Cuantificación del área de adhesión de sustrato celular y distribuciones de formas celulares en monocapas de células MCF7

Resumen

El artículo describe la cuantificación de 1) el tamaño y el número de adherencias focales y 2) índice de forma celular y su distribución de imágenes confocales de las monocapas confluentes de las células MCF7.

Resumen

Los métodos presentados aquí cuantifican algunos parámetros de monocapas de células adherentes confluentes a partir de múltiples imágenes confocales debidamente manchadas: adhesión al sustrato en función del número y tamaño de adhesiones focales, y forma de celda, caracterizada por el índice de forma de celda y otros descriptores de forma. Las adherencias focales fueron visualizadas por la tinción de paxillin y los bordes de las células celulares se marcaron con plakoglobina de unión y actina. Los métodos para el cultivo celular y la tinción eran estándar; imágenes representan planos focales individuales; el análisis de imágenes se realizó utilizando software de procesamiento de imágenes disponible públicamente. Los protocolos presentados se utilizan para cuantificar el número y el tamaño de las adherencias focales y las diferencias en la distribución de la forma celular en las monocapas, pero se pueden reutilizar para la cuantificación del tamaño y la forma de cualquier otra estructura celular distinta que se pueda teñir (por ejemplo, mitocondrias o núcleos). La evaluación de estos parámetros es importante en la caracterización de las fuerzas dinámicas en la capa celular adherente, incluida la adhesión celular y la contractilidad de actomiosina que afecta a la forma celular.

Introducción

Las monocapas celulares epiteliales actúan como un colectivo en el que la adhesión de células celulares y sustratos celulares, así como fuerzas y tensiones contráctiles representan parámetros importantes y su equilibrio adecuado contribuye a la integridad general de la unidad^1,,2,,3. Por lo tanto, la evaluación de estos parámetros representa una manera de establecer el estado actual de la capa de celda.

Los dos métodos descritos aquí representan un análisis bidimensional de las monocapas confluentes de las células epiteliales adherentes (en este caso la línea celular del cáncer de mama MCF7). El análisis se realiza utilizando imágenes confocales (cortes Z únicos) de diferentes regiones en el eje Z; región basal cerca de un sustrato para mediciones de adhesión focal (FA) y región apical para mediciones de forma celular. Los métodos presentados son relativamente simples y requieren técnicas de laboratorio estándar y software de código abierto. La microscopía confocal es suficiente para este protocolo, por lo que se puede realizar sin emplear una microscopía TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) más especializada. Por lo tanto, el protocolo podría aplicarse en un entorno de laboratorio relativamente estándar. Aunque la precisión de los métodos es limitada, pueden distinguir las diferencias básicas en la adhesión focal y la forma de la célula.

Ambos métodos descritos aquí consisten en los procedimientos experimentales estándar tales como el cultivo celular, inmunosuculción, imágenes confocales y análisis de imágenes realizados con ImageJ. Sin embargo, se puede utilizar cualquier software de procesamiento de imágenes con las funciones adecuadas. Los métodos presentados pueden rastrear y comparar los cambios infligidos por el tratamiento farmacológico o la modificación genética mínima. No se recomienda obtener valores definidos, debido a la precisión limitada de estos métodos. Se incluyeron dos macros automatizadas, para facilitar las mediciones de muchas imágenes.

