Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

Resumen

Este protocolo ilustra 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto, así como 2) la purificación y caracterización de exosomas utilizando un método de ultracentrifugación diferencial combinado con gradientes de densidad de sacarosa seguidos de análisis de Western blot.

Resumen

Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares liberadas por prácticamente todas las células y secretadas en todos los fluidos biológicos. Se han desarrollado muchos métodos para el aislamiento de estas vesículas, incluida la ultracentrifugación, la ultrafiltración y la cromatografía de exclusión por tamaño. Sin embargo, no todos son adecuados para la purificación y caracterización de exosomas a gran escala. A continuación se describe un protocolo para establecer cultivos de fibroblastos primarios aislados de músculos esqueléticos de ratones adultos, seguido de la purificación y caracterización de exosomas de los medios de cultivo de estas células. El método se basa en el uso de pasos secuenciales de centrifugación seguidos de gradientes de densidad de sacarosa. A continuación, se valida la pureza de las preparaciones exosomales mediante análisis de Western blot utilizando una batería de marcadores canónicos (es decir, Alix, CD9 y CD81). El protocolo describe cómo aislar y concentrar exosomas bioactivos para microscopía electrónica, espectrometría de masas y experimentos de captación para estudios funcionales. Puede ampliarse o reducirse fácilmente y adaptarse para el aislamiento de exosomas de diferentes tipos de células, tejidos y fluidos biológicos.

Introducción

Los exosomas son vesículas extracelulares heterogéneas que varían en tamaño de 30 a 150 nm. Se han establecido actores clave en los procesos fisiológicos y patológicos, dada su distribución ubicua en tejidos y órganos ^1,2. Los exosomas transportan una carga compleja de proteínas, lípidos, tipos de ADN y tipos de ARN, que varían según el tipo de células de las que se derivan ^1,2,3. Los exosomas están enriquecidos en proteínas que tienen diferentes funciones (es decir, las tetraspaninas, incluidas CD9 y CD63) son responsables de los eventos de fusión. Por ejemplo, las proteínas de choque térmico HSP70 y HSP90 están involucradas en la unión y presentación de antígenos. Además, Alix, Tsg101 y flotillina participan en la biogénesis y liberación de exosomas y son ampliamente utilizados como marcadores de estas nanovesículas ^2,3,4.

Los exosomas también contienen una variedad de ARN (es decir, microARN, ARN largos no codificantes, ARN ribosómicos) que pueden transferirse a las células receptoras, donde influyen^{en la señalización} posterior. Al estar encerrada por una sola unidad de membrana, la bioactividad de los exosomas depende no solo de la carga de proteínas y ácidos nucleicos, sino también de los componentes lipídicos de la membrana limitante^. Las membranas exosómicas están enriquecidas en fosfatidilserina, ácido fosfatídico, colesterol, esfingomielina, ácido araquidónico y otros ácidos grasos, todos los cuales pueden influir en la estabilidad de los exosomas y la topología de la membrana ^2,3. Como resultado de la disposición de la carga y los lípidos, los exosomas inician vías de señalización en las células receptoras y participan en el mantenimiento de la fisiología tisular normal 1,2,4,5. Bajo ciertas condiciones patológicas (es decir, neurodegeneración, fibrosis y cáncer), se ha demostrado que desencadenan y propagan estímulos patológicos 4,6,7,8,9,10,11.

Debido a su capacidad para propagar señales a sitios vecinos o distantes, los exosomas se han convertido en biomarcadores valiosos para el diagnóstico o pronóstico de enfermedades. Además, los exosomas se han utilizado experimentalmente como vehículos de compuestos terapéuticos ^2,12. La posible aplicación de estas nanovesículas en la clínica hace que el método de aislamiento sea cada vez más importante para lograr el máximo rendimiento, pureza y reproducibilidad. Se han desarrollado e implementado diferentes técnicas para el aislamiento de exosomas. En general, los exosomas se pueden aislar de medios de cultivo celular acondicionados o fluidos corporales mediante centrifugación diferencial, cromatografía de exclusión por tamaño y captura inmunitaria (utilizando kits disponibles comercialmente). Cada enfoque tiene ventajas y desventajas únicas que se han discutido anteriormente 1,2,13,14.

El protocolo descrito se centra en 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto y 2) la purificación y caracterización de los exosomas liberados en el medio de cultivo por estas células. Actualmente se carece de un protocolo bien establecido para el aislamiento de exosomas de fibroblastos primarios para estudios funcionales. Los fibroblastos primarios no secretan grandes cantidades de exosomas, lo que dificulta el proceso de aislamiento y purificación. Este protocolo describe la purificación de grandes cantidades de exosomas puros a partir de grandes volúmenes de cultivo, manteniendo su integridad morfológica y actividad funcional. Los exosomas purificados obtenidos a partir de medio acondicionado se han utilizado con éxito en experimentos de captación in vitro para inducir vías de señalización específicas en las células receptoras. También se han utilizado para análisis proteómicos comparativos de cargas exosomales de múltiples muestras biológicas⁴.

Protocolo

Todos los procedimientos en ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos con animales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del St. Jude Children's Research Hospital y las pautas de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Preparación de soluciones y medios

1. Prepare la solución de digestión mezclando 15,4 ml de PBS con 2,5 ml de 20 mg/ml de colagenasa P (concentración final de 5 mg/ml), 2 ml de 11 U/ml de dispasa II (concentración final de 1,2 U/ml) y 100 μl de 1,0 M de CaCl₂ (concentración final de 5 mM).
2. Prepare 500 mL de medio de fibroblastos primarios (DMEM completo) mezclando 440 mL de DMEM con 50 mL de FBS (10%), 5.0 mL de pluma/estreptococo (100 U/mL y 100 μg/mL, respectivamente) y 5.0 mL de suplemento de glutamina (2 mM). Filtrar-esterilizar el medio con un filtro de vacío de 0,22 μm de tamaño de poro.
3. Preparar suero libre de exosomas mediante ultracentrifugación nocturna de FBS en tubos de polipropileno de 38,5 ml a 100.000 x g a 4 °C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
4. Prepare 500 ml de medio libre de exosomas mezclando 440 ml de DMEM con 50 ml de suero libre de exosomas (10%), 5 ml de pluma/estreptococo (100 U/ml y 100 μg/ml) y 5 ml de suplemento de glutamina (2 mM). Filtrar-esterilizar el medio con un filtro de vacío de 0,22 μm de tamaño de poro.
5. Preparar 0,5 M de Tris-HCl (pH 7,4) disolviendo 6,057 g de Tris base en 90 mL de dH 2 O y ajustando elpH a 7,4 con HCl. Ajustar el volumen a 100 mL con dH₂O.
6. Preparar 10 mM de solución de Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM de Mg(Ac)2 (solución de trabajo de sacarosa) mezclando 97,9 mL de_dH2Ocon 2 mL de Tris-HCl 0,5 M (pH = 7,4) y 100 μL de 1 M de Mg(Ac)₂. Agregue inhibidores de la proteasa a la solución justo antes de usarla y manténgala en hielo.
7. Prepare soluciones de gradiente de densidad de sacarosa en hielo de acuerdo con la Tabla 1. Estas soluciones son suficientes para preparar dos tubos de gradiente de sacarosa.
8. Prepare 100% TCA agregando 40 ml de dH₂O a 100 g de TCA en polvo y mezcle hasta que se disuelva por completo. Ajuste el volumen final con dH₂O a 100 mL.
9. Prepare etanol al 80% mezclando 20 mL de dH₂O con 80 mL de etanol al 100%.
10. Prepare el tampón de Western blot mezclando 1,8 L de dH₂O con 200 ml de tampón de funcionamiento 10x.
11. Prepare el tampón de transferencia Western blot mezclando 1,4 L de dH₂O con 200 ml de tampón de transferencia 10x y 400 ml de metanol. Enfríe previamente el tampón de transferencia a 4 °C.
12. Preparar 20x solución salina tamponada con Tris (TBS) disolviendo 122 g de Tris base y 180 g de cloruro de sodio en 850 mL de_dH2O (pH 8,0). Ajuste el volumen a 1 L con dH₂O.
13. Prepare el tampón de bloqueo disolviendo 5 g de leche en polvo descremada con 1 ml de Tween-20 al 10%, 5 ml de 20x TBS y 94 ml de_dH2O.
14. Prepare el tampón de anticuerpos disolviendo 3 g de BSA con 1 ml de Tween-20 al 10 %, 5 ml de TBS 20x y 94 ml de_dH2O.
15. Prepare el tampón de lavado mezclando 100 ml de 20x TBS y 20 ml de Tween-20 al 10% (10x) con 1,88 L de_dH2O.
16. Prepare la solución de revelado mezclando 1 volumen de luminol/enhance con 1 volumen de tampón de peróxido estable.

2. Disección del músculo gastrocnemio (GA) del ratón^15,16

1. Prepare tubos de 50 ml que contengan 10 ml de PBS en hielo.
2. Sacrificar a los ratones en una cámara de CO₂ seguida de una luxación cervical.
3. Retire el músculo gastrocnemio de ambas piernas y transfiéralas a la sonda con PBS en hielo.
   NOTA: Retire el músculo sóleo del músculo GA antes de transferir el músculo GA al PBS.

3. Aislamiento y cultivo primario de fibroblastos de ratón

1. Pesar los músculos y transferirlos a un plato de 10 cm debajo de una capucha de bioseguridad. Pica los músculos con bisturíes hasta que se convierta en una pasta fina.
2. Transfiera la pasta muscular finamente picada a un tubo de 50 ml y agregue 3,5 veces el volumen/mg de tejido de la solución de digestión al tubo e incube durante 45 minutos a 37 ° C. Mezcle bien la suspensión con una pipeta de 5 ml cada 10 minutos (esto ayudará a la disociación completa).
   NOTA: Alternativamente, se puede usar un disociador de tejidos para este paso.
3. Añadir 20 ml de DMEM completo a la suspensión celular para inactivar la solución de digestión. Transfiera a un filtro de células de nailon de 70 μm colocado en un tubo de 50 ml. Recoja el flujo y lave el filtro de células con 5 ml adicionales de DMEM completo.
4. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g a temperatura ambiente (RT) durante 10 min y retirar con cuidado el sobrenadante.
5. Vuelva a suspender el gránulo en 10 ml de DMEM completo y siembre las células en un plato de 10 cm.
6. Cultivar las células a 37 °C, 5% CO 2, 3% O₂ (paso 0 o P0).
   NOTA: 1) Estos cultivos deben mantenerse a un nivel bajo de oxígeno para garantizar condiciones similares a las fisiológicas (el nivel de_O2 en el músculo esquelético es de alrededor del 2,5%)¹⁷. 2) El número de paso (por ejemplo, P0) de un cultivo celular es un registro del número de veces que el cultivo ha sido subcultivado. 3) Los fibroblastos primarios en P0 se cultivan rutinariamente hasta el 100% de confluencia más 1 día (y solo para P0). Esto es para purgar otros tipos de células y asegurar que las células presentes en el cultivo sean solo fibroblastos, sin células miogénicas según el examen microscópico. El músculo esquelético de un animal adulto a los 2 meses de edad contiene aproximadamente un 2% de progenitores miogénicos⁴. Además, los progenitores miogénicos generalmente no se adhieren a las placas sin recubrimiento; por lo tanto, se pierden durante el subcultivo^18,19,20. Las células miogénicas requieren un medio diferente (F10) suplementado con un 20% de FBS y factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF)¹⁸. En el DMEM completo, los fibroblastos medianos tienen una tasa de proliferación más alta que las células miogénicas, lo que resulta en la eliminación de estas células contaminantes antes del primer paso.
7. Enjuague las células P0 con PBS cuando estén al 100% confluentes más 1 día. Añadir 1 mL de solución de tripsinización e incubar a 37 °C, 5% CO 2, 3% O₂ para separar las células. Detenga la actividad enzimática utilizando 10 ml de DMEM completo.
8. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a RT y resuspender el pellet en 20 mL de DMEM completo y sembrar en una placa de 15 cm (pasaje 1 o P1). Las células crecen hasta una confluencia del 80%-90% y pueden expandirse hasta el pasaje 3.
   NOTA: Dependiendo de los experimentos posteriores, se pueden utilizar el pasaje 1, el pasaje 2 (P2) o el pasaje 3 (P3).

4. Siembra de células y recolección de medio acondicionado

1. Lavar los fibroblastos (P1, P2 o P3) con 10 mL de PBS, añadir 2,5 mL de solución de tripsinización a las células e incubar a 37 °C, 5% CO 2, 3% O₂. Detenga la actividad enzimática mediante el uso de 10 ml de DMEM completo.
   NOTA: Después del pasaje 4, las células primarias se descartan y no deben usarse para más experimentos, ya que cambian de características.
2. Recoger las células y centrifugar a 300 x g a RT durante 10 min.
3. Resuspendió el gránulo celular en 10 mL de medio libre de exosomas y contó las células.
4. Siembre las células a 1,5-2,0 x 10⁶ células por plato (15 cm) e incube a 37 °C, 5% CO 2, 3% O₂.
5. Recoja el medio acondicionado entre 16 y 24 h en tubos de 50 ml sobre hielo.
   NOTA: Si las células no son confluentes en un 80%, se puede agregar nuevamente medio libre exosomal fresco y recolectar después de un período adicional de 16 a 24 h. Las dos colecciones se pueden combinar para su posterior procesamiento.

5. Purificación de exosomas mediante diferencial y ultracentrifugación

NOTA: Todos los pasos se realizan a 4 °C o con hielo. Equilibre el tubo con un tubo lleno de agua cuando sea necesario.

1. Centrifugar el medio acondicionado a 300 x g durante 10 min para eliminar las células vivas y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mL.
2. Eliminar las células muertas por centrifugación a 2.000 x g durante 10 min y transferir el sobrenadante a un tubo de polipropileno de 38,5 mL.
3. Centrifugar el sobrenadante a 10.000 x g durante 30 min para la eliminación de orgánulos, cuerpos apoptóticos y fragmentos de membrana. Transfiera el sobrenadante a un tubo ultra claro de 38,5 ml.
4. Ultracentrifugar el sobrenadante a 100.000 x g durante 1,5 h para granular los exosomas.
5. Deseche cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente 1 ml de medio acondicionado, y lave el gránulo de exosomas en un volumen total de 30 ml de PBS helado.
6. Centrifugar a 100.000 x g durante 1,5 h y desechar cuidadosamente el sobrenadante pipeteando, teniendo cuidado de no alterar el gránulo exosomal.
7. Vuelva a suspender el gránulo en PBS helado (~25 μL por plato de 15 cm) y mida la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA y un lector de microplacas a 562 nm.
   NOTA: La concentración de proteína se mide mediante una dilución 1:2 con Triton-X100 al 0,1% en_dH2O. El rendimiento de exosomas de una placa de 15 cm (20 mL de medio acondicionado) de fibroblastos primarios al 80% de confluencia es de ~3-4 μg.

6. Caracterización de exosomas por gradiente de densidad de sacarosa

1. Cargue el gradiente de sacarosa en un tubo ultraclaro de 13 ml pipeteando (de abajo hacia arriba) lo siguiente: 1,5 ml de soluciones de sacarosa de 2,0 M, 2,5 ml de 1,3 m, 2,5 ml de 1,16 m, 2,0 ml de 0,8 m y 2,0 ml de soluciones de sacarosa de 0,5 M.
2. Mezclar 30-100 μg de exosomas con una solución de sacarosa 0,25 M y ajustar el volumen a 1 mL.
3. Cargue cuidadosamente los exosomas en la parte superior de los gradientes y ultracentrifugar las muestras durante 2,5 h a 100.000 x g y 4 °C.
4. Retire los tubos de la ultracentrífuga y colóquelos en hielo y recoja fracciones de 1,0 ml a partir de la parte superior del gradiente. Transfiéralos a tubos de 1,7 ml en hielo.
5. Agregue 110 μL de TCA al 100% a cada tubo, mezcle bien e incube durante 10 minutos a RT.
6. Centrifugar durante 10 min a 10.000 x g y RT y desechar con cuidado el sobrenadante.
7. Vuelva a suspender el gránulo en 500 μL de etanol al 80% preenfriado y deje lavar las muestras durante 10 min a -20 °C.
8. Centrifugar durante 10 min a 10.000 x g y 4 °C y desechar el sobrenadante.
9. Seque el gránulo durante 10-15 minutos a RT y vuelva a suspender el gránulo en PBS para experimentos in vitro. Mida la concentración de proteínas con el kit de ensayo de proteínas BCA o vuelva a suspender el gránulo directamente en 14,5 μl de dH₂O, 5 μl de tampón Laemmli 4x y 0,5 μl de DTT 1 M para análisis de Western blot.

7. Detección de exosomas mediante análisis de Western blot

1. Mezcle de 5 a 10 μg de exosomas del paso 5.7 con 5 μl de tampón Laemmli 4x y 0,5 μl de DTT de 1 M y, a continuación, ajuste el volumen final a 20 μl con dH₂O. Caliente todas las muestras, incluidas las del paso 6.9, durante 5 min a 98 °C.
2. Cargue las muestras en un gel sin manchas TGX al 10% y cargue las escaleras de proteínas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
   NOTA: Elija el porcentaje del gel según el peso molecular de la proteína de interés.
3. Ejecute el gel a 100 V durante ~ 1 h en el tampón de funcionamiento hasta que el tinte de carga esté en el fondo del gel.
   NOTA: El tiempo de funcionamiento puede variar según el equipo utilizado o el tipo y porcentaje de gel.
4. Imagínate el gel. Las imágenes de los geles sin tinción se utilizan como control de carga para inmunoblots.
5. Transferir el gel con una membrana de PVDF durante 1,5 h a 80 V o toda la noche a 30 V a 4 °C.
6. Bloquear las membranas en tampón de bloqueo durante 1 h en RT.
7. Incubar las membranas para anticuerpos específicos (Tabla 2) en tampón de anticuerpos durante la noche a 4 °C con agitación.
8. Lavar las membranas en tampón de lavado e incubar las membranas con los anticuerpos secundarios apropiados (Tabla 2) durante 1 h a RT con agitación.
9. Lave las membranas en un tampón de lavado y obtenga imágenes de las membranas utilizando una solución de revelado y un generador de imágenes basado en cámara. Alternativamente, use una película de rayos X para revelar las membranas.

Resultados

Este protocolo es adecuado para la purificación de exosomas a partir de grandes volúmenes de medio acondicionado de una manera rentable. El procedimiento es altamente reproducible y consistente. La Figura 1 muestra la imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de exosomas purificados del medio de cultivo de fibroblastos primarios de ratón. La Figura 2 muestra el patrón de expresión proteica de los marcadores exosomales canónicos y la ausenci...

Discusión

Un paso crítico para el aislamiento exitoso de los exosomas de los medios de cultivo, como se describe en este protocolo, es el establecimiento y mantenimiento adecuados de cultivos primarios de fibroblastos de ratón a partir de músculo esquelético adulto. Estos cultivos deben mantenerse a un nivel bajo de oxígeno para garantizar condiciones similares a las fisiológicas (el nivel de O₂ en el músculo esquelético es de ~2,5%)¹⁵. Los fibroblastos primarios cambiarán de caracterís...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dishes	Midwest Scientific, TPP	TP93100
15 cm dishes	Midwest Scientific	TP93150
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific, Pierce	23225
Bovine serum albumin Fraction V	Roche	10735094001
CaCl2	Sigma	C1016-100G
Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11	Eppendorf	022620659/5427754008
Chemidoc MP imaging system	BioRad	12003154
Collagenase P	Sigma, Roche	11 213 857 001	100 mg
cOmplete protease inhibitor cocktail	Millipore/Sigma, Roche	11697498001
Criterion Blotter with plate electrodes	BioRad	1704070
Criterion TGX stain-free protein gel	BioRad	5678034	10% 18-well, midi-gel
Criterion vertical electrophoresis cell (midi)	BioRad	NC0165100
Dispase II	Sigma, Roche	04 942 078 001	neutral protease, grade II
Dithiothreitol	Sigma/Millipore, Roche	10708984001
Dulbecco’s Modification Eagles Medium	Corning	15-013-CV
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
Ethanol 200 proof	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes	Corning	352070
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-028
Fluostar Omega multi-mode microplate reader	BMG Labtech
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144S-500
Immobilon-P Transfer membranes	Millipore	IPVH00010
Laemmli sample buffer (4x)	BioRad	1610747
Magnesium acetate solution	Sigma	63052-100ml
Non-fat dry milk	LabScientific	M-0842
O2/CO2 incubator	Sanyo	MC0-18M
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122	10,000 U/ml
Premium microcentrifuge tubes	Fisher Scientific, Midwest Scientific	AVSC1510	1.7 mL
Protected disposable scalpels	Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker	372610
Running buffer	BioRad	1610732
Sodium Chloride	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S271-3
Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system	Millipore	S2GPU05RE	500 mL
Sterile cell strainer (70 mm)	Fisher Scientific, Fisher brand	22-363-548
Sucrose	Fisher Scientific, Fisher Chemical	S5-500
SuperSignal west Femto	Thermo Fisher Scientific	34096
Thin wall Polypropylene tubes	Beckman Coulter	326823
Transfer buffer	BioRad	16110734
Trichloroacetic Acid	Sigma	91228-100G
Tris base	BioRad	1610719
Triton-X100 solution	Sigma	93443-100mL
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific, Gibco	12604-013	No phenol red
Tween-20	BioRad	#1610781
Ultra-centrifuge Optima XPM	Beckman Coulter	A99842
Ultra-clear tube (14x89 mm)	Beckman Coulter	344059
Ultra-clear tubes (25x89 mm)	Beckman Coulter	344058
Water bath Isotemp 220	Fisher Scientific	FS220