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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Muchas bacterias utilizan la motilidad provocada por flagelos para navegar por su entorno y colonizar entornos favorables tanto individualmente como colectivamente. Aquí se demuestra el uso de tres métodos establecidos que explotan la motilidad como una herramienta de selección para identificar componentes / vías que contribuyen a la natación y la motilidad de enjambre.

Resumen

La motilidad es crucial para la supervivencia y el éxito de muchas especies bacterianas. Existen muchas metodologías para explotar la motilidad para comprender las vías de señalización, para dilucidar la función y el ensamblaje de las partes flagelares, y para examinar y comprender los patrones de movimiento. Aquí demostramos una combinación de tres de estas metodologías. La motilidad en el agar blando es la más antigua, ofreciendo una fuerte selección para aislar las mutaciones supresoras de ganancia de función en cepas con problemas de motilidad, donde la motilidad se restaura a través de una segunda mutación. La técnica de atado celular, empleada por primera vez para demostrar la naturaleza rotatoria del motor flagelar, se puede utilizar para evaluar el impacto de los efectores de señalización en la velocidad del motor y su capacidad para cambiar la dirección de rotación. El ensayo de "cruce de fronteras" es más reciente, donde las bacterias nadadoras se pueden preparar para la transición a moverse colectivamente como un enjambre. En combinación, estos protocolos representan un enfoque sistemático y poderoso para identificar los componentes de la maquinaria de motilidad, y para caracterizar su papel en diferentes facetas de la natación y el enjambre. Se pueden adaptar fácilmente para estudiar la motilidad en otras especies bacterianas.

Introducción

Las bacterias emplean muchos apéndices para el movimiento y la dispersión en sus nichos ecológicos1. La motilidad impulsada por flagelos es la más rápida de ellas, promoviendo la colonización de localizaciones favorables en respuesta a las señales ambientales, y contribuyendo significativamente a la capacidad patógena de algunas especies2,3. Las bacterias flageladas pueden nadar individualmente en líquido a granel, o enjambre como un colectivo sobre una superficie semisó sólida4. Los flagelos extracelulares se unen y son accionados por motores rotativos incrustados en la membrana, que aprovechan la potencia de los gradientes iónicos para generar un par que provocala rotación 1,2,4,5,6,7,8. En E. coli,cuyos motores funcionan a un par constantede 9,la salida del motor se puede clasificar en términos de velocidad de rotación y conmutación del rotor entre las direcciones en sentido contrario a las agujas del reloj (CCW) y en el sentido de las agujas del reloj (CW). La rotación CCW promueve la formación de un haz flagelar coherente que impulsa la célula hacia adelante (run), mientras que un interruptor transitorio en dirección rotacional (CW) hace que el haz se desmonte parcial o totalmente10,y la célula reoriente su dirección de natación (caída). E. coli típicamente corre por un segundo y cae por una décima de segundo. La frecuencia de conmutación del rotor o 'sesgo de caída' es controlada por el sistema de señalización quimiotaxis, en el que los quimiorreceptores transmembrana detectan señales químicas externas y las transmiten a través de fosforelay al motor flagelar para extender las corridas en respuesta a los atrayentes, o suprimirlas en respuesta a productos químicos tóxicos11,12. La motilidad de natación se ensaya en agar blando al 0,3%.

Durante el enjambre, las bacterias navegan en una superficie semisólida como un colectivo denso, donde los paquetes de bacterias fluyen en un movimiento continuo de remolino2,13,14,15. Los enjambres de E. coli exhiben fisiología quimiosensorial alterada (menor sesgo de caída), velocidades más altas y mayor tolerancia a los antimicrobianos sobre las células que nadan en líquido a granel16,17. Los enjambres varían en su despliegue de una gran cantidad de estrategias que ayudan al movimiento, incluyendo la producción de surfactante, hiperflagelación y elongación celular2. El enjambre ofrece a las bacterias una ventaja competitiva tanto en entornos ecológicos como clínicos18,19,20. Hay dos categorías de bacterias de enjambre: enjambres templados, que pueden enjambre sólo en medios solidificados con 0,5-0,8% de agar, y enjambres robustos, que pueden navegar a través de concentraciones de agar más altas21.