Protocolo

1. Pasos preparatorios

1. Siembra celular para obtener monocapas confluentes
   1. Antes de la siembra, recubrir los pozos de un portaobjetos de 4 pozos con colágeno I (u otro componente ECM de elección). Para el recubrimiento de colágeno I, siga un protocolo comercial: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html a una concentración de 8 g/cm².
   2. Semilla 400.000 células a un pozo de un portaobjetos de 4 pozos.
   3. Cultivo de las células durante 24 h (o más, dependiendo de los puntos finales experimentales) antes de la tinción, en una incubadora a 37 oC, 5% CO₂. Este paso permite una maduración de los contactos de células celulares y la formación de monocapas.
   4. Utilice un microscopio óptico invertido para verificar la confluencia (se requiere alrededor del 90%) y una condición general de las monocapas. No proceda si las celdas están flotando o parecen estresadas.
2. Tinción inmunofluorescente
   NOTA: Las celdas se pueden manchar con un protocolo de elección. Aquí, la inmunofluorescencia se realizó como se describió anteriormente⁴.
   1. Para el análisis de adherencia focal, manche las células con una proteína de adhesión focal de su elección (en este protocolo paxillin). Para el análisis de forma celular mancha con proteína de unión célula celular de elección (en este protocolo de plakoglobina de proteína desmosomal).
   2. Para el procedimiento, utilice 0,5 ml de soluciones especificadas a menos que se especifique lo contrario.
   3. Fijar células en 4% formaldehído en PBS durante 30 min en hielo.
   4. Incubar con cloruro de amonio de 0,1 M (en PBS) durante 10 minutos para apagar la autofluorescencia.
   5. Añadir 0.5% Tritón X-100 (en PBS) durante 30 min (permeabilización).
   6. Bloquear con 5% de leche (o 1% BSA) en TBS-T durante 1 h.
   7. Incubar con anticuerpo primario a 4oC durante la noche (anti-paxillina: conejo, 1:250, anti plakoglobina: conejo, 1:400)
   8. Incubar con anticuerpo secundario durante 30 min (Alexa Fluor 594 cabra anti-conejo, 1:500, 1:500)
   9. Mancha con DAPI de 300 nM durante 1-5 min, protegida de la luz.
      NOTA: Opcionalmente, se puede realizar una tinción adicional de actina con conjugados fluorescentes de faloideina (conc. 1:400); la faloideina debe añadirse en el mismo paso que el anticuerpo secundario.
3. Imágenes confocales
   1. Tome imágenes de rebanadas Z individuales con un microscopio confocal (por ejemplo, Zeiss LSM800).
      NOTA: La tinción de actina opcional puede ayudar a evaluar el plano focal adecuado. La tinción de actina cortical está presente en la región apical, mientras que las fibras de estrés de actina están presentes en la región basal, cerca del sustrato, como se ilustra en la Figura 1.
   2. Imágenes de adhesión focal
      1. Elija las rebanadas Z para el análisis de adherencia focal de la región basal, cerca del sustrato.
      2. Utilice un objetivo con la apertura numérica más alta disponible (preferiblemente 63x N.A.: 1.4).
         NOTA: La forma de FA es muy específica y fácilmente reconocible. Por lo tanto, se recomienda iniciar el escaneo desde un plano focal debajo de las células y luego escanear lentamente hacia ellas, hasta que los FA sean claramente visibles. El análisis de imágenes será más preciso a partir de campos de visión más pequeños, que tienden a ser más uniformes, pero esto implica que se calcularán menos celdas en un solo campo de visión.
   3. Imágenes de contactos de células celulares
      1. Utilice un objetivo de 40x o 63x.
      2. Seleccione canales para la tinción nuclear y la tinción de proteína de unión preferida.
      3. Elija los sectores Z para el análisis de la forma de celda de la región apical de las monocapas.
      4. Tome fotografías para al menos 3 campos de visión diferentes (200-400 células).

2. Análisis de imagen

NOTA: Las macros proporcionadas funcionan de forma óptima en ImageJ versión 1.50f o posterior. Se utiliza únicamente para la cuantificación de imágenes con una alta relación señal-ruido y sin píxeles infra-o sobresaturados. Los métodos descritos incluyen pasos que requieren un ajuste manual de los parámetros. Por lo tanto, se recomienda una configuración de experimento de análisis ciego/ciego. Para cifrar nombres de archivos de imagen, se pueden utilizar plugins ImageJ como "Blind Analysis Tool" (disponible en: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools).

