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Resumen

Aquí se presenta un protocolo para el modelo de fragmentación crónica del sueño (LCR) logrado por un rotor orbital controlado eléctricamente, que podría inducir déficit cognitivo confirmado y comportamiento similar a la ansiedad en ratones jóvenes de tipo salvaje. Este modelo se puede aplicar para explorar la patogénesis de la alteración crónica del sueño y trastornos relacionados.

Resumen

La alteración del sueño es generalmente común en las poblaciones como una enfermedad crónica o un evento denunciado. Se propone que la alteración crónica del sueño esté estrechamente relacionada con la patogénesis de las enfermedades, especialmente las enfermedades neurodegenerativas. Recientemente encontramos que 2 meses de fragmentación del sueño iniciaron cambios conductuales y patológicos similares a la enfermedad de Alzheimer (AD) en ratones jóvenes de tipo salvaje. En este documento, presentamos un protocolo estandarizado para lograr la fragmentación crónica del sueño (LCR). Brevemente, CSF fue inducido por un rotor orbital que vibraba a 110 rpm y operaba con un ciclo repetitivo de 10 s-on, 110 s-off, durante la fase light-ON (8:00 AM-8:00 PM) continuamente durante un período de hasta 2 meses. Las deficiencias del aprendizaje espacial y la memoria, el comportamiento similar a la ansiedad pero no similar a la depresión en ratones como consecuencias del modelado de CSF, fueron evaluados con el laberinto de agua morris (MWM), el reconocimiento de objetos novedoso (NOR), la prueba de campo abierto (OFT) y la prueba de natación forzada (FST). En comparación con otras manipulaciones del sueño, este protocolo minimiza las labores de manipulación y maximiza la eficiencia del modelado. Produce fenotipos estables en ratones jóvenes de tipo salvaje y se puede generar potencialmente para una variedad de propósitos de investigación.

Introducción

La alteración del sueño es cada vez más común tanto en pacientes con afecciones que alteran el sueño como en personas sanas con eventos que alteran el sueño. Se ha observado que los pacientes con enfermedades neurodegenerativas, dolor crónico, estrés emocional, enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades del sistema urinario, etc., suelen quejarse de experiencias desagradables de sueño1,2,3,4,5. Apnea obstructiva del sueño (AOS), movimientos periódicos de las extremidades en el sueño (PLMS), insomnio de mantenimiento del sueño entre otros trastornos del sueño son las causas más comunes, que inducen la fragmentación del sueño6,7. En los países desarrollados, la AOS tiene una prevalencia superior al 5% al 9% en la población adulta y del 2% en la población infantil8,9,10. Mientras tanto, hay una proporción cada vez mayor de la población sana que experimenta trastornos del sueño debido al uso excesivo de teléfonos inteligentes, hábitos de sueño irregulares, ruidos molestos y tareas de trabajo, como turnos de noche para cuidadores. Se reconoce que el sueño es importante para el aclaramiento de residuos cerebrales11,12,consolidación de la memoria13,14,equilibrio metabólico15,16,entre muchos otros procesos fisiológicos. Sin embargo, todavía se desconoce en gran medida si la alteración del sueño a largo plazo da lugar a alteraciones irreversibles de la patogénesis en seres humanos sanos, y si es la etiología o un factor que contribuye al desarrollo de enfermedades del sistema nervioso central, como las enfermedades neurodegenerativas en un par de años en el camino. Nuestro objetivo es informar de un modelo experimental que genera un déficit cognitivo estable y evidente y un comportamiento similar a la ansiedad en ratones jóvenes de tipo salvaje después de un tratamiento de fragmentación del sueño de 2 meses. Este modelo se aplicaría para responder a las preguntas científicas mencionadas anteriormente.

