Un modelo basado en cápsulas para la infestación por etapas inmaduras de garrapatas duras en ratones de laboratorio

Resumen

En este estudio, se desarrolló un sistema de alimentación para las etapas ninfa y larval de la garrapata dura utilizando una cápsula unida al ratón de laboratorio. La cápsula de alimentación está hecha de materiales flexibles y permanece firmemente unida al ratón durante al menos una semana y permite un monitoreo cómodo de la alimentación de las garrapatas.

Resumen

Las garrapatas son parásitos obligatorios de alimentación sanguínea en todas las etapas del desarrollo (excepto los huevos) y se reconocen como vectores de diversos patógenos. El uso de modelos de ratón en la investigación de garrapatas es fundamental para comprender su biología y las interacciones tick-host-patógeno. Aquí demostramos una técnica no laboriosa para la alimentación de etapas inmaduras de garrapatas duras en ratones de laboratorio. El beneficio del método es su simplicidad, corta duración y la capacidad de monitorear o recoger ticks en diferentes puntos de tiempo de un experimento. Además, la técnica permite la fijación de dos cápsulas individuales en el mismo ratón, lo que es beneficioso para una variedad de experimentos donde se requieren dos grupos diferentes de garrapatas para alimentarse del mismo animal. La cápsula no irritante y flexible está hecha de materiales de fácil acceso y minimiza las molestias de los animales experimentales. Además, la eutanasia no es necesaria, los ratones se recuperan completamente después del experimento y están disponibles para su reutilización.

Introducción

Las garrapatas son vectores importantes de varios patógenos y representan un grave riesgo para la salud animal y humana¹. La creación de un sistema de alimentación eficaz es crucial al estudiar su biología, interacciones garrapata-huésped-patógeno, o el establecimiento de medidas de control eficaces. Actualmente, varios sistemas de alimentación artificial, que evitan el uso de animales vivos están disponibles para las garrapatas^2,3,4 y estos deben ser utilizados siempre que las condiciones experimentales lo permitan. Sin embargo, en diversos entornos experimentales estos sistemas no imitan adecuadamente las características fisiológicas específicas y el uso de animales vivos es necesario para lograr resultados relevantes.

Los ratones de laboratorio se utilizan comúnmente para el estudio de muchos sistemas biológicos y se utilizan rutinariamente como huéspedes para la alimentación de garrapatas^5,6,7,8,9. Los dos métodos más comunes de alimentación de garrapatas inmaduras en ratones incluyen infestaciones libres y el uso de cámaras de confinamiento unidas al ratón. Las infestaciones libres se utilizan principalmente para las etapas larvales y las garrapatas engordadas pueden caer a un área donde se pueden recuperar. Las cámaras de confinamiento generalmente se componen de tapas de acrílico o polipropileno que se pegan a la espalda del ratón. La primera técnica es un sistema natural eficaz para la alimentación de garrapatas, pero no permite un seguimiento estrecho durante el experimento porque las garrapatas individuales se dispersan en diferentes partes del cuerpo huésped. Además, las garrapatas engordadas que caen a un área de recuperación pueden contaminarse con heces y orina^{10,11,12,13,14} que pueden afectar gravemente a la aptitud de la garrapata o pueden ser dañadas o consumidas por el ratón si no hay separación entre el animal y la zona de recuperación¹⁵. Los sistemas basados en la cámara permiten el confinamiento de garrapatas a un área definida, sin embargo, el proceso de encolado es laborioso y las tapas son a menudo débilmente adherentes al pegamento y por lo tanto a menudo se separan durante el experimento^16,17,18,19. Las tapas también son rígidas, incómodas y conducen a reacciones cutáneas, que impiden la reutilización de los ratones y requieren su eutanasia después del experimento.

En nuestro estudio anterior, desarrollamos con éxito un sistema eficaz utilizando cámaras hechas de espuma de acetato de etileno-vinilo (EVA) para alimentar garrapatas en conejos de laboratorio^20. Aquí, adaptamos este sistema a un modelo de ratón y proponemos un método simple y limpio para alimentar etapas inmaduras de garrapata dura en cápsulas cerradas hechas de espuma de EVA. Específicamente, nuestro sistema utiliza cápsulas elásticas de espuma eva pegadas a los ratones afeitados con secado rápido (3 min), pegamento de látex no irritante. Esta técnica permite la fijación firme y duradera de cápsulas al ratón experimental, así como la infestación/colección efectiva de garrapatas durante todo el curso del experimento. La cápsula plana está hecha de materiales flexibles y no impide la manipulación del ratón para la recolección de sangre u otros fines. El sistema es adecuado principalmente para las etapas de la garrapata ninfa, pero con una ligera modificación se puede utilizar para alimentar larvas también. El método puede ser completado por una sola persona experimentada y no se requiere una amplia formación.

Protocolo

Tenga en cuenta que este protocolo solo se puede aplicar cuando se cumplen todas las medidas de bienestar y seguridad en el laboratorio. Este protocolo recibió permiso para utilizar ratones para la alimentación de garrapatas por el Comité de ética para experimentos animalesComEth Anses/ENVA/UPEC, Números de permiso E 94 046 08. Para el punto final, los animales fueron expuestos a_CO2 durante 9 min en dos fases de 4 y 5 min cada una.

1. Preparación de la cápsula

1. Pegue espuma de EVA de 2 mm de espesor y la espuma adhesiva doble pegajosa juntas(Figura 1A).
2. Usando un punzón de cuero de 20 mm de diámetro, corte un círculo de las piezas de espuma pegadas. A continuación, utilizando un punzón de agujero de 12 mm de diámetro, corte el interior para crear el círculo de espuma doble (Figura 1B).
   NOTA: El espesor del bastidor de la cápsula debe ser superior a 3 mm de tamaño para garantizar una superficie suficiente para el proceso de encolado a la piel del huésped (ver más abajo).
3. Pelar la tira protectora de papel de la espuma adhesiva doble pegajosa (Figura 1C) y fijar un plástico circular transparente de 20 mm de diámetro (Figura 1D).
   NOTA: Si alimenta larvas, no retire la tira protectora de papel de la espuma adhesiva y pase directamente al paso 2 del protocolo. Pegue el anillo de espuma doble, incluida la tira protectora de papel al ratón.
4. Haga una ranura de 1 cm en el plástico transparente(Figura 1E).
5. Cree al menos 10 agujeros pequeños con un pasador entomológico (Figura 1F) para permitir la evaporación excesiva de la humedad durante el experimento.
   NOTA: La cápsula (Figura 1G) tiene una altura total de 4 mm (2 mm de espuma EVA junto con espuma adhesiva de 2 mm) y se puede utilizar para alimentar ninfas y larvas de todas las especies de garrapatas duras. El tamaño de la cápsula (Figura 1H) de 20 mm de diámetro exterior es adecuado para la mayoría de las tensiones del ratón, pero se puede modificar si es necesario.

2. Preparación de los ratones antes de la infestación por garrapatas

NOTA: En este estudio, se mantuvieron ratones experimentales hembra de 10 a 12 semanas de edad (strain C57BL/6 y BALB/cByJ) en jaulas estándar con alimentos y agua ofrecidos ad libitum (racks ventilados de línea verde a -20 Pa) en la Agencia Francesa de Alimentación, Salud y Seguridad Ambiental y Ocupacional (ANSES) acreditadas para animales en Maisons-Alfort, Francia. Los animales fueron monitoreados dos veces al día por técnicos experimentados para detectar cualquier reacción cutánea anormal, problemas de salud o complicaciones.

1. Anesthetizar el ratón con isoflurano en la cámara de inducción. Una vez anestesiado, coloque el ratón en la almohadilla de manipulación y adjúntelo a un cono nasal para el suministro continuo de isoflurano (Figura 2A). Controle la frecuencia respiratoria y reduzca el nivel de isoflurano para asegurarse de que sea inferior a 80 respiraciones por minuto.
   NOTA: Antes de la manipulación, etiquete el ratón individual tatuando o identificando radiofrecuencia si es necesario. Se recomienda mantener los ratones individuales en jaulas separadas para evitar daños en la cápsula por morder.
2. Afeitar la parte anterior del ratón desde detrás de los omóplatos hasta el área justo detrás de las orejas (Figura 2A).
   NOTA: El área afeitada debe ser mayor que la superficie de la cápsula.
3. Aplicar pegamento de látex no irritante a todo el sitio de espuma de EVA de la cápsula preparada y esperar 1 min(Figura 2B).
4. Pegue la cápsula al ratón hacia atrás por una ligera presión constante de 3 minutos con los dedos (Figura 2C), especialmente en el lado izquierdo y derecho de la cápsula. Levante ligeramente la cápsula para comprobar visualmente su fijación a la piel. Si se encuentran regiones no unidas, aplique más pegamento con una espátula y presione otros 3 minutos.