1. Análisis de adherencia focal
   NOTA: Los archivos de entrada recomendados para los siguientes métodos son: imágenes de FA representadas en escala de grises de 8 bits guardadas en formato .tiff.
   1. Abra la imagen con ImageJ.
   2. Establezca la escala de una imagen en píxeles(Analizar ? Establecer escala; Eliminar escala y verificar Global opción).
   3. Incluya el nombre del archivo y el área de ROI en las opciones de medición(Analizar ? Establecer medidas...); Marque las opciones de Etiqueta de área y visualización.
   4. Restar fondo (Proceso de reste ( Proceso ? Restar fondo; establezca el parámetro Radio de bola rodante en 50 píxeles; comprobar la opción paraboloides deslizantes). En el caso de las imágenes RGB pseudocoloradas: canales RGB divididos, deje el canal con FA abierto, cierre los canales restantes (Imagen ? Color ? Dividir canales).
   5. Determinar el área de la región de interés más pequeña (ROI). Usando selecciones a mano alzada o polígonos delinean la adhesión focal más pequeña y miden su área( Analizar Medir). Repita este paso para diferentes ROI (FA) de algunas imágenes elegidas aleatoriamente (para un total de 20 ROI). Calcular y guardar la media de los resultados obtenidos.
      NOTA: Este paso solo es necesario cuando se analiza por primera vez un conjunto determinado de imágenes (línea celular específica, diapositivas de recubrimiento con componentes de matriz extracelular específicos, condiciones de cultivo diferentes).
   6. Convierta la imagen a binaria mediante uno de los métodos siguientes:
      1. Establezca el umbral global (Imagen ? Ajustar ? Umbral; marque las opciones Predeterminado, Blanco y negro y Fondo oscuro, ajuste el umbral manualmente o establézcalo automáticamente).
      2. Establezca el umbral local (Imagen ? Ajustar ? Umbral local automático...; establecer Método en Phansalkar y comprobar objetos blancos en el fondo negro opción. A continuación, invierta la imagen(Editar ? Invertir).
   7. Mida el número y el área de los ROI. Seleccione Analizar ?? Analizar partículas; Compruebe Unidades de píxeles, Mostrar resultados, Borrar resultados y Opciones de resumen, establezca El parámetro Tamaño, como límite inferior, utilice la media de los ROI más pequeños del paso 2.1.5. El límite superior se puede establecer en el 25% de un área de celda típica.
   8. Transfiera datos (que incluye el nombre de la imagen, el número de FA, el área total y media de las FA; respectivamente Sector, Recuento, Área total, Tamaño medio)desde la ventana Resumen al programa de gestión de datos de su elección.
   9. Determine el número de celdas por imagen contando núcleos manchados de DAPI. El conteo se puede hacer manualmente(Plugins ? Analizar ? Contador de celdas) o como en los protocolos disponibles, como: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
   10. Alternativamente, para facilitar el recuento de FA, utilice la macro ImageJ adjunta (FAs.ijm).
       1. Mueva el archivo .ijm con la macro a la carpeta de plugins o macros ubicada en las carpetas de archivos de origen de ImageJ.
       2. Determine un área del ROI más pequeño como se describe en el paso 2.1.4.
       3. Abrir archivo de macro (Plugins ? Macros ? Editar...).
       4. Antes de ejecutar la macro, establezca el valor de tres variables: valor de relleno de area_of_the_smallest_region_of_interest con un número adquirido durante el paso 2.1.4. Establezca threshold_type valor en manual o automático.
       5. Guardar cambios (la macro debe estar lista para usar).
       6. Llame a la macro desde el panel ImageJ o haga un acceso directo a ella. La macro comienza con la ventana de diálogo abierta estándar. Seleccione la imagen que desea procesar.
          NOTA: En caso de ajuste manual del umbral, se requerirá la confirmación manual del valor de umbral (evitar aceptar cambios mediante el botón Aplicar en la ventana de diálogo Umbral, utilice la ventana de diálogo personalizada Acción requerida en su lugar). Los resultados obtenidos al trabajar con la macro son los mismos que los descritos en el paso 2.1.8 (incluidos en la ventana de diálogo Resumen). Además, en el caso del ajuste de umbral manual, el nivel de umbral inferior se muestra en una ventana de diálogo Registro, ya que este valor permite reproducir los resultados obtenidos en el futuro si es necesario. Las figuras suplementarias S1 y S2 se incluyeron como un conjunto de datos de entrenamiento para la macro FAs.ijm.
