Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

חיידקים רבים משתמשים בתנועתיות המונעת על ידי פלאגלה כדי לנווט בסביבתם וליישב סביבה נוחה הן בנפרד והן כקולקטיב. הוכח כאן הוא השימוש בשלוש שיטות מבוססות המנצלות תנועתיות ככלי בחירה לזיהוי רכיבים / מסלולים התורמים לשחייה ותנועתיות נחיל.

Abstract

תנועתיות חיונית להישרדותם ולהצלחתם של מינים חיידקיים רבים. מתודולוגיות רבות קיימות כדי לנצל תנועתיות כדי להבין נתיבי איתות, כדי לבהיר את הפונקציה וההרכבה של חלקים flagellar, ולבחון ולהבין דפוסי תנועה. כאן אנו מדגימים שילוב של שלוש מתודולוגיות אלה. תנועתיות בגר רך היא העתיקה ביותר, המציעה מבחר חזק לבידוד מוטציות מדכאות רווח-של-תפקוד בזנים לקויי תנועתיות, שם תנועתיות משוחזרת באמצעות מוטציה שנייה. טכניקת קשירת התא, המשמשת תחילה כדי להדגים את האופי הסיבובי של המנוע flagellar, ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשפעה של משפיעי איתות על מהירות המנוע ואת יכולתה לעבור כיוון סיבובי. בדיקת "מעבר הגבול" היא עדכנית יותר, שבה חיידקי שחייה יכולים להיות מוכנים לעבור לנוע באופן קולקטיבי כנחיל. בשילוב, פרוטוקולים אלה מייצגים גישה שיטתית ועוצמתית לזיהוי רכיבים של מכונות תנועתיות, ולאפיון תפקידם בהיבטים שונים של שחייה ונחילה. הם יכולים להיות מותאמים בקלות כדי ללמוד תנועתיות במינים חיידקיים אחרים.

Introduction

חיידקים מעסיקים נספחים רבים לתנועה ופיזור בנישות האקולוגיות שלהם1. תנועתיות המונעת על ידי פלאגלה היא המהירה שבהן, מקדמת קולוניזציה של אזורים נוחים בתגובה לאותות סביבתיים, ותורמת באופן משמעותי ליכולת הפתוגנית של מינים מסוימים2,3. חיידקים מוכים יכולים לשחות בנפרד בנוזל בתפזורת, או נוהרים כקולקטיב על פני משטח חצי מוצק4. פלאגלה חוץ-תאית מתחברת ומונעת על ידי מנועים סיבוביים המוטמעים בממברנה, אשר רותמים את העוצמה של שיפועי יונים כדי ליצור מומנט שגורם לסיבוב1,2,4,5,6,7,8. ב- E. coli, שהמנועים שלו פועלים על מומנט קבוע9, ניתן לסווג את פלט המנוע במונחים של מהירות סיבובית ומיתוג הרוטור בין כיווני נגד כיוון השעון (CCW) ובכיוון השעון (CW). סיבוב CCW מקדם היווצרות של חבילת flagellar קוהרנטית המניעה את התא קדימה (ריצה), בעוד מתג ארעי בכיוון הסיבוב (CW) גורם לחבילה להתפרק באופן חלקי או מלא10, והתא כדי לכוון מחדש את כיוון השחייה שלו (ליפול). אי קולי בדרך כלל לרוץ לשנייה ליפול במשך עשירית שנייה. תדירות המיתוג של הרוטור או 'הטיית הנפילה' נשלטת על ידי מערכת איתות chemotaxis, שבה chemoreceptors transmembrane לזהות אותות כימיים חיצוניים ולהעביר אותם באמצעות זרחן למנוע flagellar להאריך ריצות בתגובה למשוך, או לדכא אותם בתגובה כימיקלים רעילים11,12. תנועתיות השחייה נמדת ב-0.3% אגר רך.

