Montaje dirigido de proteínas similares a la elastina en estructuras supramoleculares definidas y encapsulación de carga in Vitro

Resumen

En la interfaz de disolventes orgánicos y acuosos, las proteínas anfifílicas a medida similares a la elastina se ensamblan en estructuras supramoleculares complejas como vesículas, fibras y coacervados desencadenados por parámetros ambientales. Los protocolos de montaje descritos producen compartimentos basados en membranas de proteínas (PMBC) con propiedades ajustables, lo que permite la encapsulación de varias cargas.

Resumen

Los bloques de construcción proteígicos a medida son candidatos versátiles para el montaje de estructuras supramoleculares como células mínimas, vehículos de administración de medicamentos y andamios enzimáticos. Debido a su biocompatibilidad y atún a nivel genético, las proteínas similares a la elastina (ELP) son bloques de construcción ideales para aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. Sin embargo, el montaje de estructuras supramoleculares basadas en proteínas con propiedades fisioquímicas distintas y un buen potencial de encapsulación sigue siendo un reto.

Aquí proporcionamos dos protocolos eficientes para el autoensamblaje guiado de ELP anfifílicos en arquitecturas de proteínas supramoleculares como coacervados esféricos, fibras y vesículas estables. Los protocolos de montaje presentados generan compartimentos basados en membranas proteicas (PMBC) basados en ELP con propiedades fisicoquímicas adaptables. Los PBPC demuestran el comportamiento de separación de fases y revelan la fusión de membranadependiente del método y son capaces de encapsular moléculas de carga fluorescente químicamente diversas. Los PMBC resultantes tienen un alto potencial de aplicación como plataforma de formulación y entrega de medicamentos, célula artificial y espacio de reacción compartimentado.

Introducción

El montaje de estructuras supramoleculares para aplicaciones biotecnológicas es cada vez más importante^1,2,3,4,5. Para el montaje de arquitecturas funcionales como coacervados, vesículas y fibras con las propiedades fisicoquímicas deseadas es importante comprender y controlar las propiedades fisicoquímicas y conformacionales de los componentes. Debido a la precisión molecular de las moléculas que se encuentran en la naturaleza, los bloques de construcción para las estructuras supramoleculares se basan cada vez más en lípidos, ácidos nucleicos o proteínas. En comparación con los polímeros sintéticos, los bloques de construcción proteíricos permiten un control preciso sobre las estructuras supramoleculares emergentes⁶ a nivel genético. La secuencia de aminoácidos primarios (aa) de los bloques de construcción de proteínas individuales codifica intrínsecamente la información para su potencial de ensamblaje desde el nivel molecular hasta el nivel macroscópico, así como la forma tridimensional y las propiedades físicas de la estructura supramolecular final^7.