2. Análisis de la forma celular
   1. Manual
      1. Abra una imagen en ImageJ u otro software de procesamiento de imágenes con un conjunto similar de funciones (otras instrucciones pertenecen a ImageJ). Seleccione los parámetros que desea medir seleccionando en el menú Análisis . Establezca Mediciones y los descriptores de forma de marcación en el cuadro que aparece.
      2. Delinea manualmente los bordes celulares, marcados por las proteínas de unión de su elección, usando el icono de selecciones a mano alzada. Los parámetros elegidos se calculan automáticamente para cada celda. Almacene los resultados después de esbozar cada celda haciendo clic en Editar . Selección de la selección de la selección de Añadir al administrador. Sólo deben contarse celdas completas y totalmente visibles, con bordes ininterrumpidos.
      3. Cuando se delinean todas las celdas del campo de visión, realice la medición marcando todos los números que aparecen en el cuadro izquierdo del Administrador de ROI (correspondiente a las celdas) y haciendo clic en Medir Los resultados aparecen en el cuadro Resultados y se pueden transferir a la hoja de cálculo de su elección.
   2. Automatizado
      NOTA: Para facilitar la cuantificación de descriptores de forma de celda (CSI, relación de aspecto, redondez, solidez) se ha preparado y adjuntado una macro ImageJ a este artículo (CSI.ijm). La macro se basa principalmente en el plugin ImageJ llamado MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)⁵. La macro ejecuta los siguientes pasos: 1) Extensión de cada borde de la imagen en 10 píxeles negros [MorpholibJ]; 2) Rondas de dilataciones y erosiones - filtro morfológico [MorpholibJ]; 3) Generación de imagen binaria de los límites de las células por segmentación morfológica [MorpholibJ]; 4) Dilatación de los límites celulares; 5) Inversión del valor de píxeles; 6) Generación de selecciones y medición del área y perímetro de las celdas en la imagen; y 7) Guardar imagen con celdas esbozadas y selecciones de ROI de ImageJ en un nuevo archivo.
      1. Mueva el archivo .ijm con la macro a la carpeta de plugins o macros ubicada en las carpetas de archivos de origen de ImageJ. Llame a la macro desde el panel ImageJ o haga un acceso directo a ella.
      2. Antes de la cuantificación de un nuevo conjunto de datos, determine los valores de las regiones más pequeñas y más grandes de interés. Esbozar (selección a mano alzada o polígono) algunos ejemplos (3-10) de las celdas más pequeñas y más grandes de la imagen y luego medir su área (Analizar . Medir).
      3. Como alternativa, ejecute la macro con la configuración predeterminada (el límite de tamaño inferior se establece en 0 y el límite superior se establece en infinito), espere a que finalice la macro y seleccione la opción Establecer límites de tamaño de celda. Mida el área de las celdas más pequeñas y más grandes haciendo clic en su etiqueta y luego presione Medir en el Administrador de ROI de ImageJ. Establezca el valor de the_smallest_cell y the_biggest_cell variables. Guarde los cambios, cierre todas las ventanas de diálogo de macro y vuelva a ejecutar la macro.
         NOTA: La macro se puede utilizar sin establecer límites de tamaño de ROI, pero no se recomienda porque aumenta significativamente la posibilidad de medir fragmentos de celdas o clústeres de celdas inapropiados.
      4. Inicie la macro con la ventana de diálogo Abrir estándar. Seleccione la imagen que desea procesar (escala de grises).
      5. Analice los resultados. La salida proporcionada por la macro consta de: tabla de los resultados (etiqueta de celda, etiqueta de imagen, área de celda [píxeles²], perímetro de celda [píxeles²], circularidad [CSI], relación de aspecto, redondez, solidez), imagen con celdas esbozadas y lista de selecciones de ROI (que también se guardará en un nuevo archivo en la subcarpeta Resultados). La tabla de resultados se copiará automáticamente en el portapapeles del usuario.
         NOTA: Las figuras suplementarias S3 y S4 se incluyeron como un conjunto de datos de entrenamiento para la macro CSI.ijm.