במהלך ההמולה, חיידקים מנווטים על משטח מוצק למחצה כקולקטיב צפוף, שבו חבילות של חיידקים זורמות בתנועה מסתחררת רציפה2,13,14,15. נחילי E. coli מציגים פיזיולוגיה כימוסנסורית שונה (הטיית טבילה נמוכה יותר), מהירויות גבוהות יותר, וסובלנות גבוהה יותר לאנטי מיקרוביאלים מעל תאים שוחים בנוזל בתפזורת16,17. נחילים משתנים בפריסתם של שפע של אסטרטגיות המסייעות לתנועה, כולל ייצור פעילי שטח, היפרפלציה, והארכות תאים2. נחיל מציע חיידקים יתרון תחרותי הן מבחינה אקולוגית והן בסביבה קלינית18,19,20. ישנן שתי קטגוריות של חיידקים נוהרים: נחילים ממוזגים, אשר יכול לנחיל רק על מדיה מוצק עם 0.5-0.8% אגר, ונחילים חזקים, אשר יכול לנווט על פני ריכוזי אגר גבוהיםיותר 21.

קיימים מגוון של חקירות כדי לחקור תנועתיות שחייה והרגולציה שלה. כאשר הוא נפגע ממוטציות או מתנאים סביבתיים, תנועתיות עצמה מציעה מבחר חזק לזיהוי מוטציות מדכאות רווח-של-פונקציה. מדכאים אלה יכולים להיות חוזרים מקוריים של המוטציה המקורית, או חוזרים מדומים, שבהם מוטציה שנייה משחזרת את הפונקציונליות. מוטציות כאלה ניתן לזהות על ידי ריצוף גנום שלם (WGS). חלופה לבחירת מדכאים משוחדים היא אסטרטגיית מוטה של מוטגנסיס ממוקדת (למשל, מוטאגנסיס PCR). מתודולוגיות אלה שופכות לעתים קרובות אור על התפקוד או הרגולציה הסביבתית של מנגנון תנועתיות. אם המטרה היא ללמוד פונקציה מוטורית, אז שיקום תנועתיות מסוג פראי כפי שנמדד אגר רך לא בהכרח להצביע על שיקום של תפוקת מנוע מסוג בר. הבדיקה הקשורה לתא, שבה תאים מחוברים למשטח זכוכית על ידי flagellum יחיד וסיבוב של גוף התא מנוטר לאחר מכן, יכול להיות הבדיקה הראשונית של בחירה להערכת התנהגות מוטורית. למרות מתודולוגיות מתוחכמות יותר זמינים כעת כדי לפקח על תכונות מנוע, הגדרת המצלמה במהירות גבוהה הנדרשת ויישום של חבילות תוכנה לניתוח תנועה להגביל את השימוש הנרחב שלהם22,23,24,25. ההסרה הקשורה לתא דורשת רק להטות את הדגלה, ומאפשרת חיבור של הסיבים הקצרים למגלשת זכוכית, ואחריה צילום סיבוב גוף התא. למרות שמהירויות המנוע המתועדות נמוכות במיון זה בגלל העומס הגבוה שגוף התא מפעיל על הפלסטלום, ניסיון זה בכל זאת תרם לתובנות יקרות ערך על תגובות כימיות26,27,28,29, ונשאר כלי חקירה תקף כפי שנדון להלן.

תנועתיות נוהרת מציבה בפני החוקרים מערכת אתגרים שונה. מבחר מדכאי ההשגה עובד רק בנחילים המייצרים פעילי שטח בשפע ונוהרים בקלות13. פעילי שטח שאינם מפיקים כגון E. coli הם בררניים ביחס לבחירה של אגר, הרכב מדיה ולחות שלהסביבה 2,13,14,21. לאחר קביעת תנאי ההמולה, חוצה הגבול17 הוא מתודולוגיה שימושית לחקור את היכולת של נחיל לנווט בתנאים חדשים / קשים. למרות הפרוטוקולים המוצגים להלן מתייחסים E. coli, הם יכולים להיות מותאמים בקלות ליישום במינים אחרים.

Protocol

1. בידוד מוטציות מדכאות בזנים חסרי תנועתיות

הערה: השתמש בשיטה זו כ'מלכוד הכל ' רחב כדי לזהות את האופי הכללי של פגם תנועתיות.

