Aislamiento Y Cultivo De Células Madre Mesenquimales De Médula Ósea Mandibular En Ratas

Resumen

Este artículo presenta un método que combine la adherencia entera de la médula y el flujo cytometry que clasifica para aislar, cultivar, clasificar, e identificar las células madres mesenquimales de la médula de las mandíbulas de la rata.

Resumen

Aquí presentamos un método eficiente para aislar y cultivar células madre mesenquimales de médula ósea mandibular (mBMSCs) in vitro para obtener rápidamente numerosas células de alta calidad para los requisitos experimentales. Los mBMSCs podrían ser ampliamente utilizados en aplicaciones terapéuticas como células de ingeniería de tejidos en caso de enfermedades craneofaciales y regeneración craneo-maxilofacial en el futuro debido a la excelente capacidad de autorre renovación y potencial de diferenciación multi-linaje. Por lo tanto, es importante obtener mBMSCs en grandes cantidades.

En este estudio, la médula fue limpiada con un chorro de agua de la mandíbula y los mBMSCs primarios fueron aislados con la cultivación adherente entera de la médula. Además, CD29⁺CD90⁺CD45⁻ mBMSCs fueron purificados a través de la clasificación de células fluorescentes. La segunda generación de mBMSCs purificados fue utilizada para el estudio adicional y exhibió potencial en el distinción en osteoblasts, adipocytes, y chondrocytes. Utilizando este modelo in vitro, se puede obtener un alto número de mBMSCs proliferativos, lo que puede facilitar el estudio de las características biológicas, la reacción posterior al microambiente y otras aplicaciones de los mBMSCs.

Introducción

Las células madre mesenquimales de médula ósea (BMSCs) son células madre no hematopoyéticas derivadas de la médula ósea que manifiestan una fuerte capacidad de proliferación y un potencial de diferenciación de múltiples^{linajes 1,2,3,4.} De hecho, los BMSCs han sido considerados como un candidato ideal para la ingeniería y regeneración de tejidos óseos desde que fueron descubiertos. Durante años, la cresta ilíaca o los huesos largos como la tibia y el fémur han sido la fuente más común de BMSCs para la regeneración craneofacial. Sin embargo, los BMSCs orofaciales, como los BMSCs de la mandíbula (mBMSCs), muestran algunas diferencias de los BMSCs de hueso largo, como el origen embrionario diferente y el patrón de desarrollo. Las mandíbulas surgen de las células neurales de la cresta de la capa germinal del neuroectodermo y se someten a la osificación intramembranosa, mientras que los esqueletos axiales y apendiculares son del mesodermo y se someten a la osificación endocondral. Además, las observaciones clínicas y los estudios experimentales en animales han indicado consistentemente que existen diferencias funcionales entre la cresta orofacial e ilíaca BMSCs^5,6,7,8. Los informes han demostrado que los BMSCs derivados del hueso craneofacial, como la mandíbula, el hueso maxilar y el hueso alveolar, exhibieron una proliferación, una vida y una capacidad de diferenciación superiores a las de los huesos axiales y apendiculares^9. Los mBMSCs, por lo tanto, se consideran los recursos preferidos para futuras aplicaciones terapéuticas de enfermedades craneofaciales como el querubismo, el tumor de mandíbula, la osteoporosis del hueso de la mandíbula y el defecto del tejido periodontal^10,11,12. Para entender el potencial del tratamiento en experimentos preclínicos, es esencial establecer un método para aislar y cultivar rápidamente mBMSCs in vitro.

En este estudio, el objetivo fue obtener mBMSCs purificados por adherencia de médula ósea entera y clasificación por citometría de flujo. La morfología anatómica de la mandíbula de la rata, observada claramente con la tomografía computada micro (Micro-CT) y las secciones histológicas, demostró que el hueso trabecular de la mandíbula estaba entre el espacio medular de la incisivo y el hueso alveolar. La médula ósea del hueso trabecular se enjuagaba para obtener células de médula mandibular, pero las células cultivadas de esta manera no eran mBMSCs puros y eran susceptibles de consistir en múltiples tipos de células con potencias inciertas y diversos linajes como células de células óseas, grasas y endoteliales^13,14. El siguiente paso de la purificación celular fue particularmente importante. La citometría de flujo filtra las células mediante el reconocimiento de una combinación de proteínas de la superficie celular y ha sido ampliamente adoptada en el enriquecimiento de las células madre mesenquimales. La homogeneidad celular es la principal ventaja de la citometría de flujo, pero el proceso no determina la viabilidad celular y puede resultar en un rendimiento celular limitado. En este estudio, los mBMSCs P0 obtenidos de la adherencia entera de la médula fueron clasificados por cytometry de flujo para obtener los mBMSCs con alta pureza y capacidad fuerte de la proliferación.

Este estudio introduce un protocolo reproducible y confiable para el aislamiento, la cultura, y la diferenciación de la mandíbula BMSCs de la rata usando una combinación de adherencia entera de la médula y de la clasificación cytometry de flujo. Es un método confiable y conveniente para que los investigadores en campos relacionados lo usen.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales en animales en este documento fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal del Noveno Hospital Popular de Shanghai, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai.