Los métodos reportados para el montaje de diferentes estructuras supramoleculares a menudo involucran proteínas anfifílicas como proteínas sensibles a la elastina sensibles a la temperatura (ELP)^5,8,9, oleosina recombinante¹⁰y anfifes de proteínas artificiales¹¹. Los métodos activados por temperatura han llevado al montaje de micelas^4,10,12Fibras¹³Hojas¹⁴y vesículas^9,15,16. Se han aplicado métodos de disolventes orgánicos para la formación de vesículas dinámicas a base de proteínas^8,11,14. Hasta ahora, los protocolos aplicados para la formación de vesículas a menudo carecen de control de montaje sobre los conjuntos de tamaño de los micrómetros^16,17o tienen un rendimiento de montaje limitado⁵. Además, algunas vesículas basadas en ELP informaron han deteriorado el potencial de encapsulación¹²o estabilidad limitada en el tiempo⁹. Abordando estos inconvenientes, los protocolos presentados permiten el autoensamblaje de estructuras supramoleculares de tamaño de micrómetro y sucrómetro con propiedades fisioquímicas distintas, buen potencial de encapsulación y estabilidad de largo plazo. Los ELP anfifílicos a medida se ensamblan en estructuras supramoleculares, abarcando el rango de coacervados esféricos y paquetes de fibra retorcida altamente ordenados hasta vesículas unilamelares dependiendo del protocolo aplicado y las condiciones ambientales asociadas. Los grandes compartimentos basados en membranas de proteínas vesiculares (PMBC) revelan todos los fenotipos principales, como la fusión por membrana y el comportamiento de separación de fase análogo a los liposomas. Los PMBC encapsulan eficientemente moléculas de carga fluorescente químicamente diversas que se pueden monitorear mediante microscopía de epifluorescencia simple. Los dominios ELP repetitivos utilizados en este estudio son bloques de construcción atractivos para arquitecturas supramoleculares basadas en proteínas¹⁸. La unidad de repetición de pentapéptido el ELP (VPGVG) es conocida por tolerar diferentes aa además de prolina en la cuarta posición (valina, V), preservando sus propiedades estructurales y funcionales¹⁹. El diseño de ELP anfifílicos que contienen dominios hidrófilos e hidrófobos distintivos se realizó insertando residuos de invitados aa (X) en la repetición VPGXG con hidrofobicidad, polaridad y carga distintas²⁰. Dominios el ELP anfifílicos donde está equipado con fenilalanina hidrófoba (F) o isoleucina (I) mientras que el dominio hidrófilo contenía ácido glutámico cargado (E) o arginina (R) como residuos de invitado. Una lista de construcciones elP anfifílicas elegibles y las correspondientes secuencias aa se puede encontrar en la información suplementaria y referencias^8,21. Todos los bloques de construcción están equipados con pequeños tintes fluorescentes o proteínas fluorescentes para su visualización mediante microscopía de fluorescencia. mEGFP y otras proteínas fluorescentes se fusionaron n terminalmente a los dominios hidrófilos de los anfifílicos ELP. Los colorantes orgánicos se conjugaron a través de una cepa libre de cobre promovida por la cicloadición alquino-azida (SPAAC) a un aminoácido no natural (UAA) introducido co-traduccionalmente. La incorporación co-traduccional de la UAApara-azidofenilalanina (pAzF)²²permite la modificación N-terminal del dominio ELP hidrófilo. De esta manera el tinte fluorescente verde BDP-FL-PEG₄-DBCO (BDP) o cualquier molécula fluorescente pequeña con un ciclooctino tenso se puede utilizar como sonda fluorescente. La incorporación exitosa del uAA pAzF y la cicloadición del tinte a través de SPAAC se puede confirmar fácilmente a través de LC-MS/MS debido a la ionización eficiente de los péptidos trippticos correspondientes⁸. Este pequeño tinte orgánico se aplicó para ampliar la opción de disolvente para los protocolos de montaje, ya que las proteínas fluorescentes son incompatibles con la mayoría de los disolventes orgánicos. A continuación se describen los dos protocolos de montaje más eficientes para estructuras supramoleculares desarrolladas en nuestro laboratorio. El método de hinchazón THF sólo es compatible con el ELP anfifílico modificado con tinte orgánico. Por el contrario, el método de extrusión de 1 butanol (BuOH) es compatible con muchas proteínas como sonda fluorescente, por ejemplo, mEGFP, ya que el método descrito preserva completamente la fluorescencia de estas proteínas de fusión. Además, la encapsulación de moléculas pequeñas y el comportamiento de fusión vesicular funcionan mejor empleando el método de extrusión BuOH.

Protocolo

1. Diseño y clonación de proteínas anfifílicas similares a la elastina (ELP)

1. Clonar y diseñar las construcciones como se describe en otros lugares^8,20. Hay plásmidos disponibles bajo petición.

2. Expresión, purificación y preparación de proteínas

1. Expresión de F20E20-mEGFP y F20E20-mCherry
   1. Inocular la cultura de expresión principal de la precultura nocturna a una_{Do6 de} 0,3. Incubar a 37oC, 200 rpm en medio estéril de 400 ml LB complementado con antibióticos apropiados en un matraz de 2 L.
   2. Preparar la solución de stock IPTG (1 M) para la inducción del cultivo de expresión en agua ultrapura.
   3. Cuando se alcance OD₆₀₀ 0.5–0.8, agregue IPTG al cultivo de expresión a una concentración final de 1 mM y reduzca la temperatura de incubación a 20 oC. Permitir la expresión a 20oC durante aproximadamente 20 h a 200 rpm.
2. Expresión de ELP anfifílico que contiene UAA pAzF
   1. Inocular el cultivo de expresión principal desde el precultivo de E. coli durante la noche que contiene los dos plásmidos pEVOL pAzF y, por ejemplo, pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his a una DO₆₀₀ de 0.3 (ver información complementaria para secuencias de aminoácidos). Incubar a 37oC, 200 rpm en medio estéril de 400 ml LB complementado con kanamicina y cloramphenicol en un matraz de 2 L.
   2. Prepare una solución de stock de 100 mM pAzF en agua ultrapura. Para 10 ml de solución de material pAzF, pesar 206,2 mg de pAzF y resuspenderlo en 8 ml de agua ultrapura. Para disolver el pAzF elevar el pH de la solución con 3 M NaOH y mezclar vigorosamente. Cuando se disuelva pAzF, baje cuidadosamente el pH a 10,5 y añada agua ultrapura a un volumen final de 10 ml. Utilice un filtro estéril (0,22 m) y alícuota la solución en tubos de reacción de 2 ml.
   3. Prepare una solución de stock IPTG de 1 M en agua ultrapura y una solución de stock de 20% de arabinosa en agua ultrapura.
   4. Cuando se alcanza OD₆₀₀ 0.5–0.8, agregue pAzF al cultivo de expresión a una concentración final de 2 mM. Cultivo de incubación para 10 min, 37oC, 200 rpm para permitir la suposición de pAzF.
   5. Inducir la expresión de la proteína diana y la expresión de la necesaria tRNA/t-RNA sintetasa mediante la adición simultánea de IPTG (1 mM) y arabinosa (2%) y reducir la temperatura de incubación a 20 oC.
   6. Permitir la expresión a 20oC durante aproximadamente 20 h a 200 rpm. Cultivo de expresión de la cosecha por centrifugación a 4oC, 4000 x g,40 min.
3. Lisis celular y purificación de proteínas
   1. Resuspender el pellet de E. coli en tampón de lisis (10 ml por litro de cultivo; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0.25% Tritón X-100) que contiene lisozima (0,1 mg/ml) y PMSF (0,1 mM). Incubar durante 30 minutos sobre hielo y congelar y descongelar dos veces después sumergiendo la muestra en nitrógeno líquido.
   2. Sonicar la suspensión (30%, 15 veces, 30 s: 10 s romper) y limpiar el lisado a través de centrifugación (4 oC, 10.000 x g durante 40 min).
   3. Purificar proteínas mediante cromatografía de afinidad (por ejemplo, en una columna de níquel de 1 ml utilizando un sistema FPLC conectado a un colector de fracciones; véase Tabla de materiales). Eluir la proteína con tampón de elución (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, urea de 4 M, imidazol de 250-500 mM) y almacenar a 4 oC hasta su posterior procesamiento.
   4. Analice la eficiencia de purificación a través de SDS-PAGE.

3. Modificación del tinte de LOSP a través de SPAAC

1. Estimar aproximadamente la concentración de la solución ELP.  Una absorción_{de 280} para la evaluación de la concentración no es valiosa ya que la secuencia pAzF-R40F20 carece de aminoácidos que absorben en el rango UV. Por lo tanto, un anfifílico ELP previamente liofilizado y ponderado se puede utilizar como referencia para la comparación de bandas SDS PAGE. Mediante la comparación del valor gris sumado de las bandas SDS PAGE de las soluciones ELP con concentraciones conocidas y se puede estimar la concentración aproximada de la muestra.
2. Añadir 1 l de colorante fluorescente BDP-FL-PEG4-DBCO (solución de stock de 10 mM; concentración final de 20 M) a 500 ml de solución de ELP (20 m). Incubar la reacción durante unas 10 h a 15oC, mientras tiembla y está protegido de la luz.
3. Para un uso posterior, dializar la reacción para eliminar el BDP excesivo.
   1. Equilibrar una membrana de diálisis (por ejemplo, corte de 12 kDa) en agua ultrapura durante 10 minutos. Cortar la membrana de diálisis en el tamaño correcto que se colocará en la parte superior de la abertura de un tubo de reacción que contenga la solución ELP en la que se ha hecho clic. Para fijar la membrana de diálisis en la abertura, coloque una tapa del tubo de reacción con el núcleo perforado en la abertura, cerrando así el tubo.
   2. Coloque el tubo de reacción boca abajo en el tampón elegido. Intercambie el búfer (2–5 L) dos veces después de la diálisis durante al menos 3 horas cada vez. Retire las burbujas de aire atrapadas entre la membrana de diálisis y el tampón para garantizar una diálisis exitosa.

