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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la obtención de imágenes y la medición de la reactividad cerebrovascular en humanos con espectroscopia funcional de infrarrojo cercano (fNIRS). fNIRS es una nueva modalidad de imagen que captura los cambios en la concentración de las especies de hemoglobina en la corteza más externa del cerebro bajo estímulos específicos.

Resumen

La reactividad cerebrovascular (RCV) es la capacidad de los vasos sanguíneos del cerebro para alterar el flujo sanguíneo cerebral (ya sea con dilatación o constricción) en respuesta a estímulos químicos o físicos. La cantidad de reactividad en la microvasculatura cerebral depende de la integridad de la vasculatura capacitiva y es la función principal de las células endoteliales. La RCV es, por lo tanto, un indicador de la fisiología y la salud general de la microvasculatura. Los métodos de diagnóstico por imágenes que pueden medir el RCV están disponibles, pero pueden ser costosos y requieren centros de resonancia magnética y experiencia técnica. En este estudio, utilizamos la tecnología fNIRS para monitorizar los cambios de oxihemoglobina (HbO) y desoxihemoglobina (HbR) en la microvasculatura cerebral para evaluar el RCV de 15 controles sanos (HC) en respuesta a un estímulo vasoactivo (dióxido de carbono inhalado al 5% o CO2). Nuestros resultados sugieren que se trata de una tecnología de imagen prometedora que ofrece un método no invasivo, preciso, portátil y rentable para mapear la RCV cortical y la función de microvasculatura asociada, como resultado de una lesión cerebral traumática u otras afecciones asociadas con la microvasculopatía cerebral.

Introducción

La salud vascular en la corteza cerebral se puede medir a través de la capacidad de los vasos para contraerse o dilatarse en diferentes condiciones fisiológicas. La medición de la reactividad vascular puede ser útil en el diagnóstico y tratamiento de afecciones neurológicas asociadas a la disfunción microvascular cerebral, como la demencia, el traumatismo craneoencefálico (TCE) e incluso el envejecimiento 1,2,3,4. Además, el CVR puede utilizarse como biomarcador predictivo y/o farmacodinámico de trastornos neurológicos como el Alzheimer5 o el TCE 6,7,8,9,10. Existen métodos de imagen bien establecidos para estudiar la RCV en sujetos humanos y animales. Un método típico incluye imágenes de resonancia magnética funcional (fMRI) junto con un estímulo exógeno o endógeno, como hipercapnia11, contención de la respiración o acetazolamida2. Lu et al.12,13 demostraron que un simple sistema de suministro de gas junto con imágenes de resonancia magnética dependiente del nivel de oxígeno en sangre (MRI-BOLD) genera mapas precisos de RCV de todo el cerebro.

Las interrupciones en el flujo sanguíneo, el volumen y la tasa metabólica de oxígeno de la vasculatura cerebral producen cambios en las concentraciones tisulares de HbO y HbR. La absorción tisular de luz en el rango del infrarrojo cercano es sensible a los cambios en la concentración de especies de hemoglobina, como HbO y HbR. Por lo tanto, la medición de la luz retrodispersada a lo largo del tiempo puede cuantificar los cambios en la concentración de HbO y HbR en la corteza más externa (aproximadamente 2 cm)15, y puede utilizarse para evaluar las variaciones hemodinámicastemporales16 , incluida la reactividad cerebrovascular (RCV)17.

En nuestro paradigma de investigación, empleamos el instrumento fNIRS con función de onda continua. El dispositivo se compone de 4 fuentes y 10 detectores, que crean 16 pares fuente-detector (ver Figura 1). Los pares de fuente-detector se moldean juntos en una correa de silicona que se puede colocar fácilmente sobre la frente y mantener en su lugar con una envoltura autoadhesiva. El dispositivo mide la intensidad de la luz a 730 y 850 nm y tiene una frecuencia de adquisición de 2 Hz. Se seleccionó este sistema porque es fácil de usar para el paciente y recopila datos de la corteza prefrontal, una región del cerebro particularmente vulnerable a las lesiones cerebrales traumáticas. Afortunadamente, la mayoría de los otros sistemas fNIRS son compatibles con nuestra técnica de adquisición de CVR, diferenciándose solo en las regiones corticales medidas en función del área cerebral de interés.

