Sistemas de permeação de odor controlados para treinamento olfativo e testes de campo

Resumo

O Sistema de Permeação Odor Controlado é um método simples, portátil de campo e de baixo custo de entrega de odor para testes e treinamento olfativos. É construído de um odor retido em um material adsorbent e contido dentro de um saco de polímero permeável permitindo a liberação controlada do vapor odorante ao longo do tempo.

Resumo

O Sistema de Permeação De Odor Controlado (COMPS) foi desenvolvido para fornecer um método conveniente de teste de campo de entrega de odor a taxas controladas e reprodutíveis. Os COMPS são compostos por um odor de interesse em um material absorvente selado dentro de um saco de polímero permeável. A camada permeável permite uma liberação constante do odor durante um determinado período de tempo. O saco permeável é ainda armazenado em um saco secundário e impermeável. O procedimento de dupla contenção permite o equilíbrio do odorante do saco permeável, mas dentro da camada externa impermeável, resultando em uma fonte instantânea e reprodutível de vapor odoante após a remoção da embalagem externa. OS COMPS são usados tanto em testes olfativos para cenários experimentais quanto para treinamento de detecção olfativa, como com caninos de detecção. O COMPS pode ser usado para conter uma ampla gama de odores (por exemplo, pós de narcóticos) e fornecer uma liberação controlada dos odores associados. A disponibilidade de odor do COMPS é expressa em termos de taxa de permeação (ou seja, a taxa do vapor odor liberado de um COMPS por tempo unitário) e é tipicamente medida por meios gravimétricos. A taxa de permeação para uma determinada massa ou volume de odorante pode ser ajustada conforme necessário, variando a espessura do saco, área de superfície e/ou tipo de polímero. A concentração de odor disponível de um COMPS também pode ser medida por técnicas de análise do headspace, como microextração de fase sólida com cromatografia de gás/espectrometria de massa (SPME-GC/MS).

Introdução

A olfação é um mecanismo crucial, mas muitas vezes negligenciado, de sensoriamento usado pela maioria dos animais. Para muitos é o principal mecanismo para localizar alimentos, encontrar um companheiro ou sentir perigo¹. Além disso, as capacidades olfativas de alguns animais, mais notadamente caninos, são regularmente explorados por humanos para a detecção de contrabando (por exemplo, narcóticos ou explosivos), ou outros objetos de interesse, como pessoas desaparecidas, espécies invasoras ou doenças^2,3. Para pesquisas de detecção canina ou outros tópicos de pesquisa de olfação, os pesquisadores frequentemente estudam o processo de olfação e os pontos fortes e limitações do sistema olfativo. Como tal, é geralmente desejável controlar a liberação de um vapor odorante no ambiente para entregar de forma reproduzivelmente quantidades conhecidas de odorno durante os testes. A não contabilização das variações na disponibilidade de odor devido a fatores como pressão de vapor ou efeitos ambientais muitas vezes complica a interpretação dos dados e a aplicabilidade⁴. É igualmente desejável fornecer uma quantidade estabelecida de odor durante cenários de treinamento para caninos de detecção. Por exemplo, estudos de Hallowell et al.⁵ e papet⁶ indicaram a importância da intensidade do odor na percepção do odor, e que alterar a intensidade de um odor pode afetar a forma como ele é percebido sozinho ou em uma mistura.

Em ambientes laboratoriais, o uso de equipamentos analíticos como tubos de permeação com fornos controláveis, geradores de vapor ou olfactômetros pode ser usado para controlar a entrega de odor. No entanto, este tipo de equipamento é impraticável para uso durante os cenários de teste e treinamento de campo⁴. O Sistema de Permeação De Odor Controlado (COMPS) foi desenvolvido como um método simples, de baixo custo e descartável para entrega de odor controlado que não requer energia externa. Portanto, eles podem ser facilmente incorporados em uma variedade de diferentes cenários de teste e treinamento⁷. As unidades COMPS são simplesmente compostas de um odor de interesse em um material absorvente selado dentro de um saco de polímero permeável, armazenado em um sistema de contenção secundário. A utilização do COMPS reduz a variabilidade entre os testes e melhora a consistência durante os exercícios de treinamento⁸.

A entrega ou disponibilidade de odor do COMPS é medida em termos de taxa de permeação, conforme determinado pela análise gravimétrica em termos de massa de vapor liberada ao longo do tempo. As taxas de permeação podem ser controladas por uma série de fatores, incluindo a espessura do saco de polímero, sua área de superfície disponível, o tipo de material absorvente (substrato) utilizado e a quantidade do odorante. A taxa de permeação é constante por um determinado período de tempo (horas ou dias) dependendo do odorante que está sendo utilizado. Isso permite uma variabilidade mínima na entrega de odor durante o teste ou treinamento. Durante o armazenamento, o COMPS chega ao equilíbrio dentro do recipiente externo impermeável, resultando em uma fonte instantânea de vapor odorante a uma taxa de permeação conhecida.

