Sistemas de permeación de imitación de olor controlados para entrenamiento olfativo y pruebas de campo

Resumen

El Sistema de Permeación de Olor Imitado Controlado es un método simple, portátil y de bajo costo de entrega de olores para pruebas y entrenamiento olfativos. Está construido de un olor retenido sobre un material adsorbente y contenido en el interior de una bolsa de polímero permeable que permite la liberación controlada del vapor de olor con el tiempo.

Resumen

El Sistema de Permeación de Olor Control (COMPS) fue desarrollado para proporcionar un método conveniente de prueba de campo de entrega de olores a velocidades controladas y reproducibles. LOS COMPS se componen de un olor de interés sobre un material absorbente sellado dentro de una bolsa de polímero permeable. La capa permeable permite una liberación constante del olor durante una cantidad determinada de tiempo. La bolsa permeable se almacena en una bolsa secundaria e impermeable. El procedimiento de doble contención permite el equilibrio del olor de la bolsa permeable pero dentro de la capa exterior impermeable, lo que resulta en una fuente instantánea y reproducible de vapor de olor al retirarlo del embalaje exterior. LOS COMPS se utilizan tanto en pruebas olfativas para escenarios experimentales como para entrenamiento de detección olfativa, como con caninos de detección. COMPS se puede utilizar para contener una amplia gama de olores (por ejemplo, polvos narcóticos) y proporcionar una liberación controlada de los olores asociados. La disponibilidad de olores de COMPS se expresa en términos de tasa de permeación (es decir, la velocidad del vapor de olor liberado de un COMPS por unidad de tiempo) y normalmente se mide por medios gravimétricos. La tasa de permeación para una masa o volumen de olor determinado se puede ajustar según sea necesario variando el grosor de la bolsa, el área de superficie y/o el tipo de polímero. La concentración de olor disponible de un COMPS también se puede medir mediante técnicas de análisis del espacio de cabeza, como la microextracción de fase sólida con cromatografía de gases/espectrometría de masas (SPME-GC/MS).

Introducción

La olfacción es un mecanismo de detección crucial, pero a menudo pasado por alto, utilizado por la mayoría de los animales. Para muchos es el principal mecanismo para localizar alimentos, encontrar una pareja, o detectar el peligro¹. Además, las capacidades olfativas de algunos animales, en particular los caninos, son explotadas regularmente por los seres humanos para la detección de contrabando (por ejemplo, narcóticos o explosivos), u otros objetos de interés, como personas desaparecidas, especies invasoras o enfermedades^2,3. Para la investigación de detección canina u otros temas de investigación de olfacción, los investigadores a menudo estudian el proceso de olfación y las fortalezas y limitaciones del sistema olfativo. Como tal, generalmente es deseable controlar la liberación de un vapor de olor en el medio ambiente para entregar de forma reproducible cantidades conocidas de olor durante las pruebas. No tener en cuenta las variaciones en la disponibilidad de olores debido a factores como la presión del vapor o los efectos ambientales a menudo complica la interpretación y aplicabilidad de los datos⁴. Es igualmente deseable proporcionar una cantidad establecida de olor durante los escenarios de entrenamiento para la detección de caninos. Por ejemplo, los estudios de Hallowell et al.⁵ y por Papet⁶ han indicado la importancia de la intensidad del olor en la percepción de olor, y que alterar la intensidad de un olor puede afectar la forma en que se percibe solo o en una mezcla.

En entornos de laboratorio, se puede utilizar el uso de equipos analíticos como tubos de permeación con hornos controlables, generadores de vapor o olfatometros para controlar la entrega de olores. Sin embargo, este tipo de equipo no es práctico para su uso durante las pruebas de campo y escenarios de entrenamiento⁴. El Sistema de Permeación de Olor Imitado Controlado (COMPS) fue desarrollado como un método simple, de bajo costo y desechable para la entrega controlada de olores que no requiere energía externa. Por lo tanto, se pueden incorporar fácilmente en una variedad de diferentes escenarios de prueba y entrenamiento⁷. Las unidades COMPS se componen simplemente de un olor de interés sobre un material absorbente sellado en el interior de una bolsa de polímero permeable, almacenado en un sistema de contención secundario. La utilización de COMPS reduce la variabilidad entre las pruebas y mejora la consistencia durante los ejercicios de entrenamiento⁸.