  1. הכנת צלחת אגר רכה
    הערה: רך אגר, המכונה גם תנועתיות - או לשחות אגר, הוא אגר אחוז נמוך (~ 0.2-0.35% w / v), ארוך המשמש כדי assay chemotaxis31,32.
    1. יש להוסיף 3 גרם של bacto-agar (0.3% w/v) ו-20 גרם של LB לבקבוקון תחתון עגול בנפח 2 ליטר. מוסיפים לבקבוקית 1 ליטר של ddH2O (מים מזוקקים כפולים) ומערבבים באופן שווה את המתלים באמצעות מוט ערבוב וצלחת ערבוב מגנטית.
    2. כלave אוטומטית במשך 20 דקות ב 121 °C (70 °F).
    3. אפשר להתקרר עם עצבנות עדינה באמצעות המוט / צלחת כמו לעיל. כאשר הטמפרטורה מגיעה כ 50 °C (50 °F), לשפוך 25 מ"ל לתוך מנות פטרי סטריליות (100 מ"מ x 15 מ"מ), ולאפשר אגר מותך להגדיר עם מכסה במקום לפחות 1 שעה, לשימוש בתוך 16 שעות.
  2. הכנת תרבות, חיסון ובידוד של מוטנטים מדכאים
    הערה: E. coli מחוסן במרכז של מדיה עשירה בחומרים מזינים מוצק עם אגר רך לצרוך חומרים מזינים באופן מקומי, יצירת שיפוע מתזונה שהם עוקבים. כשהם נעים החוצה, מופיעות 'טבעות' מוגדרות (איור 1A), הקשורות לכימותרפיה ספציפית שהחיידקים מגיבים לה. פגמים במערכת chemotaxis או רכיבים מבניים של מנוע flagella יכול לסכן את הביצועים ב- assay זה. לעתים קרובות, מוטנטים עם יתרון תנועתיות מתעוררים במהלך ההקרנה, וניתן לראות אותם מגיחים מנקודות בודדות או ממספר נקודות לאורך הפריפריה של הטבעת, משם הם "מתלקחים" החוצה (איור 1C). ישימו לב שהקצה החיצוני ביותר של חזית השחייה מנוגד בקלות לאגר הבתולה הרכה הלא מכובסת.
    1. לגדל תרביות לילה של זן תנועתיות-לקוי הרצוי ב 5 מ"ל של מרק לנוקס (LB; 10 גרם / L טריפטון, 5 גרם / L תמצית שמרים, ו 5 g / L NaCl, שולחן חומרים) ב 30 °C עם רעד אופקי (220 r.p.m.). למחרת, תת-תרבות (1:100 דילול) ב- LB טרי, גדל באותם תנאים לשלב מעריכי (OD600 של 0.6).
    2. לחסן 6 μL של התרבות למרכז צלחת אגר רך (1.1) באמצעות pipette, דוחף את הקצה סטרילי טעון לתוך אגר לגרש בעדינות את התוכן. מעבירים ל-30 מעלות צלזיוס ודגרה (איור 1B),עד ל ניכרים "התלקחויות" תנועתיות, הנובעות מנקודת החיסון או מהפריפריה של טבעות תנועתיות, בדרך כלל ב-24-36 שעות(איור 1C).
      הערה: בבוחות תנועתיות, לחסן זן מסוג פראי לצד המבודדים המוטנטיים לשם השוואה. זן בר זה יציג את הטבעות הכימיות הקונצנטריות האופייניות (איור 1A) וימלא את הצלחת בתוך 8-10 שעות.
    3. השתמש בלולאת תיל סטרילית כדי להרים את התאים מאזור 'התלקחות' ולפגוע כדי לטהר מושבות בודדות על צלחת אגר קשה LB (LB מוכן כנ"ל, מגובש עם 15 גרם / L bacto-אגר).
    4. בחרו מושבות בודדות מצלחת הפס באמצעות לולאת תיל סטרילית וטוהרו מחדש על ידי פסים למושבות בודדות כדי להבטיח בידוד של מבודד מושבה 'טהורה'.
  3. אישור, ואפיון של מוטציות מדכאות
    1. אשר שהמוטנטים המבודדים החזירו את תנועתיותם. הכן לוחות אגר רכים (1.1), ותרבויות לזנים מעניינים (כמו ב-1.2.1), כולל סוג פראי ומתח 'חסר תנועתיות' התחלתי להשוואה.
    2. לחסן את הצלחות (כמו 1.2.2) ודגור ב 30 °C (8-10 שעות.
    3. להקליט את הקוטר של הטבעת החיצונית ביותר (קצה המעגל) ולהשוות כדי לקבוע מי של מבודדים יש תנועתיות משוחזרת באופן משמעותי.
      הערה: מומלץ לצלם צלחות לאורך כל מהלך הניסוי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בהתקן "דלי של אור"30, שבו מצלמה דיגיטלית מותקנת מעל מקור אור להארה טובה יותר כדי למדוד את הקוטר של מושבת השחייה ולהבדיל אותו אגר לא קוטבי.
    4. הנבדק אומת מבודד ל- WGS כנדרש, ומאפשר 'כיסוי רצף' מספיק כדי לזהות באופן חיובי את המוטציות ששיקמו פונקציה מסוג בר.