Si bien la resonancia magnética funcional se considera el estándar de oro para las imágenes cerebrales funcionales, la tecnología fNIRS tiene ventajas únicas para evaluar la RCV en comparación con la resonancia magnética funcional. La técnica de imagen fNIRS proporciona una alta resolución temporal (con una granularidad de milisegundos) y puede cuantificar cambios tanto en la concentración de HbO como en la de HbR, mientras que la fMRI solo mide los cambios en HbR 18,19,20. Además, los instrumentos fNIRS son portátiles, económicos y más fáciles de operar que la fMRI. Por último, la tecnología fNIRS resuelve mejor el movimiento del sujeto, lo cual es necesario dado que los desafíos vasculares como la hipercapnia se utilizan a menudo en combinación con tareas de estudio cognitivas o físicas21.

En este artículo, se presenta un desafío de hipercapnia, combinado con la tecnología fNIRS. Medimos los valores de RCV y estudiamos la reproducibilidad de este método, con la esperanza de ofrecer una alternativa fiable a las medidas de RCV por resonancia magnética funcional.

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Protocolo

Los participantes fueron reclutados bajo un protocolo aprobado por la junta de revisión institucional (ClinicalTrials.gov NCT01789164). Los equipos descritos en el protocolo están aprobados éticamente por nuestra institución.

1. Preparar los materiales utilizados para el Reto de la Hipercapnia (Figura 2)

  1. Infle una bolsa Douglas de 200 L (Artículo # 1) con un recipiente premezclado de gas de grado médico que se compone de 5% de dióxido de carbono, 21% de oxígeno y 74% de nitrógeno hasta que se llene.
  2. Inserte dos diafragmas (Artículo # 3) en la válvula de dos vías sin reinhalación (Artículo # 4) para garantizar que el gas solo fluya en una dirección. Conecte un puerto de la válvula de tres vías (Artículo # 2) a la bolsa Douglas (Artículo # 1) a través del tubo de suministro de gas (Artículo # 5), y el otro puerto a la válvula de no reinhalación de dos vías (Artículo # 4) a través de un segundo tubo de suministro de gas (Artículo # 5).
  3. Fije la boquilla (Artículo # 6) al conector (Artículo # 7) y luego sujete el conector a la válvula de no reinhalación de dos vías (Artículo # 4).
  4. Inserte el tubo del capnógrafo (Artículo # 8) en el orificio del conector (Artículo # 7).
  5. Conecte el filtro de aire (Artículo # 9) al tubo del capnógrafo (Artículo # 8).
  6. Atornille el extremo del filtro de aire de plástico (Artículo # 9) que no está conectado al tubo del capnógrafo (Artículo # 8) en el monitor de CO2 (Artículo # 10).
  7. Conecte el capnograh (Artículo # 10) a una computadora portátil con un cable. Abra el software del lector de puertos de datos, seleccione el puerto USB correspondiente e inicie la lectura de datos. Encienda el capnógrafo. Los datos se mostrarán automáticamente en la pantalla de la computadora.
  8. Conecte la caja fNIRS a la computadora con un cable USB. Conecte la diadema detectora de fuente a la caja FNIRS. Conecte el adaptador de corriente a la caja fNIRS y encienda el interruptor.

2. Procedimientos durante el experimento

  1. Pida al participante que se siente en una silla y que se ponga cómodo mientras configura los dispositivos. Encienda el sistema fNIRS.
  2. Coloque la diadema detectora de fuentes en la frente del paciente, sobre las áreas de la corteza prefrontal subyacente (áreas corticales dorsal y frontal inferior)21.
  3. Compruebe que la diadema del detector de fuentes esté cuidadosamente colocada por encima de la ceja y en el centro de la frente. Coloque la fila inferior del detector aproximadamente a 3,5 cm por encima del nasion o puente de la nariz donde la hendidura de la nariz superior se encuentra con la frente entre los ojos.
  4. Asegúrese de que los detectores estén firmemente adheridos a la piel del participante sin que interfieran cromóforos (por ejemplo, maquillaje) o cabello. No se necesita preparación de la piel.
  5. En "Configuración del dispositivo", ajuste la ganancia de los detectores entre 1 y 20. Una ganancia más alta aumentará la sensibilidad de los detectores de luz. El valor predeterminado es 20. Ajuste la "Corriente del LED" entre 5 mA y 20 mA. Los valores más altos darán como resultado una luz más brillante y aumentarán el nivel de señal generado por los detectores. El valor predeterminado es 20 mA.
  6. En el software de adquisición, presione "Iniciar experimento actual". Las fuentes enviarán luz a 2 longitudes de onda y la intensidad de la señal de luz detectada por cada detector se mostrará en tiempo real. En caso de señal saturada (señal >4.000) o baja (señal <1.000), ajuste el contacto entre la banda de cabeza del detector de fuente y la piel o los parámetros de los pasos 2.3 y 2.4. El procedimiento completo exacto ha sido explicado en Ayaz et al.22.
  7. Indique al participante que inhale y exhale por la boca a su ritmo respiratorio normal. Coloque una pinza nasal en la nariz del participante y recuérdele que continúe respirando normalmente por la boca, y que alerte a alguien si siente alguna molestia o tiene alguna dificultad para respirar.
  8. Inserte con cuidado la boquilla (ítem # 6) en la boca del participante para que pueda continuar respirando. Para aumentar la comodidad del participante durante el procedimiento, pídale al participante que apoye la válvula sin reinhalación (Ítem # 3) con la mano.
  9. Presione el botón "Baseline" en el software asociado. Medirá y registrará automáticamente la señal de luz para la línea de base fNIRS durante 20 segundos (s).
  10. Presione "Grabar" antes de comenzar el experimento.
  11. Al comienzo del experimento, encienda el reloj, presione "Marcador manual" y escriba en un papel la hora mostrada por el capnógrafo. Cada minuto, gire la válvula conectada a la tubería de gas para alternar entre el aire de la habitación y el aire de la habitación mezclado con 5% de CO2. De nuevo, presione "Marcador manual" y escriba en un papel el tiempo mostrado por el capnógrafo cada vez que se cambia la mezcla de gas inhalado (Figura 3).
    NOTA: Marcar manualmente el tiempo que se muestra en el capnógrafo es esencial para la sincronización futura entre las señales ópticas fNIRS y el rastreo EtCO2 del capnógrafo.
  12. Después de 7 minutos, detenga la grabación fNIRS haciendo clic en el botón "Detener". Permita 60 segundos adicionales de registro para el CO2 al final de la espiración (EtCO2) y guarde los datos de EtCO2 como ASCII dentro del software del lector de datos.
  13. Notificar al participante que el trámite se ha completado. Retire con cuidado la pinza nasal y retire la boquilla. Ofrezca un pañuelo de papel al participante para que absorba la saliva acumulada durante el procedimiento.

3. Procedimientos de limpieza

  1. Deseche el tubo del capnógrafo (Artículo # 8), el filtro (Artículo # 9), la boquilla (Artículo # 6) y la pinza nasal.
  2. Limpie el equipo reutilizable. Separe la válvula de dos vías (Artículo # 4) del tubo de suministro de gas (Artículo # 5) y el tubo conector (Artículo # 7) y extraiga los diafragmas (Artículo # 3). Sumerja los diafragmas (Artículo # 3), el tubo conector y la válvula de dos vías (Artículo # 4) en un recipiente lleno de un desinfectante detergente de grado médico que no contenga fosfatos y surfactantes durante 20 minutos. Diluir el detergente con agua destilada en una proporción de 1:64.
  3. Lave los artículos # 1,4,7 con agua destilada y luego colóquelos encima de un mostrador limpio con un material estéril como una almohadilla chux debajo. Deje que se sequen al aire antes de volver a utilizarlos.
  4. Vacíe la bolsa Douglas.