Existe una variedad de ensayos para interrogar la motilidad de la natación y su regulación. Cuando se ve afectada por mutaciones o condiciones ambientales, la motilidad en sí misma ofrece una fuerte selección para identificar mutaciones supresoras de ganancia de función. Estos supresores pueden ser revertientes genuinos de la mutación original, o pseudo-revertores, donde una segunda mutación restaura la funcionalidad. Tales mutantes pueden ser identificados por secuenciación del genoma completo (WGS). Una alternativa a la selección imparcial del supresor es una estrategia sesgada de la mutagénesis apuntada (e.g., mutagénesis de la polimerización en cadena). Estas metodologías a menudo arrojan luz sobre la función o la regulación ambiental del aparato de motilidad. Si el objetivo es estudiar la función motora, entonces la restauración de la motilidad de tipo salvaje medida en agar blando puede no indicar necesariamente la restauración de la salida del motor de tipo salvaje. El ensayo de atado celular, en el que las células se unen a una superficie de vidrio por un solo flagelo y la rotación del cuerpo celular se supervisa posteriormente, puede ser el ensayo inicial de elección para evaluar el comportamiento motor. Aunque ahora se dispone de metodologías más sofisticadas para supervisar las propiedades del motor, la configuración requerida de la cámara de alta velocidad y la aplicación de paquetes de software para el análisis de movimiento limitan su uso generalizado22,23,24,25. El ensayo de atado celular requiere solo que los flagelos estén cortados, lo que permite la unión de los filamentos cortos a un portaobjetos de vidrio, seguido de grabar en video la rotación del cuerpo celular. Aunque las velocidades registradas del motor sean bajas en este ensayo debido a la alta carga que el cuerpo celular ejerce sobre el flagelo, este ensayo ha contribuido sin embargo a información valiosa sobre las respuestas quimiotácticas26,27,28,29,y sigue siendo una herramienta de investigación válida como se discute a continuación.

La motilidad del enjambre plantea un conjunto diferente de desafíos a los investigadores. La selección de supresores de ganancia de función sólo funciona en enjambres que producen tensioactivos copiosos y enjambres fácilmente13. Los no productores de surfactantes como E. coli son exigentes con respecto a la elección del agar, la composición de los medios y la humedad del ambiente2,13,14,21. Una vez que se establecen las condiciones de enjambre, el ensayo de cruce de fronteras17 es una metodología útil para interrogar la capacidad de un enjambre para navegar por condiciones nuevas / duras. Aunque los protocolos presentados a continuación se relacionan con E. coli,pueden ser fácilmente adaptados para su aplicación en otras especies.

Protocolo

1. Aislamiento de mutantes supresores en cepas deficientes en motilidad

Nota : utilice este método como un amplio 'catch-all' para identificar la naturaleza general del defecto de motilidad.