O COMPS foi inicialmente projetado para conter odores associados a materiais explosivos e para ser usado como odor imita⁷. Conforme definido por Macias et al., uma mímica de odor simula um material de interesse, como um explosivo, fornecendo os compostos voláteis dominantes, ou odores, encontrados no espaço da cabeça desse material sem a presença do próprio material pai⁸. Para criar uma imitação de odor, os odores ativos do material pai devem ser determinados. Um odor ativo, neste cenário, é descrito como um composto volátil que um canino treinado de detecção de explosivos detecta, acreditando que há um material explosivo real presente. Tendo identificado compostos voláteis dominantes no headspace de vários materiais explosivos, o COMPS foi preparado para liberar esses odores individuais a uma taxa controlada durante a duração dos ensaios de campo de detecção olfativo canino e determinar o odorante ativo associado a vários materiais explosivos. Os COMPS foram usados com sucesso para este fim^7,9 e desde então têm sido usados como odor imitadores para mais treinamento de detecção de explosivos.

Macias et al. utilizaram comps contendo piperonal, um sólido químico puro à temperatura ambiente que, na fase de vapor, tem se mostrado o odorante ativo para MDMA (3,4-metilenodioximetamfetamina), a droga psicoativa conhecida como ecstasy. Os pesquisadores usaram espessuras variadas e áreas superficiais de sacos de polietileno de baixa densidade para ajustar a taxa de permeação do vapor piperonal. Esta série de COMPS foi então usada para estimar o limiar de detecção piperonal para caninos treinados de detecção de narcóticos⁸. Por outro lado, em um estudo separado, as espessuras dos sacos COMPS foram ajustadas para minimizar o desvio das taxas de permeação entre cada composto em uma série homólogo, embora possuíssem pressões de vapor drasticamente variadas. Se uma única espessura de saco tivesse sido usada neste estudo, esses compostos com pressões de vapor mais altas teriam rendido taxas de permeação muito mais altas. Ao aumentar a espessura do saco para os compostos de maior volatilidade, as taxas de permeação foram ajustadas de modo que eram semelhantes para todos os compostos⁴. Ambos os estudos demonstram a utilidade e a adaptabilidade do COMPS para controlar a liberação de vapor. Estudos semelhantes que otimizam a espessura do saco de polímero, bem como material absorvente foram realizados na criação de odor imitadores para catinonas sintéticas (ou seja, sais de banho)^10,outros narcóticos (incluindo heroína e maconha^11),e compostos de odor humano^12,13. Em um exemplo final, Simon et al. investigaram os odores ativos associados a uma espécie de fungo invasivo¹⁴. Pedaços inteiros de casca de árvore infectada, em vez dos odores extraídos, foram colocados diretamente no saco de polímero para controlar a liberação durante o teste de olfação canina¹⁴. O COMPS pode ser utilizado para uma variedade de cenários, e os protocolos aqui discutidos foram escolhidos para demonstrar a diversidade desta ferramenta.

Protocolo

1. Montagem de COMPS (Figura 1)

1. Para composto puro (líquido) em um substrato(Figura 1A)
   1. Para engravidar o substrato com odoante, use uma pipeta calibrada para adicionar 5 μL de composto puro a uma gaze de algodão de 2 x 2 polegadas ou outro substrato de escolha (ver Tabela de Materiais).
   2. Dobre a almofada de gaze ao meio e coloque isso (ou um material alternativo do substrato) em um saco permeável de polietileno de baixa densidade de 2 x 3 polegadas. As espessuras sugeridas do saco estão entre 1 MIL, para a taxa de permeação mais rápida, até 8 MIL, para uma taxa de permeação mais lenta.
      NOTA: Podem ser utilizadas variações em materiais absorventes, tamanho do saco permeável, química do polímero e espessura, mas essas alterações afetam a taxa de permeação dos odores (veja mais discussão na Seção de Resultados).
   3. Veda imediatamente o saco de polímero fechado com um aquecedor, eliminando o máximo de ar de dentro dos sacos.
   4. Guarde a bolsa em um saco externo não permeável, ou se ele será usado imediatamente, coloque-o em um barco de pesagem limpo em um capô de fumaça(Figura 1B).
2. Para material sólido, não é necessário substrato(Figura 1C)
   1. Pesar a quantidade desejada de material sólido, que pode ser um composto puro ou material alvo real, e coloque em um saco permeável de 2 x 3 polegadas de baixa densidade (LDPE). Mais uma vez, a espessura do saco sugerido varia de 1 MIL a 8 MIL.
   2. Imediatamente feche o saco de polímero, eliminando o máximo de ar possível de dentro do saco, e armazene ou reserve em um barco de pesagem.