La alteración del sueño se enumera como un factor de riesgo potencial para desarrollar la enfermedad de Alzheimer (AD) o demencia. Kang et al. encontró y describió por primera vez la exacerbación de la patología ad por 6 h privación aguda del sueño17. A partir de entonces, muchos otros estudios informaron que la privación o fragmentación del sueño podría agravar la patogénesis en ratones transgénicos ADmodelos 18,19,20. Sin embargo, muy pocos investigadores han estudiado la consecuencia de la alteración del sueño en ratones jóvenes de tipo salvaje; es decir, si la alteración del sueño da lugar a un comportamiento similar al AD o a cambios patológicos en ratones jóvenes de tipo salvaje. En nuestra reciente publicación, informamos que 2 meses de fragmentación del sueño indujeron un déficit evidente de memoria espacial y un comportamiento similar a la ansiedad, así como un aumento de la acumulación intracelular de Amiloide β (Aβ) tanto en corteza como en hipocampo en ratones de tipo salvaje de 2-3 meses de edad21. También observamos niveles de expresión alterados de marcadores de vías endomas-autofagosoma-glisomasas y activación de microglia, que era similar a los cambios patológicos reportados en ratones APP/PS121,22.

Este protocolo de fragmentación del sueño presentado (SF) fue validado por Sinton et al.23 y modificado por Li et al.24. En resumen, un rotor orbital que vibra a 110 rpm interrumpe el sueño durante 10 s cada 2 minutos durante la fase de encendido ligero (8:00 AM–8:00 PM). La alteración de la estructura del sueño en este modelo se caracterizó previamente con grabaciones electrofisiológicas del sueño y fue reportada por Li et al.24,lo que indica un aumento significativo en el tiempo de vigilia y disminución del sueño de movimiento ocular rápido (REM) durante la fase de encendido ligero, con el sueño total y los tiempos de vigilia (en 24 horas) no afectados después de más de 4 semanas de modelado24. Actualmente, el sueño total o la privación parcial del sueño son los modelos de manipulación del sueño más utilizados. La privación total del sueño se realiza generalmente mediante un manejo suave sostenido o la exposición del animal a objetos novedosos, alternativamente girando continuamente una barra o una cinta de correr25,26,27,28,29. Debido a razones éticas, la privación total del sueño suele ser inferior a 24 h. El modelo de privación parcial de sueño más comúnmente aplicado es el método de plataforma de agua, que principalmente ablating REM sueño30,31,32. Otros enfoques usando una cinta de correr o una barra que barre a lo largo de la parte inferior de la jaula, podrían inducir la fragmentación del sueño cuando se enciende a intervalos fijos33,34,35,36,37,38. Cabe destacar que SF interrumpe el sueño y provoca de forma intermitente excitaciones en todas las etapas del sueño24. Una de las ventajas destacadas de este modelo CSF que aplica rotor orbital es que se puede realizar continuamente durante meses controlado automáticamente por máquinas, lo que evita la mano de obra de procesamiento frecuente diariamente, excepto para el monitoreo regular. Además, el aparato permitiría modelar simultáneamente múltiples jaulas de ratones bajo intervenciones uniformadas. Durante sesiones de modelado completas, los ratones se alojan en sus jaulas domésticas con materiales habituales de ropa de cama y anidación, mientras que algunos otros métodos requieren exposición a entornos diversificados y estrés inevitable.

La fragmentación del sueño se caracterizó previamente por el método de manipulación del sueño, que imita las excitaciones frecuentes durante la fase de sueño y el rebote sustancial del sueño durante la fase de vigilia. En algunas literaturas, CSF fue considerado como el modelo animal para OSA39,40. En este estudio, la razón de la frecuencia elegida de excitación para ser 30 veces por hora se basa en la observación de índices de excitación en pacientes con apnea del sueño de moderada a grave. Se observó que la fragmentación del sueño de 4 semanas aumentó significativamente la latencia de excitación hipercácnica y el umbral de excitación táctil, que podría al menos durar 2 semanas después de la recuperación24. Este fenotipo se explica revelando la reducción de activación de c-fos en neuronas noradrenérgicas, orexinérgicas, histaminérgicas y colinérgicas activas en respuesta a la hipercapnia, así como proyecciones catecolaminérgicas y orexinérgicas reducidas en la corteza cingulada24. Sin embargo, es necesario tener en cuenta que la característica más importante en la AOS es la hipoxia causada por la obstrucción de las vías respiratorias, lo que resulta en la interrupción del sueño41,42. La alteración del sueño y la hipoxia repetitiva interactúan recíprocamente entre sí en la patogénesis de la AOS. Por lo tanto, la fragmentación del sueño por sí sola podría no ser capaz de demostrar completamente todas las características clave de la AOS en ratones.