  1. Preparación de placas de agar blando
    NOTA: El agar blando, también conocido como motilidad o agar nadador, es un agar de bajo porcentaje (~ 0.2-0.35% p / v), utilizado durante mucho tiempo para ensayar quimiotaxis31,32.
    1. Añadir 3 g de bacto-agar (0,3% p/v) y 20 g de LB a un matraz inferior redondo de 2 L. Añadir 1 L de ddH2O (agua doble destilada) al matraz y mezclar uniformemente la suspensión utilizando una varilla de agitación y una placa de agitación magnética.
    2. Autoclave durante 20 min a 121 °C.
    3. Dejar enfriar con agitación suave usando la varilla / placa como arriba. Cuando la temperatura alcance aproximadamente 50 °C, vierta 25 mL en placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm), y deje que el agar fundido se ajuste con la tapa en su lugar durante al menos 1 h, para su uso dentro de 16 h.
  2. Preparación de cultivo, inoculación y aislamiento de mutantes supresores
    NOTA: E. coli inoculada en el centro de medios ricos en nutrientes solidificados con agar blando consumen nutrientes localmente, creando un gradiente de nutrientes que siguen. A medida que se mueven hacia el exterior, aparecen "anillos" definidos (Figura 1A), que están relacionados con quimioatrayentes específicos a los que responden las bacterias. Los defectos en el sistema de quimiotaxis o los componentes estructurales del motor de flagelos pueden comprometer el rendimiento en este ensayo. A menudo, los mutantes con una ventaja de motilidad surgen durante el cribado, y se pueden ver emergiendo de puntos únicos o múltiples a lo largo de la periferia del anillo, desde donde 'estallan' hacia fuera (Figura 1C). Uno notará que el borde más externo del frente de natación contrasta fácilmente con el agar suave virgen no colonizado.
    1. Cultivar durante la noche cultivos de la cepa deficiente en motilidad deseada en 5 mL de Caldo Lennox (LB; 10 g/L triptona, 5 g/L de extracto de levadura, y 5 g/L de NaCl, Tabla de Materiales)a 30 °C con agitación horizontal (220 r.p.m.). Al día siguiente, sub-cultivo (dilución 1:100) en LB fresco, creciendo en las mismas condiciones a fase exponencial (OD600 de 0,6).
    2. Inocular 6 μL del cultivo en el centro de una placa de agar blando (1.1) usando una pipeta, empujando la punta estéril cargada en el agar para expulsar suavemente el contenido. Transferir a 30 °C e incubar (Figura 1B), hasta que la motilidad 'brotes' son evidentes, emanando del punto de inoculación o de la periferia de los anillos de motilidad, típicamente en 24-36 h (Figura 1C).
      NOTA: En ensayos de motilidad, inocular una cepa de tipo salvaje junto con los aislados mutantes para la comparación. Esta cepa de tipo salvaje mostrará los anillos quimiotácticos concéntricos característicos(Figura 1A)y llenará la placa dentro de 8-10 h.
    3. Use un lazo de alambre estéril para levantar las células de la región de "llamarada" y la raya para purificar colonias individuales en una placa de agar duro LB (LB preparado como el anterior, solidificado con 15 g / L bacto-agar).
    4. Recoger colonias individuales de la placa de raya utilizando un bucle de alambre estéril y volver a purificar por rayas para colonias individuales para asegurar el aislamiento de un aislado de colonia "pura".
  3. Confirmación, y caracterización de mutantes supresores
    1. Confirme que los mutantes supresores aislados han restaurado la motilidad. Preparar placas de agar blando (1.1) y cultivos para cepas de interés (como en 1.2.1), incluyendo el tipo salvaje y la cepa inicial "deficiente en motilidad" para la comparación.
    2. Inocular las placas (como en 1.2.2) e incubar a 30 °C durante 8-10 h.
    3. Registre el diámetro del anillo más externo (borde del círculo) y compare para establecer cuál de los aislados ha restaurado sustancialmente la motilidad.
      NOTA: Se recomienda que las placas sean fotografiadas a lo largo del tiempo-curso del experimento. Para obtener los mejores resultados, utilice un dispositivo de "cubo de luz"30,donde se monta una cámara digital sobre una fuente de luz para una mejor iluminación para medir el diámetro de la colonia de natación y distinguirla del agar no colonizado.
    4. El tema verificó aislantes a WGS según lo requerido, permitiendo suficiente " cobertura de la secuencia" para identificar positivamente las mutaciones que restauraron el salvaje-tipo función.

2. Cuantificación del comportamiento motor de los flagelos a través del atado celular

Nota : utilice este método cuando el comportamiento normal de correr-caída (quimiotaxis) parece estar comprometido.