2. כימות התנהגות מוטורית פלאגלה באמצעות קשירת תאים

הערה: השתמש בשיטה זו כאשר נראה שהתנהגות רגילה של ריצה-נופלת (chemotaxis) נפגעת.

  1. הכנת תרבות וגזלת דגלה
    1. הכן תרבות שלב מעריכית של זן העניין כמתואר בשלב 1.2.1.
    2. פלט 10 מ"ל של תאים לפי צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 3 דקות לפני הוצאה חוזרת ב 10 מ"ל של מאגר תנועתיות מעוקר מסנן (MB; 10 mM אשלגן פוספט חוצץ [0.0935 M K2HPO4, 0.0065 M KH2PO4, pH 7.0], 0.1 mM EDTA [pH 7.0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl).
      הערה: MB תומך תנועתיות, אבל אינו תומך בצמיחה חיידקית
    3. חזור על שלב 2.1.2 פעמיים נוספות לפני ususpending הכדור הסופי ב 1 מ"ל של MB.
    4. מעבירים את ההשעיה של התא למזרק של 1 מ"ל ומצמידים מחט 23G לסוף. להרכיב מזרק זהה / מחט מנגנון ולחבר את השניים יחד באמצעות 6 אינץ 'של צינורות פוליאתילן (קוטר פנימי של 0.58 מ"מ) נדן בחוזקה על כל קצה מחט.
    5. גנו את הדגלה (הם שבירים ונשברים בקלות) על ידי העברת מתלה התא בעדינות הלוך ושוב ממזרק אחד לשני 50x, עם הפסקות של דקה אחת בין כל 10 מעברים.
    6. צנטריפוגה התאים הגוזלים ב 2,000 x g במשך 3 דקות resuspend בנפח סופי של 500 μL של MB.
  2. הכנת שקופיות וקשירת תאים
    1. הכן תא קיבוע תאים על-ידי ערימת כיסוי 18 מ"מ x 18 מ"מ מעל שקופית מיקרוסקופ זכוכית בגודל 3 אינץ' x 1 אינץ' x 1 מ"מ, המופרדת באמצעות סרט דו-צדדי(איור S1).
    2. לשטוף את התא עם 0.01% (w/v) פתרון פולי-ליסין על ידי החלה על החלק העליון של התא. הטה את הקצה התחתון (כיסוי ריק עם שקופית המיקרוסקופ) על מגב משימות (נייר טישו) כדי לעזור לצייר פתרון דרך התא(איור S1). לאחר מכן לדגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    3. לשטוף את התא שלוש פעמים עם 40 μL של MB באמצעות כמתואר בשלב 2.2.2
    4. הוסף 40 μL של השעיית תא גיהון (מוכן לעיל) לחלק העליון של התא ודגור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לאפשר לתאים להתחבר כיסוי.
    5. יש לשטוף בעדינות את התא עם 40 μL של MB כמו ב 2.2.3 כדי להסיר תאים לא מחוברים.
  3. הקלטה וכימות סיבוב תאים
    1. העבר את שקופית המיקרוסקופ העמוסה בתאים קשורים לשלב המיקרוסקופ.
    2. באמצעות מיקרוסקופיה משולבת פאזה ומטרה 100x, לסרוק את האוכלוסייה עבור תאים קבועים במקום, ומסתובב על ציר אחד, כלומר, סיבובים חלקים על נקודה קבועה במקום להציג בזווית שבה התא נע פנימה והחוצה של המוקד (וידאו 1).
    3. השתמש במיקרוסקופ מסחרי ובמצלמה משויכת. פתח את התוכנה המשויכת, ודא שתאי העניין נמצאים במוקד ולחץ על רכישת וידאו כדי להקליט את סיבוב התא למשך דקה אחת (ב- 10 פריימים לשנייה ומעלה).
    4. מהפעלת וידאו, לכמת את מספר הסיבובים המלאים לדקה ואת מספר הפעמים שהתא משנה כיוון (תדירות מיתוג).
      הערה: מהירויות סיבוב ותדירות מיתוג עשויות להיות מהירות מדי לאמוד אחר עין ולכן מומלץ להשתמש בתוכנת וידאו המציעה הפעלה איטית / עדינה, או מאמצת מערכת תוכנה אוטומטית לכימות דפוסי סיבוב33. חלופה תהיה להגדיל את הצמיגות של MB באמצעות תאית מתיל (או סוכן דומה) כדי לעזור להאט ולפתור את הסיבוב של חיידקים מהירים יותר או לפצות כאשר מצלמות עם קצבי מסגרת נמוכים נמצאים בשימוש.
    5. חזור על שלב 2.3.2 עם שכפולים ביולוגיים כדי להרכיב ייצוג של אוכלוסיית העניין.