En este documento, presentamos un protocolo estandarizado para modelar la fragmentación crónica del sueño en ratones jóvenes de tipo salvaje. El déficit cognitivo y la ansiedad, así como los comportamientos similares a la depresión después del tratamiento con CSF fueron evaluados por morris laberinto de agua, reconocimiento de objetos novedoso, prueba de campo abierto, y prueba de natación forzada. Es importante tener en cuenta que este modelo debe tomarse en su conjunto que genera fenotipos de patrón de sueño regulado, déficit cognitivo, y comportamiento similar a la ansiedad. El modelo actual podría aplicarse potencialmente, pero no limitarse, a los siguientes propósitos: 1) Investigar más a fondo los mecanismos de patogénesis funcional o molecular inducidos por la alteración crónica del sueño en ratones jóvenes sin predisposición genética, 2) Identificación de la vía directa que conduce a la neurodegeneración iniciada por la alteración del sueño, 3) Explorando las terapias para mejorar los fenotipos inducidos por la alteración crónica del sueño, 4) Estudiar los mecanismos protectores/compensatorios intrínsecos en ratones de tipo salvaje sobre la alteración crónica del sueño, 5) Para ser aplicado para estudiar la regulación del sueño-vigilia y los mecanismos de transición estatal.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Tongji, Tongji Medical College, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong.

1. Detección de ratones y preparación para el experimento

  1. Seleccione ratones machos adultos de tipo salvaje (8-10 semanas de edad) con un peso de 20-28 g para todo el experimento.
    NOTA: Los ratones tipo salvaje C57BL/6 se obtienen del Centro de Investigación Hubei para Animales de Laboratorio, Hubei, China.
  2. Asigne aleatoriamente todos los ratones al CSF y al grupo de control. Alberga de 3 a 5 ratones en cada jaula para evitar el estrés de aislamiento social. El número de ratones alojados en las jaulas de control coincide con el alojado en las jaulas de CSF emparejadas.
    NOTA: Los ratones de las mismas jaulas de grupo están agrupados para realizar experimentos conductuales de seguimiento.
  3. Localice las jaulas de control en la misma habitación con las jaulas CSF, para mantener idéntico el entorno circundante y los efectos de mano de obra.
  4. Numere y marque los ratones de cada grupo en sus oídos usando una etiqueta de oído para fines de monitoreo.
  5. Mantener la temperatura ambiente y la humedad entre 21–23 °C y 35%–60 %.
  6. Mantenga el ambiente ambiente en ciclo de 12 horas de luz y oscuridad (8:00 AM–8:00 PM light-ON, 8:00 PM-8:00 AM light-OFF), para evitar el efecto sesgado en el ritmo de sueño normal en ratones.
  7. Minimice el ruido y la interferencia mientras el investigador está presente en la sala de modelado.
  8. Proporcionar a los ratones suficiente comida y agua. Utilice boquillas largas con puntas de válvula de bola en botellas de agua, para evitar fugas de agua en los movimientos de la plataforma. Fije la botella de agua en la parte superior de la jaula con un resorte para evitar la dislocación de la botella durante el funcionamiento del rotor.

2. Preparación y ajuste del rotor orbital

  1. Prepare un rotor orbital controlado eléctricamente con plataforma ampliada (67 cm x 110 cm), en el que se pueden colocar 10 jaulas como máximo.
  2. Encienda el rotor orbital durante la fase de encendido ligero (8:00 AM-8:00 PM) controlado por un temporizador del programa, que es el momento en que los ratones exhiben la mayor parte de su sueño diario.
  3. Ajuste el rotor orbital con una velocidad de 110 rpm y un ciclo repetitivo de 10 s-on, 110 s-off controlado con un temporizador de estado sólido.
    NOTA: La capacidad de carga de la plataforma es de 50 kg. La amplitud fija del horizonte del rotor vibrando es de 2,5 cm.
  4. Fije las jaulas CSF en la parte superior de la plataforma del rotor por muelles gruesos para evitar la dislocación de las jaulas en las rotaciones de la plataforma.