3. Cuantificación

1. Cuantificación de FA
   1. Calcule el número medio de FA y el tamaño medio de FA por célula/núcleos.
      NOTA: Para algunas líneas celulares es posible contar los FA por separado en celdas distintas. Para las líneas celulares que tienen contactos de celdas celulares fuertes y crecen como monocapas como MCF7, el número y el tamaño de los FA por celda se pueden calcular dividiendo los valores obtenidos de los FA contando por el número de núcleos en toda la imagen.
   2. Evaluar la importancia estadística de las posibles diferencias entre poblaciones (grupos experimentales). Dependiendo de la distribución y la varianza de los datos, para la comparación de los dos grupos diferentes utilice la prueba t del estudiante (distribución normal) o la prueba en U no paramétrica (Mann-Whitney). Para la comparación de varios grupos, utilice ANOVA unidireccional o Kruskal-Wallis junto con las pruebas post-hoc apropiadas.
2. Análisis de la forma celular
   1. Cálculo de descriptores de forma
      1. Análisis manual: Calcular el índice de forma de celda (CSI, también llamado circularidad o forma de celda) en la hoja de cálculo de su elección para cada celda medida desde el área y el perímetro apropiados utilizando la fórmula:
         
         NOTA: CSI asume valores entre 1 (circular) y 0 (alargado). Los ejemplos de varias formas de celda (con la misma área) y sus respectivos CSI se presentan en la Figura 2. En el análisis automatizado, los valores de los descriptores de forma (inscritos y definidos a continuación) se calculan automáticamente y aparecen en el cuadro de resultados:
         (1) CSI a 4o*área/(perímetro)²
         (2) AR - eje principal/eje menor
         (3) Redondez 4 * área / * * (eje principal)²
         (4) Solidez - área/área convexa
   2. Histogramas de la distribución de la forma celular
      1. Trazar la distribución de la forma de celda como un histograma de circularidad (CSI). Clasificar celdas según su valor CSI (calculado para el mínimo de 200–400 celdas), a uno de los diez intervalos uniformes (rango: 0-1, ancho de la bandeja: 0.1). El histograma muestra el número de celdas en cada categoría.
         NOTA: El histograma que muestra la distribución de la forma de la capa de celda MCF7 típica muestra un pico de alrededor de 0,7-0,8 CSI. Si la forma de las células está distorsionada por algún factor (por ejemplo, el tratamiento con paclitaxel, que causa la detención de fase G2/M y, en consecuencia, más células son redondas) debe reflejarse en el histograma.
   3. Parcelas de distribución acumuladas
      1. Compare las distribuciones CSI acumulativas para cada línea celular, porque es la mejor manera de evaluar las diferencias estadísticamente importantes en los cambios en la forma de la celda (o cualquier otro cambio en la distribución. Por ejemplo, se puede aplicar para realizar un seguimiento de la distribución cambiante de las FA.
      2. Calcule la función de distribución acumulativa (CDF) para comparar distribuciones. CDF asigna para un valor CSI determinado (trazado en el eje X) el porcentaje (o recuento relativo) para el que todos los valores son menores o iguales a este valor CSI (trazado en el eje Y). Por lo tanto, a medida que el valor CSI aumenta, el porcentaje del conjunto de valores que son menores o iguales a este valor también aumenta. CDF se puede calcular mediante el software estadístico de elección, o manualmente.
      3. Para el análisis estadístico, utilice la prueba no paramétrica Kolgomorov-Smirnov.

Resultados

Análisis de adherencia focal
Anteriormente se demostró que el derribo del gen HAX1 afectaba a las adherencias focales⁶. Las células se cultivaron en la superficie recubierta de colágeno I durante 48 h. Las imágenes de las células de control MCF7 y las células MCF7 con un knockdown HAX1 (HAX1 KD) de tres experimentos independientes manchados con paxillin de proteína de adhesión focal se obtuvieron utilizando un microscopio confocal (imagen de ...

Discusión

La adhesión de células celulares y sustratos celulares constituyen atributos inherentes de las células epiteliales y desempeñan el papel crítico en la morfogénesis tisular y la embriogénesis. En los tejidos adultos, la regulación adecuada de las propiedades mecánicas de la capa celular es crucial para mantener la homeostasis y prevenir respuestas patológicas como la progresión tumoral y la metástasis. El tamaño y el número de adherencias focales dependen de la fuerza de la adhesión del sustrato celular, mi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	goat anti-rabbit, 1:500
Ammonium chloride	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Collagen from calf skin	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Junction plakoglobin	Cell Signaling	2309S	rabbit, 1:400
Laminar-flow cabinet class 2	Alpina		standard equipment
MCF7-basedHAX1KD cell line	Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019		MCF7 cell line withHAX1knockdown
MCF7 cell line (CONTROL)	ATCC	ATCC HTB-22	epithelial, adherent breast cancer cell line
Olympus CK2 light microscope	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	rabbit, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Phalloidin-TRITC conjugate	Sigma	P1951	1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST – NaCl	Sigma	S9888
TBST – Trizma base	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Confocal microscope	Zeiss