Um modelo baseado em cápsulas para infestação de estágios de carrapato duro imaturo em ratos de laboratório

Resumo

Neste estudo, foi desenvolvido um sistema de alimentação para estágios ninfais e larvais de carrapato duro utilizando-se uma cápsula ligada ao rato de laboratório. A cápsula de alimentação é feita de materiais flexíveis e permanece firmemente presa ao mouse por pelo menos uma semana e permite um monitoramento confortável da alimentação do carrapato.

Resumo

Carrapatos são parasitas obrigatórios de alimentação sanguínea em todos os estágios de desenvolvimento (exceto ovos) e são reconhecidos como vetores de vários patógenos. O uso de modelos de camundongos na pesquisa de carrapatos é fundamental para entender suas interações biologia e carrapato-hogeno-patógeno. Aqui demonstramos uma técnica não laboriosa para a alimentação de estágios imaturos de carrapatos duros em ratos de laboratório. O benefício do método é sua simplicidade, curta duração e a capacidade de monitorar ou coletar carrapatos em diferentes pontos de tempo de um experimento. Além disso, a técnica permite o apego de duas cápsulas individuais no mesmo rato, o que é benéfico para uma variedade de experimentos onde dois grupos diferentes de carrapatos são necessários para se alimentar do mesmo animal. A cápsula não irritante e flexível é feita a partir de materiais de fácil acesso e minimiza o desconforto dos animais experimentais. Além disso, a eutanásia não é necessária, os camundongos se recuperam completamente após o experimento e estão disponíveis para reutilização.

Introdução

Carrapatos são vetores importantes de vários patógenos e representam um sério risco para a saúde animal e humana¹. A criação de um sistema de alimentação eficaz é crucial ao estudar sua biologia, interações carrapato-hospedeiro-patógeno ou estabelecer medidas eficazes de controle. Atualmente, diversos sistemas de alimentação artificial, que evitam o uso de animais vivos, estão disponíveis para carrapatos^2,,3,4 e estes devem ser utilizados sempre que as condições experimentais permitirem. No entanto, em várias configurações experimentais esses sistemas não conseguem imitar adequadamente as características fisiológicas específicas e o uso de animais vivos é necessário para alcançar resultados relevantes.

Camundongos de laboratório são comumente usados para o estudo de muitos sistemas biológicos e são rotineiramente utilizados como hospedeiros para alimentação carrapatos^5,,6,7,,8,,9. Os dois métodos mais comuns de alimentação de carrapatos imaturos em camundongos incluem infestações gratuitas e o uso de câmaras de confinamento ligadas ao camundongo. Infestações gratuitas são usadas principalmente para estágios larvais e carrapatos engorgados podem cair para uma área onde podem ser recuperados. As câmaras de confinamento são geralmente compostas de tampas de acrílico ou polipropileno que são coladas nas costas do rato. A primeira técnica é um sistema natural eficaz para alimentação de carrapatos, mas não permite um monitoramento próximo durante o experimento porque os carrapatos individuais são dispersos em diferentes partes do corpo hospedeiro. Além disso, carrapatos engorgados que caem para uma área de recuperação podem se contaminar com fezes e urina^{10,11,12,13,14} que podem afetar severamente o condicionamento do carrapato ou podem ser danificados ou comidos pelo camundongo se não houver separação entre o animal e a área de^{recuperação 15}. Os sistemas baseados em câmara permitem o confinamento de carrapatos em uma área definida, no entanto, o processo de colagem é trabalhoso e as tampas são muitas vezes fracamente aderentes à cola e, portanto, muitas vezes se desprendem durante o experimento^16,17,,18,19. As tampas também são rígidas, desconfortáveis e levam a reações cutâneas, que impedem o reutilização dos camundongos e necessitam de sua eutanásia após o experimento.

Em nosso estudo anterior, desenvolvemos com sucesso um sistema eficaz usando câmaras feitas de espuma de acetato de vinil de etileno (EVA) para alimentar carrapatos em coelhos de laboratório²⁰. Aqui, adaptamos este sistema a um modelo de mouse e propomos um método simples e limpo para alimentar estágios imaturos de carrapato duro em cápsulas fechadas feitas de espuma EVA. Especificamente, nosso sistema usa cápsulas elásticas de espuma EVA coladas nos camundongos raspados de volta com secagem rápida (3 min), cola de látex não irritante. Esta técnica permite uma fixação firme e duradoura de cápsulas ao camundongo experimental, bem como a efetiva infestação/coleta de carrapatos durante todo o curso do experimento. A cápsula plana é feita de materiais flexíveis e não impede a manipulação do camundongo para coleta de sangue ou outros fins. O sistema é adequado principalmente para os estágios do carrapato ninfa, mas com uma pequena modificação pode ser usado para alimentar larvas também. O método pode ser completado por uma única pessoa experiente e não é necessário treinamento extensivo.