3. Modelado y monitoreo crónicos de la fragmentación del sueño

  1. Coloque jaulas del CSF y los ratones de control en la sala de modelado durante una semana antes de los experimentos, para permitir que los ratones se adapten al entorno ambiente.
  2. Al comienzo del modelado, asegúrese de que todos los ratones tengan acceso gratuito a alimentos y agua durante las rotaciones orbitales.
  3. Al principio del modelado, observe al menos durante 1 h para asegurar que el rotor orbital funcione en marcha.
  4. Durante el período de modelado, compruebe que el rotor orbital funciona correctamente y las condiciones de los ratones cada 2 días para garantizar que los ratones tengan suficiente comida y agua. Cambie la ropa de cama de las jaulas semanalmente.
  5. Durante el período de modelado, pesar los ratones semanalmente a las 8:00 AM al cambiar la ropa de cama. Retire los ratones con pérdida de peso significativa del modelado, y también de los grupos experimentales.
    NOTA: La pérdida de peso significativa se define como un peso inferior a 20 g que dura 2 semanas.
  6. Durante todas las sesiones de modelado, retire el agresor, si existe, de la jaula y, también de los grupos experimentales.
  7. Después de la terminación del modelado, continúe manteniendo y alimentando a los ratones en la habitación original.

4. Prueba de laberinto de agua Morris (MWM)

  1. Preparación para la prueba
    1. Preparar el aparato de un tanque circular lleno de agua tibia (20-23 °C).
    2. Suspenda cuatro signos con diferentes formas y colores en la cortina que rodea el tanque en cuatro direcciones de cuadrante como referencia de visión distante. Haga que el agua parezca opaca por la adición de leche en polvo.
    3. Localice una plataforma en medio del cuadrante suroeste.
  2. La prueba de entrenamiento
    1. Someta a los ratones a cuatro ensayos consecutivos entre las 8:00 AM y las 12:00 AM cada día durante un período de entrenamiento de 5 días.
    2. Suelte cada ratón en el agua que da a la pared lateral en uno de los cuatro cuadrantes en cuatro pruebas. En cada prueba, permita que el ratón nade durante 60 s para encontrar la plataforma. Si el ratón no puede llegar a la plataforma en un radio de 60 s, guíela a la plataforma y permanezca allí durante 15 s.
    3. Utilice un sistema de seguimiento de vídeo para registrar automáticamente la latencia de escape de los ratones para encontrar la plataforma oculta.
  3. La prueba de la sonda
    1. Realice la prueba de sonda el sexto día después de 5 días de entrenamiento.
    2. Retire la plataforma. Libera cada ratón del cuadrante noreste y deja que nade durante 60 s
    3. Utilice un sistema de seguimiento de vídeo para grabar automáticamente los datos de seguimiento de ratones.

5. Prueba de reconocimiento de objetos novedoso (NOR)

  1. La fase familiar
    1. Coloque ratones en un tanque (longitud 30 cm, ancho 28 cm, alto 35 cm) en secuencia, que contiene dos copias de objetos (A1 y A2). Permita que los ratones exploren libremente (10 minutos por ensayo).
    2. Utilice un sistema de seguimiento de vídeo para grabar automáticamente los datos de seguimiento de ratones.
  2. La fase de prueba
    1. Realice el ensayo de prueba después de un retraso de 1 h de la fase familiar. Reemplace uno de los objetos originales por un objeto novedoso ("novela") en el tanque manteniendo el otro sin cambios. Devuelva a los ratones al tanque y déjelo explorar durante 5 minutos por ensayo.
    2. Utilice un sistema de seguimiento de vídeo para grabar automáticamente el tiempo empleado en la exploración de cada objeto por cada ratón.
      NOTA: La exploración del objeto se determina lamiendo, oliendo, masticando o moviendo vibrissae mientras orienta la nariz hacia y a menos de 1 cm del objeto. El Índice de Discriminación (DI) se calcula con la ecuación (TN − TF)/(TN + TF), donde TN = tiempo dedicado a explorar el objeto "novedoso" y TF = tiempo dedicado a explorar el objeto "familiar".