La entrega o disponibilidad de olores de COMPS se mide en términos de tasa de permeación, según lo determinado por el análisis gravimétrico en términos de masa de vapor liberado con el tiempo. Las tasas de permeación pueden ser controladas por una serie de factores, incluyendo el grosor de la bolsa de polímero, su superficie disponible, el tipo de material absorbente (sustrato) utilizado, y la cantidad del olor. La tasa de permeación es constante durante un período de tiempo determinado (horas o días) dependiendo del olor que se utilice. Esto permite una variabilidad mínima en la entrega de olores durante las pruebas o el entrenamiento. Durante el almacenamiento, COMPS llega al equilibrio dentro del contenedor exterior impermeable, lo que resulta en una fuente instantánea de vapor de olor a una tasa de permeación conocida.

LAS COMPS fueron diseñadas inicialmente para contener olores asociados con materiales explosivos y para ser utilizadas como imitaciones de olor^7. Tal como lo define Macias et al., una imitación de olor simula un material de interés, como un explosivo, proporcionando los compuestos volátiles dominantes, u olores, que se encuentran en el espacio de cabeza de ese material sin la presencia del propio material padre⁸. Para crear una imitación de olor, se deben determinar los olores activos del material padre. Un olor activo, en este escenario, se describe como un compuesto volátil que un canino de detección de explosivos entrenado detecta, creyendo que hay un material explosivo real presente. Después de haber identificado compuestos volátiles dominantes en el espacio de la cabeza de varios materiales explosivos, COMPS se preparó para liberar estos olores individuales a una velocidad controlada durante la duración de los ensayos de campo de detección olfativa canina y determinar el olor activo asociado con varios materiales explosivos. Los COMPS se utilizaron con éxito para este propósito^7,9 y desde entonces se han utilizado como imitaciones de olor para el entrenamiento de detección de explosivos adicionales.

Macias y otros utilizaron COMPS que contiene piperonal, un sólido químico puro a temperatura ambiente que, en la fase de vapor, ha demostrado ser el olor activo para MDMA (3,4-metilendioximetanfetamina), la droga psicoactiva conocida como éxtasis. Los investigadores utilizaron diferentes espesores y áreas superficiales de bolsas de polietileno de baja densidad para ajustar la tasa de permeación del vapor piperonal. Esta serie de COMPS se utilizó entonces para estimar el umbral de detección piperonal para los caninos entrenados de detección de narcóticos⁸. Por el contrario, en un estudio separado, los espesores de la bolsa COMPS se ajustaron para minimizar la desviación de las tasas de permeación entre cada compuesto en una serie homóloga, aunque poseían presiones de vapor drásticamente variables. Si se hubiera utilizado un solo espesor de bolsa en este estudio, aquellos compuestos con presiones de vapor más altas habrían producido tasas de permeación mucho más altas. Al aumentar el espesor de la bolsa para los compuestos de mayor volatilidad, las tasas de permeaciones se ajustaron de modo que eran similares para todos los compuestos^4. Ambos estudios demuestran la utilidad y adaptabilidad del COMPS para controlar la liberación de vapor. En la creación de imitaciones de olores para cathinones sintéticos (es decir, sales de baño)^10,otros estupefacientes (incluyendo heroína y marihuana¹¹⁾y compuestos de olor humano^12,13. En un ejemplo final, Simon y otros investigaron los olores activos asociados con una especie de hongo invasor¹⁴. Piezas enteras de corteza de árbol infectada, en lugar de los olores extraídos, se colocaron directamente en la bolsa de polímero para controlar la liberación durante las pruebas de olfacción canina¹⁴. COMPS se puede utilizar para una variedad de escenarios, y los protocolos discutidos en este documento fueron elegidos para demostrar la diversidad de esta herramienta.