4. Protocolo de hinchazón thF

1. Solución ELP homogénea de dialíze contra el tampón de fosfato o tris (10 mM) con pH estable 7,5 para eliminar sales y compuestos restantes de la purificación de su etiqueta.
2. Prepare el liofilizador y enfríe hasta la temperatura inicial para el secado por congelación.
3. Aliquot la solución de proteína dializada en tubos de reacción de 1,5 ml (50-500 ml por tubo) y congelación por choque en nitrógeno líquido. Para evitar la mezcla no deseada de diferentes soluciones proteicas durante el secado por congelación, las tapas con un pequeño orificio se pueden colocar en la parte superior del tubo de reacción para sellarlo parcialmente.
4. Saque las muestras de proteínacongelada del nitrógeno líquido e colóquelas inmediatamente en el liofilizador para comenzar a secarse con congelación. El secado por congelación se termina cuando la muestra está completamente seca (aproximadamente 24-48 h). Posteriormente, ventile los ElP anfifílicos liofilizados con N₂seco, luego cierre inmediatamente las tapas del tubo de reacción para evitar el contacto con la humedad del aire.
5. Añadir el THF puro a las muestras liofilizadas (ELP, 5-10 m) y colocar la solución en un sonicador de baño de agua que contenga agua helada durante 15 minutos para permitir la hinchazón de la ELP en THF.
6. Precalentar un termociclador a 30–60 oC para la formación de vesículas o hasta 90 oC para la formación de fibra y preparar nuevos tubos de reacción que contengan agua ultrapura o tampón (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 5–13). Los coacervados esféricos se ensamblan predominantemente a 20oC dentro del pH 9–13. La formación de la vesícula se favorece a 50–60 oC entre pH 7 y 9. La formación de fibra se induce predominentamente por encima de 60oC entre pH 5 y 12.
7. Después del paso de sonicación, coloque la solución ELP/THF, así como la solución de agua ultrapura o tampón preparada en el termociclador y caliente hasta la temperatura deseada durante 5 min. Cuando se alcanza la temperatura, la solución de ELP/THF precalentada debe estratificarse cuidadosamente encima de la solución precalentada de agua ultrapura o tampón. Una separación clara de las dos fases con una interfaz distinta debe ser visible.
8. Colocar la mezcla en el termociclador de nuevo e incubar durante 20 minutos para permitir la formación de vesículas o fibra en la interfaz. Después, deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante 10 minutos antes del análisis mediante microscopía de fluorescencia o diálisis.
9. Solución de dializar que contiene las estructuras supramoleculares contra agua ultrapura o tampón (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 7–10).

5. Protocolo de extrusión BuOH

1. Preparar una solución ELP de 1–50 m en agua ultrapura o tampón (50 mM PB pH 7,5, 100 mM de NaCl, puede contener hasta 4 M de urea). La concentración de la solución anfifílica ELP F20R20-mEGFP y F20R20-mCherry se puede determinar utilizando los coeficientes de extinción molar (F20R20-mEGFP A₂₈₀ a 22015 M^-1 cm^-1 y F20R20-mCherry A₂₈₀ a 34380 M^-1 cm^-1) (ver información complementaria para secuencias de aa).
2. Agregue entre un 10% y un 20% (v/v) 1-butanol e mezcle inmediatamente la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo o dibujándola a través de una jeringa varias veces. Se puede aplicar una pipeta común de 100 ml o una jeringa Hamilton equipada con una aguja de 0,25 x 25 mm. La turbidez de la solución durante la mezcla debe aumentar, lo que indica la formación de vesículas. 1-octanol 5%–15% (v/v) también se puede utilizar para la extrusión de vesículas en lugar de 1-butanol.
3. Con el fin de lograr una distribución de tamaño estrecho, extruya las vesículas utilizando un mini extrusor a través de una membrana con un tamaño de poro de 1 m a temperatura ambiente. El tamaño de membrana utilizado para la extrusión determina el límite de tamaño superior de las vesículas.
4. Dializar las vesículas como se describió anteriormente (paso 3.3) para eliminar el 1-butanol residual.

6. Encapsulación de tinte con el protocolo de extrusión BuOH

1. Mezclar aproximadamente 40 l de solución el IPL en Tris-HCl de 10 mM, pH 8 con 1 L Dextran Texas Red (0,0025 mg/ml de concentración final).
2. Agregue 10 ml de BuOH a la solución y extruya de 5 a 10 veces a través de una jeringa equipada con una aguja de 0,25 x 25 mm.