2. Análise gravimétrica para determinar a taxa de permeação comps

NOTA: Uma temperatura ambiente constante é importante para medidas precisas e reprodutíveis, tanto gravimétricas quanto para o espaço para a cabeça. Uma temperatura constante deve ser mantida durante todos os testes. Recomenda-se realizar todas as medições analíticas a temperaturas desejadas durante os testes.

1. Para determinar a taxa de permeação dos odores através do saco permeável, coloque um COMPS recém-feito em um barco de pesagem dentro de um capô de fumaça.
2. Coloque um barco de pesagem limpo e separado em um equilíbrio analítico, e zero o equilíbrio.
3. Remova o COMPS do capô da fumaça e coloque sobre o equilíbrio. Grave a massa e retorne imediatamente ao capô da fumaça.
4. Continue registrando a massa do COMPS ao longo dos incrementos de tempo regular até que a massa do COMPS não mude mais (±5%). Neste ponto, o odor do COMPS está esgotado.
5. Como um controle negativo, crie um COMPS vazio que consiste apenas no material do substrato sem odores selados no saco permeável. Trate este controle negativo da mesma forma que o COMPS com odoante para garantir flutuações mínimas em massa ao longo do tempo.
6. Calcule a taxa de permeação do COMPS.
   1. Plote a massa do COMPS versus o tempo em um gráfico X-Y em software de análise estatística apropriado.
   2. Encaixe uma linha de tendência linear apenas na porção linear do gráfico e exiba uma equação em um gráfico. A linha de tendência NÃO deve ser definida para incluir a origem. A inclinação da linha (ou seja, m em y = m+ b) é a taxa de permeação em massa por unidade.

3. Análise do headspace por microextração de fase sólida com cromatografia de gás/espectrometria de massa (SPME-GC/MS) (opcional)

1. Prepare um COMPS fresco seguindo as instruções acima e deixe-o equilibrar-se em um barco de pesagem aberto dentro de um capô de fumaça por 30 minutos.
2. Retire o COMPS do barco de pesagem, coloque-o em um recipiente de amostra de metal forrado com epóxi de 1 litro sem tampa e coloque-o em um recipiente de metal forrado com epóxi de 1 galão. Os recipientes devem ser mantidos em um capô de fumaça durante a duração do experimento.
3. Permita pelo menos 30 minutos para o equilíbrio no recipiente antes da amostragem.
4. Para amostragem após o equilíbrio, coloque uma tampa com um orifício de 1 cm previamente perfurado sobre o recipiente externo. Insira uma fibra SPME apropriada através do orifício na tampa para extrair o analito de interesse. Quando a fibra SPME não for usada, cubra o orifício com filme de parafina ou semelhante. O tempo de extração e o revestimento de fibras dependerão do tipo e quantidade de vapor analito presente, bem como do tamanho do vaso amostral e das condições ambientais¹⁵.
5. Remova a fibra SPME após o tempo de extração alocado e coloque na entrada aquecida de um GC/MS para desorção e análise térmica.
   1. Execute o método GC/MS apropriado para o composto utilizado no COMPS¹⁶.
6. Para a quantitação, compare a área de pico resultante com uma curva de calibração externa¹⁶ e/ou padrão interno¹⁷ conforme apropriado para o método e design experimental.
   NOTA: 1) Neste exemplo, foram utilizados recipientes de amostra de metal forrados com epóxi, mas outros tipos de recipientes também seriam adequados. Para comparar diretamente a disponibilidade de odor com avaliações olfativas de campo, seria melhor usar o mesmo recipiente, limpo entre cada teste, para ambos os experimentos; 2) Para resultados reprodutíveis, todos os aspectos do procedimento amostral devem ser mantidos em todos os experimentos de replicação, incluindo, mas não se limitando ao tempo de equilíbrio, tempo de extração do SPME, tipo e tamanho do contêiner e condições ambientais (ou seja, temperatura e umidade).

4. Armazenamento COMPS

1. Coloque um único COMPS em um saco de barreira metalizado (3,5 x 4,5 polegadas) e adaça-se a calor para fechar, removendo o máximo de ar possível do saco antes da vedação(Figura 1B).
2. Armazene em condições ambientes legais ou refrigerados, mas não abaixo ou perto de congelar para evitar a formação de condensação à medida que o COMPS descongela.
3. Se testar várias taxas de entrega de odores ou odorantes em um único experimento, recomenda-se a contenção secundária para eliminar qualquer possível contaminação cruzada durante o transporte e armazenamento.
   1. Coloque vários sacos de barreira cada um contendo COMPS individuais da mesma taxa de análise e permeação em um saco ou frasco de vidro mais alto e metalizado para armazenamento e transporte.