3. Infestación de garrapatas

1. Para la infestación de ninfas, introduzca las ninfas individuales en la cápsula a través del corte realizado en el paso 1.4 (Figura 2D).
   NOTA: Para las especies de garrapatas Ixodes se recomienda un máximo de 20 ninfas por una cápsula.
2. Apriete ligeramente la cápsula de dos lados para permitir que el plástico transparente se doble para facilitar la introducción de ninfas individuales utilizando fórceps de disección fina(Figura 2D). Empuje las ninfas individuales a través del corte dentro de la cápsula. Una vez dentro, gire los fórceps en 90o y tire de los fórceps para depositar las garrapatas dentro de la cápsula.
3. Para la infestación por larvas, retire el trozo de papel de la cápsula adjunta(Figura 2E). Coloque la jeringa, que contiene larvas (Figura 2F), directamente dentro de la cápsula y deposite las garrapatas empujando el émbolo de la jeringa. Gire suavemente el émbolo hacia la piel para eliminar las larvas restantes unidas.
   NOTA: Coloque las larvas en una jeringa de 1 ml con extremo cortado enchufado por trozo de algodón antes del experimento.
4. Una vez depositadas las larvas sobre la piel, cierre la cápsula fijando el plástico transparente(Figura 2G).
5. Aplique la banda protectora de plástico alrededor de la cápsula(Figura 2H).
   NOTA: La banda protectora de plástico mejoró en gran medida la durabilidad de la cápsula durante toda la duración del experimento (Figura 2I,J). Es posible conectar dos cápsulas a un ratón individual(Figura 2K). En este caso, se requiere un mínimo de 3 mm de espacio entre las cápsulas y la zona de afeitado debe aumentarse adecuadamente.
6. Devuelva a los ratones a la jaula.

4. Colección de garrapatas

1. Anesthetice el ratón como en el paso 2.1 anterior.
2. Haga un corte en forma de cruz (Figura 3A) al plástico con un bisturí.
   NOTA: Este corte en forma de cruz permite una fácil recolección de garrapatas engordadas o desprendimiento de las garrapatas de alimentación si es necesario.
3. Si es necesario, vuelva a cerrar la cápsula pegando un parche de plástico adhesivo al plástico transparente (20 mm de diámetro, Figura 3B).
   NOTA: Si se desea la recogida de ticks en varios puntos de tiempo, se puede utilizar el mismo parche de plástico pegajoso. Si el protocolo lo requiere, también se puede eutanasiar el ratón, quitar la cápsula y recoger/separar los ticks (Figura 3C).

5. Recuperación de los ratones

1. Mantenga a los ratones en jaula durante una semana más.
2. Deje que la cápsula se desprenda naturalmente.
   NOTA: En este caso, las cápsulas tardan unos 8-9 días en caerse. Cuando se retira la cápsula, es importante comprobar si hay reacciones anormales en la piel de los ratones. En caso de irritación aplicar una loción emoliente, aunque normalmente no se requiere tratamiento. Si el protocolo ético lo permite, los ratones recuperados (Figura 3D) se pueden reutilizar para otra infestación de garrapatas o experimentos diferentes.

Resultados

Proponemos el método detallado paso a paso para alimentar etapas inmaduras de garrapata dura en cápsulas de espuma de EVA aplicadas a la espalda de un ratón (Figura 2). Este protocolo no laborioso es adecuado para varios tipos de experimentos cuando se requiere una supervisión y recolección precisa de garrapatas. Las principales ventajas de este método son su simplicidad, materiales rentables de fácil acceso y corta duración. Además, logramos conectar dos cápsulas a un individuo de...

Discusión

El paso más crítico en el protocolo es el encolado firme de la cápsula a la piel del ratón. Por lo tanto, el pegamento de látex debe aplicarse homogéneamente a toda la superficie de espuma de EVA de la cápsula y se debe aplicar presión constante durante 3 minutos, especialmente en el lado izquierdo y derecho de la cápsula. También recomendamos la colocación de la cápsula tan lejos hacia adelante en la parte posterior como sea posible para evitar su eliminación por el ratón utilizando sus patas traseras. En ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
EVA-foam 2 mm thick, (low density)	Cosplay Shop	EVA-45kg (950/450/2 mm)	It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD)
Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches	Amazon	B0848S3S6T	Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon.
Mice BALB/cByJ	Charles River	Strain code 627
Mice C57BL/6	Charles River	Strain code 664
No-toxic Latex Glue	Tear mender	Fabric & Leather Adhesive	Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU)
Punch Tool Hand Art Tool	Amazon	B07QPWNGBF	Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap
PVC Binding Covers Transparent	Amazon	B078BNLSNP	Any transparent PVC sheet of ticknes between 0.150 mm to 0.180 mm is suitable
Self Adhesive Pad Sponge Double Coated Foam Tape	Amazon	B07RHDZ35J	Saled by amazon as 2 Rolls Double Sided Foam Tape, Super Strong White Mounting Tape Foam
Transparent seal stickers (20 mm diameter circles)	Amazon	B01DAA6X66