4. Análisis de datos

  1. Procesamiento de señales mediante el software de procesamiento de datos fNIRS
    NOTA: El procesamiento de la señal es el primer paso del análisis de datos. Se realiza utilizando un software de procesamiento de datos fNIRS (por ejemplo, fNIRSoft) para eliminar el ruido o los artefactos en los datos debido al movimiento del paciente. Solo se necesitan los datos del software de adquisición para este análisis.
    1. En el software de procesamiento de datos, haga clic en "Cargar archivo" para seleccionar y luego cargar los datos fNIRS adquiridos.
    2. Haga clic en "Refinar" y aparecerá una ventana emergente. Seleccione "Datos sin procesar" y presione "Siguiente".
      1. Haga clic en las herramientas de filtrado de mediana y rechazo de artefactos de movimiento de ventana deslizante (SMAR)23 para reconocer y eliminar tanto el artefacto de movimiento como los canales saturados de la señal sin procesar. Presione "Aplicar".
      2. Haga clic en el filtro "Frecuencia de paso bajo" para descartar el componente de pulso y respiración (filtro de Hanning, n = 20, corte = 0,1 Hz)21,24,25,26. Presione "Aplicar".
      3. Haga clic en "Detrend" para eliminar la variación temporal lenta. Presione "Aplicar".
    3. Haga clic en "OXI" para transformar la intensidad de la luz en concentraciones de HbO y HbR. Haga clic en "Guardar" y luego seleccione MATLAB como formato de archivo de guardado.
  2. Procesamiento de señales con MATLAB
    NOTA: La segunda parte del análisis se realiza utilizando MATLAB para correlacionar la señal fNIRS con el EtCO2 desplazado en el tiempo. Para el procesamiento de los datos se necesitan los datos del paso anterior (4.1.5) y los datos del capnógrafo (traza EtCO2 , paso 2.12).
    1. Importe el seguimiento de EtCO2 desde el capnógrafo en MATLAB como dos columnas (una para el tiempo y la segunda para los valores de EtCO2 ). Cambie el tiempo EtCO2 con el tiempo precalibrado para corregir el retraso del tiempo del tubo de muestreo.
      NOTA: Esta es la diferencia de tiempo entre una respiración en la boquilla y la aparición de esa respiración en la grabación de CO2 . En esta configuración, fue de 15 s.
    2. Utilice el primer punto de tiempo registrado desde el capnógrafo al comienzo del experimento, paso 2.11 como punto de partida (t = 0). Convierte el EtCO2 en segundos.
    3. Importe los datos de oxihemoglobina y desoxihemoglobina del paso 4.1.3 a MATLAB.
    4. Calcule el retraso fisiológico entre EtCO2 (medido en la boca) y la señal fNIRS (medida en el cerebro) encontrando el coeficiente de correlación más alto entre estas dos señales en diferentes cambios de tiempo. (consulte el script de MATLAB adjunto para los pasos 4.2.3 a 4.2.6). El cambio de tiempo con el coeficiente de correlación más alto se considera el momento óptimo.
    5. Cambie el curso del tiempo EtCO2 por el tiempo óptimo (obtenido en el paso 4.2.4). Mantenga los puntos de tiempo que tienen datos fNIRS y EtCO2 . Las dos series temporales deben tener la misma longitud.
    6. Calcule los valores de CVR para cada canal, que es la solución de la ecuación lineal entre HbO (o HbR) y EtCO2 utilizando la descomposición de Cholesky en MATLAB.

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Resultados

fNIRS se realizó con desafío de hipercapnia en 15 participantes sanos. Los criterios de exclusión fueron: antecedentes de TCE, trastornos neurológicos o psiquiátricos incapacitantes preexistentes o embarazo. Los participantes tenían una edad media de 37,7 ± 16 años (rango 20-55) y el 20% eran mujeres. Como se muestra en un estudio similar de resonancia magnética funcional28, una inhalación de 5% de CO2 durante 60 s se acompañó de un aumento ...

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Discusión

Pudimos medir la RCV utilizando fNIRS y una técnica de inhalación de gas CO2 en 15 voluntarios sanos. El valor de CVR medido es la correlación entre la señal fNIRS adquirida y el EtCO2. El reto consiste en alinear con precisión la traza temporal de EtCO2 con la señal fNIRS, es decir, tener en cuenta el tiempo que tarda la sangre en viajar desde el sistema vascular pulmonar hasta el corazón y luego hasta la vasculatura cerebral. La variabilidad inte...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

El trabajo en el laboratorio de los autores contó con el apoyo del Centro de Neurociencia y Medicina Regenerativa (CNRM), la Universidad de Servicios Uniformados de Ciencias de la Salud (USUHS), Bethesda, MD, el Centro de Excelencia en Neurociencia Clínica Militar (MCNCoE), Departamento de Neurología, USUHS, y por el Programa de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud. Las opiniones expresadas en este artículo son las del autor y no reflejan la política oficial del Departamento del Ejército/Marina/Fuerza Aérea, el Departamento de Defensa o el Gobierno de los Estados Unidos.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Blue cuff22254Vacumed
CO2-Air Gas Mixture Size 200R012000 2003Roberts Oxygen
Diaphragm (Size: medium, Type: spiral)602021-2608Hans Rudolph
Douglas bag (200-liters capacity)500942Harvard Apparatus
Gas delivery Tube1011-108Vacumed
Gas sampling TubeT4305QoSINA
Hydrophobic filter9906-00Philips Medical Systems
Male luer11547QoSINA
Mouth piece (Silicone, Model #9061)602076Hans Rudolph
Nose clip (Plastic foam, Model #9014)201413Hans Rudolph
Three-way valve (100% plastic)CR1207Hans Rudolph
Two-way non-breathing valve (22mm/ 15mm ID)CR1480Hans Rudolph

Referencias

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  2. Kassner, A., Roberts, T. P. Beyond perfusion: cerebral vascular reactivity and assessment of microvascular permeability. Topics in Magnetic Resonance Imaging. 15, 58-65 (2004).
  3. Oertel, M., et al. Posttraumatic vasospasm: the epidemiology, severity, and time course of an underestimated phenomenon: a prospective study performed in 299 patients. Journal of Neurosurgery. 103, 812-824 (2005).
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