Protocolo

1. Montaje de COMPS (Figura 1)

1. Para compuestos limpios (líquidos) sobre un sustrato(Figura 1A)
   1. Para impregnar el sustrato con olor, utilice una pipeta calibrada para añadir 5 s de compuesto limpio a una gasa de algodón de 2 x 2 pulgadas u otro sustrato de elección (ver Tabla de Materiales).
   2. Doble la almohadilla de gasa por la mitad y colóquela (o un material de sustrato alternativo) en una bolsa permeable de polietileno de baja densidad de 2 x 3 pulgadas. Los espesores de bolsa sugeridos son entre 1 MIL, para la tasa de permeación más rápida, a 8 MIL, para una tasa de permeación más lenta.
      NOTA: Se pueden utilizar variaciones en los materiales absorbentes, el tamaño de la bolsa permeable, la química de polímeros y el grosor, pero estos cambios afectan a la tasa de permeación de los olores (véase más discusión en la sección Resultados).
   3. Selle inmediatamente la bolsa de polímero cerrada con un sellador térmico, eliminando la mayor cantidad de aire del interior de las bolsas como sea posible.
   4. Guarde la bolsa en una bolsa exterior no permeable, o si se va a utilizar inmediatamente, colóquela en un bote de pesaje limpio en una campana de humos(Figura 1B).
2. Para material sólido, no es necesario ningún sustrato (Figura 1C)
   1. Pesar la cantidad deseada de material sólido, que puede ser un compuesto puro o material objetivo real, y colocar en una bolsa permeable de polietileno de baja densidad (LDPE) de 2 x 3 pulgadas. Una vez más, el espesor sugerido de la bolsa oscila entre 1 MIL y 8 MIL.
   2. Inmediatamente selle el calor de la bolsa de polímero cerrada, eliminando la mayor cantidad de aire del interior de la bolsa posible, y almacenar o reservar en un bote de pesaje.

2. Análisis gravimétrico para determinar la tasa de permeación COMPS

NOTA: Una temperatura ambiente constante es importante para mediciones precisas y reproducibles, tanto gravimétricas como espacio de cabeza. Se debe mantener una temperatura constante durante todas las pruebas. Se recomienda realizar todas las mediciones analíticas a las temperaturas deseadas durante las pruebas.

1. Para determinar la tasa de permeación de los olores a través de la bolsa permeable, coloque un COMPS recién hecho en un bote de pesaje dentro de una campana de humo.
2. Coloque un bote de pesaje limpio y separado en un equilibrio analítico y cero la balanza.
3. Retire los COMPS de la campana de humo y colóquelo en la balanza. Registre la masa e inmediatamente vuelva a la campana de humos.
4. Continúe registrando la masa del COMPS a lo largo de incrementos de tiempo regular hasta que la masa del COMPS ya no cambie (±5%). En este punto, el olor del COMPS se agota.
5. Como control negativo, cree un COMPS vacío que consista sólo en el material de sustrato sin olorantes sellados en la bolsa permeable. Trate este control negativo de la misma manera que el COMPS con olor para asegurar fluctuaciones mínimas en la masa a lo largo del tiempo.
6. Calcule la tasa de permeación a partir de la COMPS.
   1. Trazar la masa de COMPS frente al tiempo en una gráfica X-Y en el software de análisis estadístico adecuado.
   2. Ajuste una línea de tendencia lineal a solo la parte lineal del gráfico y muestre una ecuación en un gráfico. La línea de tendencia NO debe establecerse para incluir el origen. La pendiente de la línea (es decir, m en y á m+ b) es la tasa de permeación en masa por unidad de tiempo.

3. Análisis del espacio de cabeza por microextracción de fase sólida con cromatografía de gases/espectrometría de masas (SPME-GC/MS) (opcional)

1. Preparar un NUEVO COMPS siguiendo las instrucciones anteriores y dejar que se equilibre en un bote de pesaje abierto dentro de una campana de humo durante 30 minutos.
2. Retire el COMPS del bote de pesaje, colóquelo en un recipiente de muestra de metal forrado con epoxi de 1 pinta sin tapa, y colóquelo en un recipiente de metal revestido de epoxi de 1 galón. Los recipientes deben mantenerse en una campana de humo durante la duración del experimento.
3. Espere al menos 30 minutos para el equilibrio en el recipiente antes del muestreo.
4. Para el muestreo después del equilibrio, coloque una tapa con un orificio de 1 cm previamente perforado sobre el contenedor exterior. Inserte una fibra SPME apropiada a través del orificio de la tapa para extraer el analito de interés. Cuando no se utilice la fibra SPME, cubra el agujero con película de parafina o similar. El tiempo de extracción y el recubrimiento de fibra dependerán del tipo y la cantidad de vapor de analito presente, así como del tamaño del recipiente de muestreo y de las condiciones ambientales¹⁵.
5. Retire la fibra SPME después del tiempo de extracción asignado y colóquela en la entrada calentada de un GC/MS para la desorción térmica y el análisis.
   1. Ejecute el método GC/MS adecuado para el compuesto utilizado en comps¹⁶.
6. Para la cuantificación, compare el área de pico resultante con una curva de calibración externa¹⁶ y/o la norma interna¹⁷ según corresponda para el método y el diseño experimental.
   NOTA: 1) En este ejemplo, se utilizaron recipientes de muestras de metal revestidos de epoxi, pero también serían adecuados otros tipos de recipientes. Para comparar directamente la disponibilidad de olores con las evaluaciones olfativas de campo, sería mejor utilizar el mismo contenedor, limpiado entre cada prueba, para ambos experimentos; 2) Para obtener resultados reproducibles, todos los aspectos del procedimiento de muestreo deben mantenerse en todos los experimentos de réplica, incluidos, entre otros, el tiempo de equilibrio, el tiempo de extracción de SPME, el tipo y tamaño del contenedor y las condiciones ambientales (es decir, la temperatura y la humedad).

4. Almacenamiento COMPS

1. Coloque un solo COMPS en una bolsa de barrera metalizada (3,5 x 4,5 pulgadas) y cierre el calor para cerrar, eliminando la mayor cantidad de aire posible de la bolsa antes de sellar (Figura 1B).
2. Conservar en condiciones frías ambiente o refrigeradas, pero no por debajo o cerca de la congelación para evitar la formación de condensación a medida que el COMPS se descongela.
3. Si se prueban múltiples olores o tasas de entrega de olores en un solo experimento, se recomienda la contención secundaria para eliminar cualquier posible contaminación cruzada durante el transporte y el almacenamiento.
   1. Coloque las bolsas de barrera múltiples de réplica cada una de las mismas COMPS individuales de la misma tasa de analito y permeación en una bolsa metalizada externa o en un frasco de vidrio más grande para su almacenamiento y transporte.

5. Pruebas olfativas de campo

NOTA: Las pruebas olfativas se pueden llevar a cabo de muchas maneras diferentes dependiendo del animal que está siendo probado, el objetivo del experimento y las condiciones ambientales. El protocolo siguiente describe una de estas maneras de probar. Todas las pruebas con animales deben ser revisadas y aprobadas primero por un Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

1. En primer lugar, cree COMPS de control en blanco o negativo como se ha descrito anteriormente. Haga lo suficiente para que cada contenedor en el escenario de prueba contendrá COMPS de repuesto (2–3 dependiendo del número de animales involucrados en el experimento). Empaquete todos los COMPS en blanco en contención secundaria (es decir, una bolsa metalizada más grande o un frasco de vidrio con tapa de sellado).
2. Cree COMPS nuevos según sea necesario para el protocolo de prueba de campo previsto. Elimine todas las posibles fuentes de contaminación entre el COMPS y la bolsa metalizada. Esto se puede lograr mediante el cambio regular de guantes y la limpieza de la superficie de trabajo de laboratorio.
3. Almacene el COMPS durante al menos 1 día antes de usarlo para permitir el equilibrio. Almacene las réplicas en el mismo contenedor secundario. Sin embargo, diferentes COMPS deben estar en contenedores secundarios separados.
4. Para configurar una prueba olfativa canina básica, establezca varias líneas de al menos cinco contenedores idénticos (por ejemplo, latas metálicas, cajas), con el número de líneas que dependen del número de variables que se están probando.
   1. Configure la versión de prueba para que cada línea contenga un contenedor con el COMPS de destino y cuatro con COMPS en blanco. Las líneas de control positivas, preparadas de la misma manera pero con un olor de destino conocido, se pueden utilizar según corresponda para el escenario de experimento, entrenamiento o prueba. Un control negativo adicional o una línea en blanco debe contener cinco COMPS en blanco y ningún objetivo. Ordene esta línea de control negativa, la línea de control positiva (si está utilizando) y las líneas de prueba al azar, y cambie el orden utilizando un generador de números aleatorios para cada prueba olfativa canina como práctica para el escenario de prueba.
      1. Incluya también un olor/material de distractor por línea.
      2. Aleatorizar el orden y la ubicación del objetivo y distractor olores en cada línea para cada canino que se está probando utilizando un generador de números aleatorios.
5. Para preparar los recipientes, retire COMPS de los contenedores secundarios y exteriores, colocando solo la bolsa permeable en el contenedor de prueba.
   1. Permita que el COMPS se equilibre en el recipiente durante un mínimo de 30 minutos antes de la prueba.
   2. Repita los pasos para cada COMPS que se utilice en la prueba, comenzando con espacios en blanco, seguido de controles positivos (si está utilizando) y luego probando olores, cambiando los guantes cada vez.
      NOTA: Se pueden encontrar ejemplos detallados de escenarios de pruebas caninas en Simon et al.⁴ o Macias et al.⁸.

Resultados

El objetivo principal de utilizar COMPS en pruebas olfativas/entrenamiento es controlar la liberación de los olores elegidos y entregar una cantidad controlada del olor durante la duración de la prueba o sesión de entrenamiento. La liberación de odorantes se mide mediante análisis gravimétricos en términos de pérdida de masa por unidad de tiempo. La Figura 2 ofrece un ejemplo de resultados gravimétricos a partir de la permeación de tres COMPS idénticos preparados a partir de 5 sl ...

Discusión

Los sistemas de permeación de olores controlados (COMPS) se crean fácilmente sellando un olor de interés en una bolsa permeable. Esto se puede hacer pipeteando un compuesto líquido limpio sobre un material absorbente y luego colocando el material absorbente en la bolsa; mediante la colocación de un compuesto puro, sólido directamente en la bolsa⁴, como se hizo en el caso de piperonal⁸; o colocando el material objetivo que contiene olores múltiples o desconocidos en u...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 oz economy jars (70-450 finish)	Fillmore container	A16-08C-Case 12
7890A gas chromatograph / 5975 mass selective detector	Agilent
Analytical balance	Mettler Toledo	01-911-005
Ball regualr bands and dome lids	Fillmore container	J30000
Cotton gauze (2" x 2")	Dukal
Disposable weighing boats	VWR	10803-148
Epoxy-lined sample containers, 1 gallon	TriTech Forensics	CANG-E
Epoxy-lined sample containers, 1 pint	TriTech Forensics	CANPT-E
Low density polyetheylene bag	Uline	S-5373
Rtx-Volatiles (30 m x 0.32 mmID) column	Restek	10901
Silver metalized mylar barrier bag (3.5" x 4.5")	ESP Packaging	95509993779
Silver metalized mylar barrier bag (5" x 8.5" x 3")	ESP Packaging	95509993793
Solid phase microextration fiber assembly (PDMS/DVB/CAR)	Sigma-Aldrich	57328-U
Solid phase microextration holder	Sigma-Aldrich	57330-U
Tabletop Impulse Sealer	Uline	H-190	Heat sealer