3. הכנת נחילים בבדיחת מעבר גבול

הערה: השתמש בשיטה זו להערכת ההשפעה של מוטציה או תנאי על תנועתיות קבוצתית. נחיל אגר מתייחס אגר שבו האחוז הוא בדרך כלל גבוה יותר מזה של אגר רך. באגר רך (0.3 %), תאים שוחים בנפרד בתוך אגר. באגר נחיל (0.5% ומעלה), התאים נעים כקבוצה על פני השטח. בעוד לוחות נחיל חייב לשמש כמפורט כאן, צלחות שחייה יש חיי מדף ארוכים יותר, והוא עשוי לשמש במשך כמה ימים. ההעדפה האישית שלנו היא להשתמש בעוד 1-2 ימים.

  1. הכנת אגר נחיל
    1. הוסף 5 גרם של אגר אייקן (0.5% w/v) ו-20 גרם של LB לבקבוקון תחתון עגול של 2 ליטר. מוסיפים 1 ליטר של ddH2O לבקבוק ומערבבים באופן שווה את המתלים באמצעות מוט ערבוב וצלחת ערבוב מגנטית.
    2. כלave אוטומטית במשך 20 דקות ב 121 °C (70 °F).
    3. אפשר להתקרר עם עצבנות עדינה כדי למנוע בועות אוויר באמצעות המוט / צלחת כמו לעיל. כאשר כ 50 °C (50 °F), להוסיף גלוקוז מעוקר מסנן לריכוז סופי של 0.5 %.
    4. יוצקים 25 מ"ל לתוך מנות פטרי סטריליות (100 מ"מ x 15 מ"מ) ומאפשרים להגדיר בטמפרטורת החדר לפחות 14 שעות ולא יותר מ 20 שעות. אין לאחסן לשימוש עתידי.
  2. חיסון ודגורה של לוחות נחיל
    1. לחסן 6 μL של תרבות מעריכית בינונית (מוכן כמו 1.2) על ידי תצפית על גבי אגר.
    2. משאירים את המכסה למשך 5-10 דקות ומחליפים כאשר האינוקולום התייבש לתוך משטח אגר.
    3. דגירה ב 30 °C (50 °F) במשך 8 שעות. הימנע הפיתוי לבדוק את התקדמות הנחיל על ידי הסרת המכסה, שכן זה יתרום לייבוש של אגר ולפגום נחילים.
      הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם פנוטיפ המתח. מוטציות מבודדות מסוימות עלולות לפגוע ביכולת הנחיל ויחייבו אחוז מופחת של אגר או תקופה ממושכת יותר של דגירה.
  3. הכנת לוחות אסי של מעבר גבול
    הערה: בדיקת ישבן זו משתמשת בצלחת פטרי מותאמת, שבה חלוקת פלסטיק (גבול) יוצרת שני תאים, ולא אחד(איור 2A). כל תא יכול להיות מוכן ללא תלות בשני, ומציע תנאים שונים לנחיל, לפני "חיבור" בין השניים. בהתאם לתכנון ניסיוני, ניתן להכין את התא הראשון (המיועד משמאל) עם אגר שחייה (0.3% w/v) או אגר נחיל (0.5% w/v) שממנו החיידקים יכולים לנדוד מעבר לגבול לתא הימני המכיל אגר נחיל +/- כל תוספת או אתגר נדרשים (למשל, אנטיביוטיקה). נדידה על כל אגר נמדדת /בהשוואה בדרך כלל על ידי רישום הקוטר הרחב ביותר של קולוניזציה חיידקית (מקצה לקצה) מנקודת החיסון המקורית.
    1. הכן אגר שחייה כמתואר ב-1.1 במידת הצורך.
    2. הכן אגר נחיל כמתואר ב 3.1.
    3. יוצקים ~ 30 מ"ל של אגר נחיל (עם תוספי הרצוי במידת הצורך) לתא הימני של צלחת פטרי כפולה (100 מ"מ x 15 מ"מ), עד לנקודה שבה הוא מאוזן עם מחיצת הפלסטיק בין התאים, אך לא עולה על גדותיו לשמאל(איור 2B).
    4. לאחר שהאגאר התקשה, מלאו את התא השמאלי ב-30 מ"ל של שחייה או אגר נחיל, שוב עד כדי מגע עם חלוקת הפלסטיק(איור 2C). לפני שהוא קובע, השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לגרור בעדינות את הגר מעבר לגבול כדי לחבר את שני הצדדים עם גשר אגר בגובה ~ 1 מ"מ המשתרע על כל אורך החלוקה (איור 2D).
    5. אפשר לצלחת להתייבש בטמפרטורת החדר (3.1).
      הערה: שיטה חלופית ליצירת גשר היא לאפשר אגר התא השמאלי להתייבש ולאחר מכן לאט pipette ~ 100 μL של אגר נחיל מותך לאורך מחיצת הפלסטיק לגשר בין שני התאים (3.4). לחסן את הצלחות על התא השמאלי כמפורט לעיל לשחייה (1.2.2) או נחיל (3.2) אגר, לפני הדגירה ב 30 °C (12-16 שעות), או עד נחילים עשו התקדמות מספקת מעל התא הימני כדי לאפשר השוואות בין זנים של עניין.