Protocolo

Observe que este protocolo só pode ser aplicado quando todas as medidas de bem-estar e segurança forem atendidas em laboratório. Este protocolo recebeu permissão para usar camundongos para alimentação de carrapatos pelo Comitê de Ética para Experimentos AnimaisComEth Anses/ENVA/UPEC, Números de Permissão E 94 046 08. Para o ponto final, os animais foram expostos ao CO₂ por 9 minutos em duas fases de 4 e 5 min cada.

1. Preparação da cápsula

1. Coloque 2 mm de espessura eva-espuma e a espuma adesiva dupla pegajosa(Figura 1A).
2. Usando um furo de couro de 20 mm de diâmetro, corte um círculo das peças de espuma grudadas. Em seguida, usando um furo de 12 mm de diâmetro, corte o interior para criar o círculo de espuma dupla(Figura 1B).
   NOTA: A espessura da armação da cápsula deve ser superior a 3 mm de tamanho para garantir superfície suficiente para o processo de colagem à pele do hospedeiro (veja abaixo).
3. Retire a tira de papel protetor da espuma adesiva dupla pegajosa(Figura 1C)e conecte um plástico circular transparente de 20 mm de diâmetro(Figura 1D).
   NOTA: Se alimentar as larvas, não remova a tira de papel protetor da espuma adesiva e mova-se diretamente para a etapa 2 no protocolo. Cole o anel de espuma dupla, incluindo a tira de papel protetor ao mouse.
4. Faça uma fenda de ~ 1 cm no plástico transparente(Figura 1E).
5. Crie pelo menos 10 pequenos orifícios com um pino entomológico(Figura 1F) para permitir a evaporação excessiva da umidade durante o experimento.
   NOTA: A cápsula (Figura 1G) tem uma altura total de 4 mm (2 mm de espuma EVA juntamente com espuma adesiva de 2 mm) e pode ser usada para alimentar ninfas e larvas de todas as espécies de carrapato duro. O tamanho da cápsula (Figura 1H) de 20 mm de diâmetro externo é adequado para a maioria das cepas do rato, mas pode ser modificado se necessário.

2. Preparação dos camundongos antes da infestação do carrapato

NOTA: Neste estudo, os camundongos experimentais femininos de 10 a 12 semanas (cepa C57BL/6 e BALB/cByJ) foram mantidos em gaiolas padrão com alimentos e água oferecidos ad libitum (racks ventilados da linha verde a -20 Pa) na Agência Francesa de Alimentos, Meio Ambiente e Segurança Ocupacional (ANSES) credenciadas em instalações animais em Maisons-Alfort, França. Os animais foram monitorados duas vezes por dia por técnicos experientes para quaisquer reações anormais da pele, problemas de saúde ou complicações.

1. Anesthetize rato com isoflurane na câmara de indução. Uma vez anestesiado, coloque o mouse na almofada de manipulação e conecte-se a um cone de nariz para a alimentação contínua de isoflurane(Figura 2A). Monitore a taxa de respiração e reduza o nível de isoflurane para garantir que seja menos de 80 respirações por minuto.
   NOTA: Antes da manipulação, rotule o mouse individual por tatuagem ou chip de identificação de radiofrequência, se necessário. Recomenda-se manter os camundongos individuais em gaiolas separadas para evitar danos à cápsula mordendo.
2. Raspe a parte anterior do mouse por trás das omoplatas até a área logo atrás das orelhas(Figura 2A).
   NOTA: A área raspada deve ser maior que a superfície da cápsula.
3. Aplique cola de látex não irritante em todo o local de espuma EVA da cápsula preparada e espere por 1 min (Figura 2B).
4. Cole a cápsula ao mouse de volta por uma leve pressão constante de 3 minutos com os dedos(Figura 2C), especialmenteno lado esquerdo e direito da cápsula. Levante ligeiramente a cápsula para verificar visualmente seu apego à pele. Se forem encontradas regiões não anexadas, aplique mais cola usando uma espátula e pressione por mais 3 minutos.

3. Infestação de carrapatos

1. Para infestação de ninfas, introduza as ninfas individuais na cápsula através do corte feito na etapa 1.4 (Figura 2D).
   NOTA: Para as espécies de carrapatos Ixodes recomenda-se no máximo 20 ninfas por uma cápsula.
2. Esprema ligeiramente a cápsula de dois lados para permitir que o plástico transparente dobre para facilitar a introdução de ninfas individuais usando fórceps de dissecção fina(Figura 2D). Empurre as ninfas individuais através do corte dentro da cápsula. Uma vez dentro, gire os fórceps em 90° e puxe os fórceps para depositar carrapatos dentro da cápsula.
3. Para infestação de larvas remova o papel da cápsula anexada(Figura 2E). Coloque a seringa, contendo larvas(Figura 2F), diretamentedentro da cápsula e deposite carrapatos empurrando o êmbolo da seringa. Gire suavemente o êmbolo em direção à pele para remover as larvas restantes presas.
   NOTA: Coloque larvas em uma seringa de 1 mL com extremidade cortada conectada por pedaço de algodão antes do experimento.
4. Uma vez que as larvas sejam depositadas na pele, feche a cápsula anexando o plástico transparente(Figura 2G).
5. Aplique a faixa de plástico protetora ao redor da cápsula(Figura 2H).
   NOTA: A faixa plástica protetora melhorou muito a durabilidade da cápsula durante toda a duração do experimento (Figura 2I,J). É possível anexar duas cápsulas a um rato individual(Figura 2K). Neste caso, é necessário um espaço mínimo de 3 mm entre as cápsulas e a área raspada deve ser aumentada adequadamente.
6. Devolva os ratos para a jaula.

4. Coleção de Carrapatos

1. Anestesiar o mouse como na etapa 2.1 acima.
2. Faça um corte em forma de cruz(Figura 3A) para o plástico com um bisturi.
   NOTA: Este corte em forma de cruz permite a fácil coleta de carrapatos engorgados ou desprendimento dos carrapatos de alimentação, se necessário.
3. Se necessário, recue a cápsula colocando um adesivo plástico no plástico transparente (20 mm de diâmetro, Figura 3B).
   NOTA: Se a coleta de carrapatos em vários pontos de tempo for desejada, o mesmo patch de plástico pegajoso pode ser usado. Se o protocolo exigir, pode-se também eutanásiar o mouse, remover a cápsula e coletar/separar os carrapatos(Figura 3C).

5. Recuperação dos camundongos

1. Mantenha os ratos na jaula por mais uma semana.
2. Deixe a cápsula se soltar naturalmente.
   NOTA: Neste caso, leva cerca de 8-9 dias para as cápsulas caírem. Quando a cápsula é removida, é importante verificar se há reações anormais na pele dos camundongos. Em caso de irritação aplique uma loção emoliente, embora normalmente não seja necessário tratamento. Se o protocolo ético permitir, os camundongos recuperados(Figura 3D) podem ser reutilizados para outra infestação de carrapatos ou experimentos diferentes.

Resultados

Propomos o método passo a passo detalhado para alimentar estágios imaturos de carrapato duro em cápsulas de espuma EVA aplicadas nas costas de um rato(Figura 2). Este protocolo não trabalhoso é adequado para vários tipos de experimentos quando é necessário um monitoramento e coleta precisa de carrapatos. As principais vantagens deste método são sua simplicidade, materiais econômicos de fácil acesso e curta duração. Além disso, conseguimos anexar duas cápsulas a um indivíduo ...

Discussão

O passo mais crítico no protocolo é a colagem firme da cápsula na pele do rato. Portanto, a cola de látex deve ser aplicada de forma homogênea em toda a superfície de espuma EVA da cápsula e deve ser aplicada pressão constante por 3 minutos, especialmente no lado esquerdo e direito da cápsula. Também recomendamos a colocação da cápsula o mais longe possível na parte traseira para evitar sua remoção pelo mouse usando suas patas traseiras. Em nossos experimentos, apenas a adesão da cola eva-espuma e látex...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
EVA-foam 2 mm thick, (low density)	Cosplay Shop	EVA-45kg (950/450/2 mm)	It can be ordered also via Amazon (ref. no. B07BLMJDXD)
Heat Shrink Tubing Electric Wire Wrap Sleeve 31mm/1.22 inches	Amazon	B0848S3S6T	Different diameters of Heat Shrink Tubing are available via Amazon.
Mice BALB/cByJ	Charles River	Strain code 627
Mice C57BL/6	Charles River	Strain code 664
No-toxic Latex Glue	Tear mender	Fabric & Leather Adhesive	Also available also via Amazon (ref. no. B001RQCTUU)
Punch Tool Hand Art Tool	Amazon	B07QPWNGBF	Saled by amazon as Leather Working Tools 1-25mm Round Steel Leather Craft Cutter Working for Belt Strap
PVC Binding Covers Transparent	Amazon	B078BNLSNP	Any transparent PVC sheet of ticknes between 0.150 mm to 0.180 mm is suitable
Self Adhesive Pad Sponge Double Coated Foam Tape	Amazon	B07RHDZ35J	Saled by amazon as 2 Rolls Double Sided Foam Tape, Super Strong White Mounting Tape Foam
Transparent seal stickers (20 mm diameter circles)	Amazon	B01DAA6X66