  1. Preparación del cultivo y esquila de flagelos
    1. Preparar un cultivo de fase exponencial de la cepa de interés como se describe en el paso 1.2.1.
    2. Pellet 10 mL de células por centrifugación a 2.000 x g durante 3 min antes de resuspender en 10 mL de Tampón de Motilidad esterilizado por filtro (MB; tampón de fosfato de potasio de 10 mM [0,0935 M K2HPO4,0,0065 M KH2PO4,pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl).
      NOTA: MB apoya la motilidad, pero no apoya el crecimiento bacteriano
    3. Repetir el paso 2.1.2 dos veces más antes de volver a gastar el pellet final en 1 mL de MB.
    4. Transfiera la suspensión celular a una jeringa de 1 ml y coloque una aguja de 23G al extremo. Monte un aparato idéntico de jeringa/aguja y coloque los dos juntos a través de 6 pulgadas de tubo de polietileno (diámetro interior de 0,58 mm) firmemente envainado sobre cada punta de aguja.
    5. Esquile los flagelos (son frágiles y se rompen fácilmente) pasando suavemente la suspensión celular de un lado a otro de una jeringa a la otra 50x, con 1 min de pausa entre cada 10 pasadas.
    6. Centrifugar las células cizalladas a 2.000 x g durante 3 min y resuspend en un volumen final de 500 μL de MB.
  2. Preparación de diapositivas y atado celular
    1. Prepare una cámara de fijación celular apilando una cubierta de 18 mm x 18 mm sobre una corredera de microscopio de vidrio de 3 pulgadas x 1 pulgada x 1 mm, separada por cinta adhesiva de doble cara (Figura S1).
    2. Enjuague la cámara con solución de poli-lisina al 0,01% (p/v) aplicándola en la parte superior de la cámara. Incline el borde inferior (el cubrebocas al ras con la corredera del microscopio) sobre un limpiaparabrisas de tarea (papel tisú) para ayudar a dibujar la solución a través de la cámara (Figura S1). Luego incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
    3. Lavar la cámara tres veces con 40 μL de MB utilizando como se describe en el paso 2.2.2
    4. Añadir 40 μL de la suspensión de células cizalladas (preparada arriba) en la parte superior de la cámara e incubar a temperatura ambiente durante 10 min para permitir que las células se adhieran al cubrebocas.
    5. Enjuague suavemente la cámara con 40 μL de MB como en 2.2.3 para eliminar las células no unidas.
  3. Registro y cuantificación de la rotación celular
    1. Transfiera el portaobjetos del microscopio cargado con células atados a la etapa del microscopio.
    2. Usando microscopía de contraste de fase y un objetivo de 100x, escanee la población en busca de células que estén fijas en su lugar, y gire en un solo eje, es decir, rotaciones suaves en un punto fijo en lugar de presentarse en un ángulo en el que la célula se mueva dentro y fuera del enfoque (Video 1).
    3. Utilice un microscopio comercial y una cámara asociada. Abra el software asociado, asegúrese de que las celdas de interés estén enfocadas y haga clic en adquisición de video para grabar la rotación de celdas durante un minuto (a 10 cuadros por segundo o más).
    4. A partir de la reproducción de vídeo, cuantifique el número de rotaciones completas por minuto y el número de veces que la celda cambia de dirección (frecuencia de conmutación).
      NOTA: Las velocidades de rotación y la frecuencia de conmutación pueden ser demasiado rápidas para medir a simple vista, por lo que se recomienda utilizar un software de vídeo que ofrezca una reproducción lenta/fina, o que adopte un sistema de software automatizado para cuantificar los patrones de rotación33. Una alternativa sería aumentar la viscosidad del MB usando metilcelulosa (o agente similar) para ayudar a ralentizar y resolver la rotación de bacterias más rápidas o compensar cuando se utilizan cámaras con bajas tasas de fotogramas.
    5. Repita el paso 2.3.2 con réplicas biológicas para compilar una representación de la población de interés.

3. Preparación de enjambres en un ensayo de cruce de fronteras

NOTA: Utilice este método para evaluar el impacto de una mutación o condición en la motilidad del grupo. Enjambre-agar se refiere al agar donde el porcentaje es típicamente más alto que el del agar blando. En el agar blando (0,3 %), las células nadan individualmente dentro del agar. En el agar enjambre (0,5% y más), las células se mueven como un grupo en la superficie. Mientras que las placas de enjambre deben usarse como se detalla aquí, las placas de natación tienen una vida útil más larga y se pueden usar durante varios días. Nuestra preferencia personal es utilizar en 1-2 días.

