sie die entsprechende Aufnahmestufe erreichen.
      4. Injizieren Sie drei Pufferzyklen über FC-1 und FC-2 mit 1 min Injektionen bei 30 l/min.
         1. Injizieren Sie die verschiedenen KRAS4b-FMe Titrationen von der niedrigsten bis zur höchsten Konzentrationsserie. Injizieren Sie die Proteine mit 1 min Injektionen für die Assoziationsphase und 2 min Injektionen für die Dissoziationsphase bei einer Durchflussrate von 30 l/min über beide FCs.
         2. Regenerieren Sie den Sensorchip L1 durch Spülen mit zwei 1 min Injektionen von 20 mM CHAPS bei 30 l/min.
   5. Passen Sie die Daten mithilfe der SPR-Evaluierungssoftware mithilfe eines einzelnen Standortbindungsmodells an, um scheinbare Bindungsaffinitäten zu erhalten (siehe Abschnitt Diskussion für eine Erläuterung der Datenanpassung).

Ergebnisse

Eine der größten Variablen im Protokoll ist die Menge des exprimierenden Zielproteins (His6-MBP-tev-KRAS4b). Dieses Protokoll wurde unter Verwendung eines Isolats aus einer Trichoplusia ni-Zelllinie, Tni-FNL¹⁷, entwickelt, das für das Suspensionswachstum angepasst und aus Serum entwöhnt wurde. Angesichts der vielzahl von Ergebnissen, die über die verschiedenen Insektenzelllinien mit dem Baculovirus-Expressionssystem berichtet werden, ist es ratsam, Dass Tni-FNL zumindest anfangs verw...

Diskussion

Wie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse erwähnt, ist der wichtigste Schritt während der Reinigung die Handhabung der Probe während der Zeit, in der sie sich in geringerem Salz befindet. Die Begrenzung der Zeit, die die Probe weniger als 200 mM NaCl ausgesetzt ist, trägt dazu bei, die Niederschlagsmenge zu reduzieren und die Probenausbeute zu erhöhen. Die Interpretation der Ergebnisse der CEX kann schwierig sein, wenn das Profil nicht den Erwartungen entspricht (siehe Abbildung 2). B...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural	Eppendorf	22363204
11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials	Thermo Scientific	30211SS-1232
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)	AVANTI POLAR LIPIDS	850457	purchase as liquid stocks in chloroform
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS)	AVANTI POLAR LIPIDS	840034	purchase as liquid stocks in chloroform
5427R Centrifuge	Eppendorf
Acetonitrile, HPLC Grade	Fisher Chemical	A998-1 1L
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	09689-250g
Argon gas	Airgas	ARUP
Assay Plate 384	CORNING	3544
Biacore T200 Instrument	GE Healthcare
Blue Snap-It Seals, T/S	Thermo Scientific	C4011-54B
Branson Ultrasonic Bath	Thermo Fisher	15-336-1000
Cation Exchange Chromatography (CEX) column	GE Healthcare Life Sciences	29018183	HiPrep SP Sepharose High Performance
CHAPS	Sigma	C3023
Dyna Pro Plate Reader	Wyatt Technologies
Exactive Plus EMR Mass Spectrometer	Thermo Scientific
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500Ml	Use Reagent Grade or better
Gilson vials 7x14 mm Tubes	GE Healthcare	BR-1002-12
Glass screw thread vials with PTFE foam liners	Scientific Specialities	B69302
High speed/benchtop centrifuge	Thermo Fischer Scientific	05-112-114D	capable of up to 4,000 xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease	Addgene	92414	Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column	GE Healthcare Life Sciences	28-9365-51	HisPrep FF 16/10
In-House Water Supply, Arium Advance	Sartorius Stedim		Resistivity of 18 MΩ0-cm
Lipid extruder set with holder	AVANTI POLAR LIPIDS	610023
Liquid nitrogen	Airgas	NI-DEWAR
M110-EH microfluidizer	Microfluidics
MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm	Thermo Scientific	088645
MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm	Thermo Scientific	088790
MagTran software	Thermo Scientific
Methanol, HPLC Grade	VWR Chemicals	BDH20864.400
NGC Chromatography System	BioRad	78880002	NGC QuestTM 100 Chromatography system
Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators	Millipore Sigma	P8849
Rubber Caps type 3	GE Healthcare	BR-1005-02
Series S Sensor Chip L1	GE Healthcare	29104993
Spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific	13-400-519	Absorbace at 280nm
Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL	Millipore Sigma	UFC901008	PES membrane
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters	Amicon	UFC501024
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima - L80K	capable of 100,000 xg
Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System)	Thermo Scientific
Vortex Genie 2	Fisher	12-812
Water, HPLC Grade	Sigma-Aldrich	270733-1L	May use in-house water source (see below)
Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter	GE Healthcare - Whatman	6994-2504
Xcalibur QualBrowser	Thermo Scientific		proteomics software