תוצאות

הבידוד של פסאודו-חוזרים בזן E. coli אשר תנועתיות נפגעת על ידי רמות גבוהות של מולקולת האיתות c-di-GMP, פורט בעבודה האחרונה מהמעבדה שלנו34. זן זה (JP1442) טפח שתי מוטציות: ΔyhjH ו ΔycgR. YhjH הוא הזרחן הפעיל ביותר שמשפיל את C-di-GMP ב- E. coli. היעדר YhjH מוביל רמות גבוהות c-di-GMP ועיכוב תנוע...

Discussion

הבידוד והאפיון של מוטציות מדכאות תרמו בהצלחה לזיהוי מרכיבים מרכזיים של מערכת הכימוטקסי35,36,37, כמו גם את המכונות המוטוריות עצמן38,39,40. בעת השימוש בפרוטוקול 1, חשוב לכלול שכפולים עצמאיים מרו?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק GM118085 ובחלקו על ידי קרן רוברט וולש (מענק F-1811 ל- R.M.H.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Bacto Dehydrated AgarFisher ScientificDF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, DihydrateFisher Scientific02-002-786
Eiken agarEiken Chemical Co. JapanE-MJ00Essential for E. coli swarming
Glucose D (+)Fisher Scientific410955000
LB (Lennox) BrothFisher ScientificBP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%)Sigma-AldrichP8920
Potassium chloride (KCl)Fisher Scientific18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
Sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6)OlympusOr equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided TapeFisher50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mmFisher12-550-343
Olympus BX53 microscopeOlympusBX53Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter)Fisher ScientificFB0875712For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)Perkin Elmer9908265
Round Petri Dish with 2 CompartmentsVWR89200-944For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G)Fisher Scientific14-826A
Sterile Syringe - 1 mLFisher scientific14-955-450
Task/Tissue wipesFisher scientific06-666Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mmVWR48366205
XM10 cameraOlympusXM10Or equivalent microscope camera

References

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. . E. coli in Motion. 1 edn. , (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A "bucket of light" for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a "backstop brake" mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a "run-reverse-turn" mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159Escherichia coli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved