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要約

有機溶媒および水性溶媒の界面では、カスタマイズされた両親媒性エラスチン様タンパク質は、環境パラメータによって引き起こされる小胞、繊維、コアセルベートなどの複雑な上分子構造に組み立てられます。記載された組立プロトコルは、調整可能な特性を有するタンパク質膜ベースのコンパートメント(PMBC)を生成し、様々な貨物のカプセル化を可能にする。

要約

テーラードプロフェナスビルディングブロックは、最小細胞、薬物送達車、酵素足場などの上分子構造の組み立てのための汎用性の高い候補です。遺伝子レベルでの生体適合性とタンナビリティにより、エラスチン様タンパク質(ELP)は、バイオテクノロジーおよびバイオメディカルアプリケーションに理想的なビルディングブロックです。それにもかかわらず、異なる物理化学的特性と良好なカプセル化の可能性を有するタンパク質ベースの上分子構造の組み立ては依然として困難である。

ここでは、球状コアセルベート、繊維、安定した小胞などの上分子タンパク質アーキテクチャへの両親媒性ELPの誘導自己集合のための2つの効率的なプロトコルを提供します。提示されたアセンブリプロトコルは適応可能な物理化学的特性を有するELPに基づいてタンパク質膜ベースのコンパートメント(PMBCs)を生成する。PMBCは、相分離挙動を実証し、方法依存性膜融合を明らかにし、化学的に多様な蛍光カルゴ分子をカプセル化することができます。得られたPMBCは、薬剤製剤および送達プラットフォーム、人工細胞、および区画化反応空間として高い応用可能性を有する。

概要

バイオテクノロジーアプリケーションのための上分子構造の組み立ては、1、2、3、4、52,3,4,5ますます重要になってきています。コアセルベート、小胞、所望の物理化学的特性を有する繊維などの機能アーキテクチャの組み立てには、成分の物理化学的および立体構造特性を理解し、制御することが重要です。自然界に見られる分子の分子精度により、上分子構造のビルディングブロックは、脂質、核酸、タンパク質に基づいています。合成ポリマーと比較して、タンパク質性ビルディングブロックは、遺伝的レベルでの創発的な超分子構造6を正確に制御することを可能にする。個々のタンパク質構築ブロックの一次アミノ酸(aa)配列は、分子から巨視的レベルまでの組み立てポテンシャルの情報、ならびに最終的な上層分子構造7の3次元形状および物性に関する情報を本質的にコードする。

異なる上分子構造の組み立てのための報告された方法は、多くの場合、温度感受性エラスチン様タンパク質(ELP)などの両親媒性タンパク質を含む5,8,9、組換えオレオジン10人工タンパク質両親媒性体11.温度トリガ方法は、ミセルの組み立てにつながっています4,10,12繊維13シート14と小胞9,15,16.有機溶媒を含む方法は、動的タンパク質ベースの小胞の形成に適用されている8,11,14.これまでのところ、小胞形成のための適用されたプロトコルは、多くの場合、マイクロメーターサイズのアセンブリに対するアセンブリ制御を欠く16,17またはアセンブリの収量が限られている5.さらに、報告されたELPベースの小胞の中には、カプセル化の可能性が損なわれている12または時間の経過に応じ安定性が制限される9.これらの欠点に対処するために、提示されたプロトコルは、異なる物理化学的特性、良好なカプセル化電位および長期安定性を有するマイクロメータおよびサブマイクロメータサイズの超分子構造の自己集合を可能にする。合わせた両親媒性ELPは、球状のコアセルベートや高度に順序付けられたねじれた繊維束から、適用されたプロトコルおよび関連する環境条件に応じてユニラメラ小胞まで、幅広い範囲に及ぶ上層分子構造に組み立てられます。大型のベシキュラータンパク質膜ベースコンパートメント(PMBC)は、リポソームに類似した膜融合および相分離挙動などの主要な表現型をすべて明らかにします。PMBCは、化学的に多様な蛍光カルゴ分子を効率的にカプセル化し、単純な蛍光顕微鏡で監視することができます。この研究で使用される反復ELPドメインは、タンパク質ベースの上分子アーキテクチャの魅力的なビルディングブロックです18.ELPペンタペプチド反復ユニット(VPGVG)は、その構造的および機能的特性を維持しながら、4番目の位置(valine,V)でプロリン以外の異なるaaを許容することが知られている19.独特の親水性および疎水性ドメインを含む両親媒性ELPの設計は、明確な疎水性、極性、および電荷を伴うVPGXG反復にaaゲスト残基(X)を挿入することによって実現された20.疎水性フェニルアラニン(F)またはイソロイシン(I)を備えた両親媒性ELPドメインは、一方で、親水性ドメインにはゲスト残基としてグルタミン酸(E)またはアルギニン(R)を含んでいた。適格な両親媒性ELP構造および対応するaa配列のリストは、補足情報および参照に記載されています。8,21.蛍光顕微鏡による可視化用に、小さな蛍光色素または蛍光タンパク質のいずれかを装備したすべてのビルディングブロック。mEGFPと他の蛍光タンパク質を、ELP両親媒性の親水性ドメインにN末端に融合した。有機色素は、非天然アミノ酸(UAA)を同時導入したアルキン-アジドシクロ付加(SPAAC)を促進した銅フリー株を介して共役した。UAAの共同翻訳の組み込みpara-アジドフェニルアラニン (pAzF)22親水性ELPドメインのN末端修飾を可能にする。このように緑色蛍光色素BDP-FL-PEG4-DBCO(BDP)または、シクロオクティンが緊張した任意の小さな蛍光分子を蛍光プローブとして使用することができます。UAA pAzFの組み込みとSPAAC経由の色素のサイクロ付加は、対応するトリプティックペプチドの効率的なイオン化により、LC-MS/MSを介して容易に確認することができます8.蛍光タンパク質はほとんどの有機溶媒と相容れないため、この小さな有機色素は、組立プロトコルの溶媒選択を広げるために適用されました。当社の研究室で開発された上分子構造の2つの最も効率的な組立プロトコルを以下に説明します。THFの膨潤法は有機染料修飾された両親媒性ELPとのみ適合する。これに対して、1-ブスタノール(BuOH)押出方法は、例えばmEGFPのような蛍光プローブとして多くのタンパク質と互換性があるが、記載された方法はこれらの融合タンパク質の蛍光を完全に保存するからである。さらに、BuOH押出法を採用することで、小分子および小分子のカプセル化と小胞融合挙動が最適です。

プロトコル

1. 両親媒性エラスチン様タンパク質(Elps)の設計とクローニング

  1. 他の場所で説明されているように、コンストラクトをクローン化して設計 8,20.プラスミドはリクエストに応じてご利用いただけます。

2. タンパク質発現、精製および調製

  1. F20E20-mEGFPおよびF20E20-mCherryの発現
    1. 一晩前培養から0.3のOD600に主発現培養を接種する。37°Cでインキュベート、200rpmの無菌400mL LB培地に2Lフラスコに適当な抗生物質を添加した。
    2. 超純水の発現培養を誘導するためにIPTGストック溶液(1M)を調製する。
    3. OD600 0.5~0.8に達したら、IPTGを発現培養物に加えて、最終濃度の1mMにし、インキュベーション温度を20°Cに下げます。200rpmで約20時間、20°Cで発現を可能にする。
  2. UAA pAzFを含有する両親媒性ELPの発現
    1. 2つのプラスミドpEVOL pAzFおよび例えばpET28-NMBL-(TAG)-R40F20-hisを0.3のOD600に含む一晩の大腸菌前培養からの接種主発現培養(アミノ酸配列の補足情報を参照)。37°Cでインキュベート、200rpmの無菌400mL LB培地でカナマイシンとクロラムフェニコールを2Lフラスコに添加した。
    2. 超純水で100 mM pAzFストック溶液を準備します。pAzFストック溶液の10 mLの場合、206.2 mgのpAzFの重量を量り、8 mLの超純水で再懸濁します。pAzFを溶解させて3M NaOHで溶液のpHを上げ、激しく混合する。pAzFが溶解したら、pHを10.5に慎重に下げ、超純水を10mLの最終体積に加えます。滅菌フィルター(0.22 μm)を使用し、2 mL反応チューブ内の溶液をアリコートします。
    3. 1 M IPTGストック溶液を超純水で、20%アラビノースストック溶液を超純水で調製します。
    4. OD600 0.5~0.8 に達したら、式の培養に pAzF を加え、最終的な濃度 2 mM にします。10分間の培養、37°C、200rpmの培養を行い、pAzFの取り込みが可能です。
    5. IPTG(1 mM)とアラビノース(2%)の同時添加により、標的タンパク質の発現と必要なtRNA/t-RNA合成酵素の発現を誘導するインキュベーション温度を20°Cに下げる。
    6. 200rpmで約20時間、20°Cで発現を可能にする。4°Cでの遠心分離による収穫発現培養、4000xg、40分。 g
  3. 細胞のリシスとタンパク質精製
    1. リソザイム(0.1 mg/mL)およびPMSF(0.1 mM)を含むライシスバッファー(1リットル当たり10mL;50mTris-HCl pH 8、500 mM NaCl、4 M尿素、0.25%トリトンX-100)中の大腸菌ペレットを再懸濁させる。氷上で30分間インキュベートし、液体窒素にサンプルを浸して凍結し、その後2回解凍します。
    2. 懸濁液を超音波処理(30%、15回、30 s:10 sブレーク)、遠心分離(4°C、40分間10,000 x g)を介してリセートをクリアします。
    3. アフィニティークロマトグラフィーを使用してタンパク質を精製する(例えば、分画コレクタに接続されたFPLCシステムを使用して1mLニッケルカラム上で、材料表を参照)。溶出バッファー (50 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、4 M 尿素、250~500 mM イミダゾール) で溶出バッファーを溶出し、さらに処理するまで 4 °C で保存します。
    4. SDS-PAGEを介して精製効率を分析します。

3. SPAAC経由のELPsの色素改変

  1. ELP溶液の濃度を大まかに推定します。 pAzF-R40F20配列は、UV範囲で吸収するアミノ酸を欠いているので、濃度評価のための280吸収は有用ではない。従って、以前に凍結乾燥し、加重されたELP両親媒性は、SDS PAGEバンド比較のための基準として使用することができる。ELP溶液からのSDS PAGEバンドの合計グレー値のインテライトと既知の濃度とサンプルの推定値を比較することで、サンプルの大まかな濃度を推定することができます。
  2. 蛍光色素BDP-FL-PEG4-DBCO(10 mMストック溶液、最終濃度20μM)を1μL、ELP溶液500μL(〜20μM)に添加します。15°Cで約10時間、振りながら、光から保護しながら、反応をインキュベートします。
  3. さらなる使用のために、過剰なBDPを除去する反応を透析する。
    1. 透析膜(例えば12kDaカットオフ)を超純水で10分間平衡化し、透析膜を正しいサイズに切り取り、クリックしたELP溶液を含む反応管の開口部の上に置きます。開口部に透析膜を固定するには、開口部にコアをパンチアウトした反応管蓋を置き、チューブを閉じます。
    2. 選択したバッファーに反応管を逆さまに置きます。透析後にバッファ(2~5 L)を少なくとも3時間交換します。透析膜とバッファーの間に閉じ込められた気泡を取り除き、透析を成功させるために。

4. THF膨潤プロトコル

  1. 安定したpH 7.5を用いたリン酸塩またはトリスバッファー(10 mM)に対する透析均質ELP溶液は、タグ精製から塩および残りの化合物を除去する。
  2. 凍結乾燥機を準備し、凍結乾燥のために開始温度まで冷却します。
  3. アリコート 1.5 mL反応管(1管あたり50〜500 μL)の透析タンパク質溶液と液体窒素中のショックフリーズ。凍結乾燥中に異なるタンパク質溶液の望ましくない混合を避けるために、小さな穴を持つキャップを反応管の上に置いて部分的に密封することができます。
  4. 凍結したタンパク質サンプルを液体窒素から取り出し、すぐに凍結乾燥を開始するために凍結乾燥剤に入れます。凍結乾燥は、サンプルが完全に乾燥した状態(約24〜48時間)で終了します。続いて、乾燥N2で凍結乾燥した両親媒性ELPを換気し、空気水分との接触を避けるために反応管蓋を直ちに閉じる。
  5. 純粋なTHFを凍結乾燥したサンプル(ELP、5〜10 μM)に加え、THFのELPの腫脹を可能にするために、氷水を含む水浴超音波処理器に溶液を15分間入れます。
  6. 熱サイクルをベシクル形成のために30〜60°Cに予熱し、繊維形成のために90°Cまで予熱し、超純水または緩衝液(50 mM NaH2PO 4 /Na2HPO4、50mM NaCl、pH 5-13)を含む新しい反応管を準備する。4球状のコアセルベートは、pH 9-13内で主に20°Cで組み立てられます。ベシクル形成は、pH 7と9の間の50〜60°Cで好ましい。繊維形成は、pH5と12の間で60°C以上に誘導される。
  7. 超音波処理ステップの後、ELP /THF溶液と準備された超純水または緩衝液をサーモサイクラーに入れ、5分間所望の温度まで加熱します。温度に達すると、予熱されたELP /THF溶液は、予熱された超純水または緩衝液の上に慎重に階層化する必要があります。2 つのフェーズを明確に分離して、個別のインターフェイスを使用する必要があります。
  8. 再びサーモサイクラーに混合物を入れ、20分間インキュベートして、界面で小胞または繊維形成を可能にします。その後、蛍光顕微鏡または透析を介して分析する前に、サンプルを室温まで10分間冷却します。
  9. 超純水または緩衝液に対する超分子構造を含む透析液(50 mM NaH2PO4/Na2HPO4、50mM NaCl、pH 7-10)。

5. BuOH 押出プロトコル

  1. 1~50 μM ELP溶液を超純水またはバッファー(50 mM PB pH 7.5、100 mM NaCl、最大4M尿素を含む場合があります)を調製してください。両親媒性ELP F20R20-mEGFPおよびF20R20-mCherry溶液の濃度は、モル絶滅係数(F20R20-mEGFP A280=22015 M-1cm-1およびF20R20-mCherryA280 = 34380M-cm-1の情報を参照)を使用して決定することができる。 -1
  2. 10%~20%(v/v)1-ブタノールを加え、上下にピペットを作ったり、シリンジを複数回引き上げたりして、すぐに溶液を混ぜます。0.25 x 25 mmの針を装備した一般的な100 μLピペットまたはハミルトンの注射器を適用することができます。混合中の溶液の濁度が増加するはずであり、小胞形成を示す。1-オクタノール 5%~15%(v/v)は、1-ブサノールの代わりに小胞押出にも使用できます。
  3. 狭いサイズの分布を達成するために、室温で1μmの細孔サイズの膜を通してミニ押出機を使用してベシクルを押し出す。押出に使用される膜サイズは、小胞の上部のサイズカットオフを決定します。
  4. 上記のように小胞を透析(ステップ3.3)し、残留1-ブタノールを除去する。

6. BuOH 押出プロトコルによる色素のカプセル化

  1. 約 40 μL の ELP 溶液を 10 mM Tris-HCl に混合し、pH 8 に 1 μL デキストラン テキサス レッド (0.0025 mg/mL 最終濃度) を混ぜます。
  2. 溶液にBuOHの10 μLを加え、0.25 x 25 mmの針を装備した注射器を通して5~10回押し出します。

7. 蛍光顕微鏡による超分子構造解析

  1. ガラススライドに補強リングを置き、接着面をしっかりと押し付けます。
  2. 補強リングの内側にサンプル5μLを加え、カバースリップを上に置きます。
  3. 分析中にサンプルの蒸発を避けるために、カバースリップの端にマニキュアでサンプルを密封します。
  4. 前述の8のように蛍光顕微鏡を実施する。

結果

小胞生産のためのプロトコル開発
図 1は、2 つの異なる小胞調製方法の概要を示しています。左側のTHF膨潤法は3つの連続したステップで構成され、温度に応じてELPの異なる上分子集合体を生じる。図1Aの蛍光顕微鏡画像はBDP-R20F20から組み立てられた小胞およびBDP-R40F20から組み立てられた細胞構造を示す。右側?...

ディスカッション

定義された上層分子構造の組み立てに関する記載されたプロトコルに従う間の障害は、主に非特異的な凝集体(図2、IV)の形成または均質に分散したELP-両親球体のいずれかにつながる。プロトコルの重要な手順について、以下で説明します。

両親媒性ELPの発現量が高い場合は、20°Cの比較的低温が最適です。両親媒性ELPの親和性に基づく精製に成功す...

開示事項

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

謝辞

著者らは、BMBFの財政支援と、研究施設を提供してくれた生物システム分析センター(ZBSA)に感謝する。プラスミドpEVOL-pAzFを提供してくれたP.G.シュルツ、TSRI、ラホヤ、カリフォルニア州、アメリカに感謝しています。アルバート・ルートヴィヒス大学フライブルク生物システム分析センター(ZBSA)のライフイメージングセンター(LIC)のスタッフの共焦点顕微鏡資源、画像記録の優れたサポートに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 µm and 0.2 µm Steril FilterVWR
1,4-DithiothreitolMerck
1-butanol. >99.5% p.a.Roth
2log DNA ladderNEB
2-MercaptoethanolRoth
50 mL Falcon tubesVWR
79249 Alkyne Mega Stokes dyeSigma Aldrich
Acetic acid glacialVWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8%Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99%Roth
BDP-FL-PEG4-DBCOJena Bioscience
BiofugeHeraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm)Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)Roth
BspQINEB
Camera DS Qi1Nikon
Centrifuge 5417rEppendorf
Centrifuge 5810rEppendorf
CF-400-Cu square mesh copper gridEMS
ChloramphenicolRoth
CompactStar CS 4VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutralLife Technologies
Digital sonifierBranson
Dimethylsulfoxide (DMSO)Applichem
Dnase IApplichem
EarINEB
EcoRI-HFNEB
Environmental shaker incubator ES-20Biosan
Ethanol absoluteRoth
Ethidium bromide solutionRoth
Filter supportsAvanti
Glass platesBio-Rad
Glycerol Proteomics GradeAmresco
GlycinApplichem
H4-Azido-Phe-OHBachhem
Heat plate MR HeiTecHeidolph
HindIIINEB
HisTrap FF crude columnGE Life SciencesNickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.Merck
Illuminator ix 20INTAS
Illuminator LAS-4000Fujifilm
ImidazoleMerck
Immersions oil for microscopyMerck
Incubators shakers Unimax 1010Heidolph
Inkubator 1000Heidolph
IPTG, >99%Roth
KanamycinsulfateRoth
L(+)-ArabinoseRoth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCESartorius
LB-MediumRoth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSCChrist
Lysozyme, 20000 U/mgRoth
Microscope CM 100Philips
Microscope Eclipse TS 100Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)VWR
Microscopy slidesVWR
MicrowaveStudio
Mini-Extruder SetAvanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a.Roth
Natriumhydroxid pelletsRoth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro5 Prime
Nucleopore Track-Etch MembraneAvanti
PH meter 766 calimaticKnick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)Roth
Polypropylene Columns (1 mL)Qiagen
PowerPac basicBioRad
Propanol-2-olEmplura
Protein ladder 10-250 kDaNEB
Recirculating cooler F12Julabo
Reinforcement ringsHerma
SacI HFNEB
SDS PelletsRoth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose AcetateVWR
T4 DNA LigaseNEB
TEMEDRoth
TexasRed Dextran-ConjugateMolecularProbes
Thermomix comfortEppendorf
THF, >99.5% p.a.Acros
Triton X 100Roth
Trypton/Pepton from CaseinRoth
Ultrasonic cleanerVWR
Urea p.a.Roth
Vacuum pump 2.5Vacuubrand
XbaINEB
XhoINEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)Roth

参考文献

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