6. Prueba de campo abierta (OFT)

  1. Preparar el aparato de un tanque (30 cm x 28 cm x 35 cm).
  2. Durante la prueba, coloque cada ratón en el centro del tanque y deje que explore libremente durante 5 minutos. Limpie el tanque con un 75% de etanol después de cada ensayo para evitar los efectos sobrantes del ratón anterior.
  3. Utilice un sistema de seguimiento de vídeo para grabar automáticamente los datos de seguimiento de ratones.

7. Prueba de natación forzada (FST)

  1. Preparar el aparato de un recipiente cilíndrico abierto, que contiene agua (20-23 °C) de 15 cm de profundidad.
  2. Durante la prueba, coloque cada ratón en el cilindro y deje que permanezca allí durante 6 minutos.
  3. Utilice un sistema de pista de vídeo para grabar automáticamente el tiempo de inmovilidad durante los últimos 4 minutos de la prueba por cada ratón.
    NOTA: Se determina que el ratón está inmóvil cuando deja de luchar y flota en el agua, haciendo sólo movimientos que son necesarios para mantener su cabeza sobre el agua.

8. Análisis de datos

  1. Analice los datos utilizando software de análisis estadístico (por ejemplo, GraphPad Prism 6.0).
  2. Exprese todos los datos como la media ± SEM.
  3. Compare la latencia de escape en la prueba MWM entre dos grupos que utilizan ANOVA bidireccional con medidas repetidas seguidas de postpruebas de Bonferroni. Otras comparaciones entre el CSF y los grupos de control se determinan mediante pruebas t no asoadas.
  4. Considere las diferencias significativas si P < 0.05 en todas las pruebas.

Resultados

Todos los resultados y cifras representativas se reprodujeron de nuestra reciente publicación21. La reutilización de las cifras fue permitida por el diario original.

Todo el diseño experimental se ilustra en el orden del tiempo, lo que indica el tiempo del modelado CSF, las pruebas de comportamiento de MWM, NOR, OFT y FST (Figura 1A). Obtuvimos pesos de ratones cada semana del CSF y los grupos de control, para monitorear sus condiciones ...

Discusión

Los pasos críticos en el protocolo actual incluyen la configuración de máquinas de fragmentación del sueño con los parámetros optimizados de acuerdo con el propósito del estudio y el mantenimiento de los ratones en un ambiente de vida cómodo y tranquilo durante todas las sesiones de modelado. También es crucial decidir el momento adecuado para interrumpir o detener la fragmentación del sueño y organizar pruebas de comportamiento para esos ratones. Al igual que otros modelos de manipulación del sueño, es impo...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (61327902-6 a W. Wang y 81801318 a F.F. Ding). Reconocemos a la Dra. Sigrid Veasy por establecer el sistema experimental SF y proporcionar amablemente detalles técnicos. Reconocemos al Dr. Maiken Nedergaard por comentarios instructivos para experimentos relacionados.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Any-maze behavior tracking systemStoelting,Inc,USA-A video-tracking system which was used to record the behavior track of mice.
C57BL/6J miceHubei Research Center for Laboratory Animals, Hubei, China.-healthy male C57BL/6J mice aged 10-12 weeks were purchased from Hubei Research Center for Laboratory Animals
Graphpad Prism 6.0 SoftwareGraphpad Software,Inc.USA-Graphpad Prism 6.0 software was used to draw statistical graphs.
Morris water maze systemShanghai XinRuan Information Technology Co.,Ltd,ChinaXR-XM101The system was used to perform Morris water maze test
Orbial rotorShanghai ShiPing Laboratory Equipment Co.,Ltd,ChinaSPH-331The orbital rotor was used to establish the chronic sleep fragmentation model
Solid state timerOMRON Corporation, Kyoto, JapanH3CR-F8-300The solid state time was used to control the frequency and time of the rotor running
Wooden Lusterless Tank--length 30 cm, width 28 cm, height 35 cm The tank was used to perform open field test and novel object recognition test

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