5. Teste olfativo de campo

NOTA: Os testes olfativos podem ser realizados de muitas maneiras diferentes, dependendo do animal ser testado, do objetivo do experimento e das condições ambientais. O protocolo abaixo descreve uma dessas formas de teste. Todos os testes em animais devem primeiro ser revisados e aprovados por um Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

1. Primeiro, crie comps de controle em branco ou negativo conforme descrito acima. Faça o suficiente para que todos os recipientes no cenário de teste contenham COMPS sobressalentes (2-3, dependendo do número de animais envolvidos no experimento). Embale todos os COMPS em branco juntos na contenção secundária (ou seja, um saco metalizado maior ou frasco de vidro com tampa de vedação).
2. Crie comps frescos conforme necessário para o protocolo de teste de campo pretendido. Elimine todas as possíveis fontes de contaminação entre o COMPS e o saco metalizado. Isso pode ser feito com troca regular de luvas e limpeza da superfície de trabalho laboratorial.
3. Armazene o COMPS por pelo menos 1 dia antes do uso para permitir o equilíbrio. Armazene quaisquer réplicas no mesmo recipiente secundário. No entanto, diferentes COMPS devem estar em recipientes secundários separados.
4. Para configurar um teste olfativo canino básico, estabeleça várias linhas de pelo menos cinco recipientes idênticos (por exemplo, latas de metal, caixas), com o número de linhas dependentes do número de variáveis a serem testadas.
   1. Configure o teste para que cada linha contenha um recipiente com o COMPS de destino e quatro com COMPS em branco. Linhas de controle positivas, preparadas da mesma maneira, mas com um odor alvo conhecido, podem ser usadas conforme apropriado para o cenário de experimento, treinamento ou teste. Um controle negativo adicional ou linha em branco deve conter cinco COMPS em branco e nenhum alvo. Ordene esta linha de controle negativa, linha de controle positiva (se usar) e linhas de teste aleatoriamente, e troque a ordem usando um gerador de números aleatórios para cada teste olfativo canino como prático para o cenário de teste.
      1. Inclua um odorante/material por linha também.
      2. Randomize a ordem e a localização do alvo e distrai os odores em cada linha para cada canino sendo testado usando um gerador de números aleatórios.
5. Para preparar os recipientes, remova o COMPS dos recipientes secundários e externos, colocando apenas o saco permeável no recipiente de ensaio.
   1. Deixe que o COMPS se equilibre no recipiente por um mínimo de 30 minutos antes do teste.
   2. Repita os passos para cada COMPS que está sendo usado no teste, começando com espaços em branco, seguido por controles positivos (se usarem) e, em seguida, testando odores, trocando luvas todas as vezes.
      NOTA: Exemplos detalhados de cenários de teste canino podem ser encontrados em Simon et al.⁴ ou Macias et al.⁸.

Resultados

O objetivo principal do uso do COMPS em testes/treinamento olfativos é controlar a liberação dos odores escolhidos e fornecer uma quantidade controlada do odor durante a duração do teste ou sessão de treinamento. A liberação de odorante é medida pela análise gravimétrica em termos de perda de massa por tempo unitário. A Figura 2 dá um exemplo de resultados gravimétricos a partir da permeação de três COMPS idênticos preparados a partir de 5 μL de ácido pentanóico na gaze ...

Discussão

Os Sistemas de Permeação De Odor Controlado (COMPS) são facilmente criados selando um odor de interesse em um saco permeável. Isso pode ser feito colocando um composto líquido puro em um material absorvente e, em seguida, colocando o material absorvente no saco; colocando um composto puro e sólido diretamente no saco^4,como foi feito no caso da piperonal⁸; ou colocando o material alvo contendo odores múltiplos ou desconhecidos em um saco permeável, como foi feito com...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 oz economy jars (70-450 finish)	Fillmore container	A16-08C-Case 12
7890A gas chromatograph / 5975 mass selective detector	Agilent
Analytical balance	Mettler Toledo	01-911-005
Ball regualr bands and dome lids	Fillmore container	J30000
Cotton gauze (2" x 2")	Dukal
Disposable weighing boats	VWR	10803-148
Epoxy-lined sample containers, 1 gallon	TriTech Forensics	CANG-E
Epoxy-lined sample containers, 1 pint	TriTech Forensics	CANPT-E
Low density polyetheylene bag	Uline	S-5373
Rtx-Volatiles (30 m x 0.32 mmID) column	Restek	10901
Silver metalized mylar barrier bag (3.5" x 4.5")	ESP Packaging	95509993779
Silver metalized mylar barrier bag (5" x 8.5" x 3")	ESP Packaging	95509993793
Solid phase microextration fiber assembly (PDMS/DVB/CAR)	Sigma-Aldrich	57328-U
Solid phase microextration holder	Sigma-Aldrich	57330-U
Tabletop Impulse Sealer	Uline	H-190	Heat sealer