  1. Preparación del agar enjambre
    1. Añadir 5 g de agar Eiken (0,5% p/v) y 20 g de LB a un matraz inferior redondo de 2 L. Añadir 1 L de ddH2O al matraz y mezclar uniformemente la suspensión utilizando una varilla de agitación y una placa de agitación magnética.
    2. Autoclave durante 20 min a 121 °C.
    3. Deje enfriar con una agitación suave para evitar cualquier burbuja de aire usando la varilla / placa como se indicó anteriormente. Cuando sea aproximadamente 50 °C, añadir glucosa esterilizada por filtro para una concentración final del 0,5 %.
    4. Verter 25 mL en placas de Petri estériles (100 mm x 15 mm) y dejar fijar a temperatura ambiente durante al menos 14 h y no más de 20 h. No almacenar para uso futuro.
  2. Inoculación e incubación de placas de enjambre
    1. Inocular 6 μL de un cultivo exponencial medio (preparado como en 1.2) manchando en la parte superior del agar.
    2. Deje la tapa apagada durante 5-10 minutos y reemplácela cuando el inóculo se haya secado en la superficie del agar.
    3. Incubar a 30 °C durante 8 h. Evite la tentación de inspeccionar el progreso del enjambre quitando la tapa, ya que esto contribuirá al secado del agar y perjudicará el enjambre.
      NOTA: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del fenotipo de la cepa. Algunas mutaciones aisladas pueden dificultar la capacidad de enjambre y requerirán un porcentaje reducido de agar o un período más prolongado de incubación.
  3. Preparación de placas de ensayo para cruzar la frontera
    NOTA: Este ensayo utiliza una placa de Petri modificada, donde una división plástica (borde) crea dos cámaras, en lugar de una(Figura 2A). Cada cámara se puede preparar independientemente de la otra, ofreciendo diferentes condiciones para el enjambre, antes de 'conectar' los dos. Dependiendo del diseño experimental, la primera cámara (designada a la izquierda) se puede preparar con agar de baño (0.3% p/v) o agar de enjambre (0.5% p/v) desde donde las bacterias pueden migrar a través de la frontera hacia la cámara derecha que contiene agar enjambre +/- cualquier suplemento o desafío requerido (por ejemplo, antibióticos). La migración en cualquiera de los agares se mide/compara típicamente registrando el diámetro más ancho de la colonización bacteriana (de borde a borde) desde el punto original de inoculación.
    1. Prepare el agar para nadar como se describe en 1.1 si es necesario.
    2. Preparar el agar enjambre como se describe en 3.1.
    3. Verter ~ 30 mL de agar enjambre (con la suplementación deseada si es necesario) en la cámara derecha de una placa de Petri de doble compartimento (100 mm x 15 mm), hasta el punto en que esté nivelado con el divisor de plástico entre las cámaras, pero no desbordando hacia la izquierda (Figura 2B).
    4. Después de que el agar se haya endurecido, llene la cámara izquierda con ~ 30 mL de agar de baño o enjambre, de nuevo hasta el punto de contacto con la división de plástico (Figura 2C). Antes de que se establezca, utilice una punta de pipeta estéril para arrastrar suavemente el agar sobre el borde para conectar los dos lados con un puente de agar de ~ 1 mm de altura que abarca toda la longitud de la división (Figura 2D).
    5. Dejar secar la placa a temperatura ambiente (3.1).
      NOTA: Un método alternativo de creación de puente es permitir que el agar de la cámara izquierda se seque y luego pipetee lentamente ~ 100 μL de agar enjambre fundido a lo largo del divisor de plástico para unir las dos cámaras (3.4). Inocular las placas en la cámara izquierda como se detalla anteriormente para nadar (1.2.2) o enjambre (3.2) agar, antes de incubar a 30 °C durante 12-16 h, o hasta que los enjambres hayan progresado lo suficiente sobre la cámara derecha para permitir comparaciones entre cepas de interés.

Resultados

El aislamiento de pseudo-revertores en una cepa de E. coli cuya motilidad se ve afectada por altos niveles de la molécula de señalización c-di-GMP, fue detallado en un trabajo reciente de nuestro laboratorio34. Esta cepa (JP1442) albergaba dos mutaciones: ΔyhjH y ΔycgR. YhjH es la fosfodiesterasa más activa que degrada c-di-GMP en E. coli. La ausencia de YhjH conduce a niveles elevados de c-di-GMP y a la inhibición de la motilidad. YcgR es un efector c-di...

Discusión

El aislamiento y caracterización de mutaciones supresoras han contribuido con éxito a identificar componentes clave del sistema de quimiotaxis35,36,37,así como la propia maquinaria motora38,39,40. Durante el uso del Protocolo 1, es importante incluir múltiples réplicas independientes para asegurar el aislamiento de un amplio espect...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la subvención GM118085 de los Institutos Nacionales de Salud y en parte por la Fundación Robert Welch (subvención F-1811 a R.M.H.).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Bacto Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, DihydrateFisher Scientific02-002-786
Eiken agarEiken Chemical Co. JapanE-MJ00Essential for E. coli swarming
Glucose D (+)Fisher Scientific410955000
LB (Lennox) BrothFisher ScientificBP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%)Sigma-AldrichP8920
Potassium chloride (KCl)Fisher Scientific18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6)OlympusOr equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided TapeFisher50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mmFisher12-550-343
Olympus BX53 microscopeOlympusBX53Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter)Fisher ScientificFB0875712For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)Perkin Elmer9908265
Round Petri Dish with 2 CompartmentsVWR89200-944For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G)Fisher Scientific14-826A
Sterile Syringe - 1 mLFisher scientific14-955-450
Task/Tissue wipesFisher scientific06-666Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mmVWR48366205
XM10 cameraOlympusXM10Or equivalent microscope camera

Referencias

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