7. Análisis de estructuras supramoleculares mediante microscopía de fluorescencia

1. Coloque un anillo de refuerzo en un portaobjetos de vidrio y presione firmemente el lado adhesivo al vidrio.
2. Añadir 5 l de la muestra al interior del anillo de refuerzo y colocar un resbalón de la cubierta en la parte superior.
3. Selle la muestra con esmalte de uñas en los bordes del deslizamiento de la cubierta para evitar la evaporación de la muestra durante el análisis.
4. Realizar la microscopía de fluorescencia como se describió anteriormente⁸.

Resultados

Desarrollo de protocolos para la producción de vesículas
La Figura 1 describe los dos métodos diferentes de preparación de vesículas. El método de hinchazón THF en el lado izquierdo se compone de tres pasos sucesivos y da como resultado diferentes conjuntos supramoleculares del ELP dependiendo de la temperatura. En la Figura 1A, las imágenes de microscopía de epifluorescencia muestran vesículas ensamblad...

Discusión

Un fallo al seguir los protocolos descritos para el montaje de estructuras supramoleculares definidas conduce principalmente a la formación de agregados inespecíficos(Figura 2,IV) o a anfifílicos ELP distribuidos homogéneos. Los pasos críticos del protocolo se discuten a continuación:

Para un alto rendimiento de expresión del ELP anfifílico, una temperatura relativamente baja de 20oC es óptima. Para una purificación exitosa basada en la afinidad de la EL...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 µm and 0.2 µm Steril Filter	VWR
1,4-Dithiothreitol	Merck
1-butanol. >99.5% p.a.	Roth
2log DNA ladder	NEB
2-Mercaptoethanol	Roth
50 mL Falcon tubes	VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye	Sigma Aldrich
Acetic acid glacial	VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99%	Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO	Jena Bioscience
Biofuge	Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm)	Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)	Roth
BspQI	NEB
Camera DS Qi1	Nikon
Centrifuge 5417r	Eppendorf
Centrifuge 5810r	Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid	EMS
Chloramphenicol	Roth
CompactStar CS 4	VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral	Life Technologies
Digital sonifier	Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Applichem
Dnase I	Applichem
EarI	NEB
EcoRI-HF	NEB
Environmental shaker incubator ES-20	Biosan
Ethanol absolute	Roth
Ethidium bromide solution	Roth
Filter supports	Avanti
Glass plates	Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade	Amresco
Glycin	Applichem
H4-Azido-Phe-OH	Bachhem
Heat plate MR HeiTec	Heidolph
HindIII	NEB
HisTrap FF crude column	GE Life Sciences		Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.	Merck
Illuminator ix 20	INTAS
Illuminator LAS-4000	Fujifilm
Imidazole	Merck
Immersions oil for microscopy	Merck
Incubators shakers Unimax 1010	Heidolph
Inkubator 1000	Heidolph
IPTG, >99%	Roth
Kanamycinsulfate	Roth
L(+)-Arabinose	Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE	Sartorius
LB-Medium	Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC	Christ
Lysozyme, 20000 U/mg	Roth
Microscope CM 100	Philips
Microscope Eclipse TS 100	Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)	VWR
Microscopy slides	VWR
Microwave	Studio
Mini-Extruder Set	Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a.	Roth
Natriumhydroxid pellets	Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro	5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane	Avanti
PH meter 766 calimatic	Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)	Roth
Polypropylene Columns (1 mL)	Qiagen
PowerPac basic	BioRad
Propanol-2-ol	Emplura
Protein ladder 10-250 kDa	NEB
Recirculating cooler F12	Julabo
Reinforcement rings	Herma
SacI HF	NEB
SDS Pellets	Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4	VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate	VWR
T4 DNA Ligase	NEB
TEMED	Roth
TexasRed Dextran-Conjugate	MolecularProbes
Thermomix comfort	Eppendorf
THF, >99.5% p.a.	Acros
Triton X 100	Roth
Trypton/Pepton from Casein	Roth
Ultrasonic cleaner	VWR
Urea p.a.	Roth
Vacuum pump 2.5	Vacuubrand
XbaI	NEB
XhoI	NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)	Roth