1. Preparación

1. Use dos ratas Sprague Dawley machos de 5 semanas de edad para el experimento.
2. Esterilizar todos los instrumentos, incluyendo porta agujas, pinzas y tijeras a alta temperatura o sumergidos en etanol al 75% durante 10 min.
   NOTA: La inmersión en etanol no debe ser demasiado larga para evitar el daño celular.
3. Preparar previamente los medios de cultivo, cuya composición figura en el cuadro 1. Complemente cada medio como se describe a continuación.
   1. Preparación del medio de cultivo α-MEM (con 10% de FBS): Complementar el medio mínimo esencial alfa (α-MEM) con suero fetal bovino al 10% y al 1% de penicilina y estreptomicina.
   2. Preparación del medio de diferenciación osteogénico: Suplemento de diferenciación osteogénica del medio basal con suero bovino fetal al 10%, 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, ácido ascórbico al 0,20%, 1% β-glicerofosfato y dexametasona al 0,01%.
   3. Preparación de medio de inducción osteogénico: Mezclar 70% α-MEM medio de cultivo (con 10% FBS) y 30% medio de diferenciación osteogénica.
   4. Preparación del medio de diferenciación adipogénico A: Complementar el medio basal de diferenciación adipógena con suero fetal bovino al 10%, 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 0,20% insulina, 0,10% IBMX, 0,10% Rosiglitazona y 0,01% Dexametasona.
   5. Preparación del medio de diferenciación adipogénico B: complementar la diferenciación adipógena del medio basal con suero fetal bovino al 10%, glutamina al 1%, penicilina-estreptomicina al 1% e insulina al 0,20%.
   6. Preparación del medio de diferenciación condrógena: Suplemento de diferenciación condrogénica del medio basal con 0,01% de dexametasona, 0,30% de ácido ascórbico, 1% its, 0,10% de piruvato de sodio, 0,10% de prolina y 1% de TGF-β3.
      NOTA: El medio de diferenciación osteogénica debe utilizarse dentro de un mes después de la configuración. El período efectivo del medio de diferenciación condrogénica configurado es de 12 h.

2. Aislamiento y cultivo de mBMSCs de rata

NOTA: Todas las operaciones experimentales deben realizarse en hielo tanto como sea posible para mantener la viabilidad celular.

1. Cosecha de mandíbulas de rata
   1. Euthanize dos ratas masculinas de 5 semanas sprague Dawley por la asfixia del_CO2. Asegúrese de que la respiración del animal se detiene antes de continuar con el experimento.
   2. Enjuague estas ratas en un casto que contenga etanol al 75% durante 3 min.
   3. Coloque la rata dentro de una campana extractora de humos limpia para cosechar mandíbulas.
      NOTA: Esterilice la campana extractora de humos mediante radiación de luz ultravioleta durante 30 minutos antes de su uso.
   4. Coloque a la rata en decúbito supino. Incise las pieles y los músculos buccinadores de los oris bilaterales del angulus a la región posterior de la mandíbula, que es el único hueso móvil con la incisivo más baja.
      NOTA: Se recomienda hacer una incisión de 2 cm a cada lado del oris angulus para obtener un campo de operación claro.
   5. Abra la boca de la rata empujando los incisivos maxilares y mandibulares hacia la dirección opuesta con ambos pulgares para exponer los dientes mandibulares, que están unidos a la mandíbula.
   6. Desconecte completamente los músculos bucales y los tendones unidos a los coracoides y el borde inferior de la mandíbula.
      NOTA: Se observa una mayor movilidad de la mandíbula durante este paso debido a la falta de tensión muscular.
   7. Presione los dientes posteriores mandibulares y gire hacia atrás y hacia abajo hasta que los cóndilos en ambos lados estén claramente expuestos.
      NOTA: Este paso se realiza para abrir artificialmente la boca de la rata en la máxima medida posible para dislocar el cóndilo. La mandíbula está conectada al cráneo a través de cóndilos bilaterales, por lo que la exposición de los cóndilos conduce a la desconexión entre el cráneo y la mandíbula.
   8. Separe el cuerpo de la mandíbula del cráneo.
   9. Limpie el tejido blando adherente en la superficie ósea con una gasa húmeda.
   10. Coloque el hueso en un plato de vidrio estéril de 10 cm lleno de α medio esencial mínimo preenfriado (α-MEM) o solución salina tampón de fosfato (PBS) sobre hielo para preservar la viabilidad.
2. Aislamiento y cultivo de los mBMSCs
   1. Cortar el hueso anterior a lo largo del borde mesial del primer molar del cuerpo mandibular. Retire el ramo mandibular incluyendo el coracoides y el cóndilo a lo largo del borde distal del tercer molar para exponer la cavidad de la médula.
   2. Llene un plato de vidrio estéril de 10 cm con 10 mL de α-MEM (con 10% de FBS).
   3. Use jeringa de 1 ml para aspirar α-MEM. Con la aguja de la jeringa insertada en la cavidad de la médula ósea, enjuague repetidamente la médula ósea en el plato. Enjuague la cavidad ósea al menos 3 veces desde los lados mesial y distal del hueso, respectivamente, hasta que el hueso se volviera blanco.
      NOTA: Este es el paso más crítico, ya que la cavidad de la médula ósea de una mandíbula de rata no es tan obvia como en el hueso largo y el punto adecuado para insertar la aguja debe determinarse empíricamente. Todas las muestras experimentales anteriores deben almacenarse en hielo para mantener la viabilidad de la célula y, por lo tanto, el tiempo de operación no debe ser superior a 2 h.
   4. Transfiera el medio que contiene las células enjuagadas a un tubo centrífuga de 15 mL y la centrífuga a 800 x g en 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
   5. Resuspend las células con 3 mL de α-MEM (con FBS del 10%). Platear las células en un nuevo plato de cultivo de 10 cm e incubar a 37 °C en una incubadora de CO_{2 al 5%.}
   6. Compruebe los cambios morfológicos y el crecimiento de estas células en el 3er día de cultivo. Retire el medio de cultivo con células no acomodantes y fragmentos de tejido. Agregue suavemente 10 mL de α-MEM fresco (con 10% de FBS).
   7. Después de 7 días de cultivo, P0 mBMSCs alcanzó 70% a 80% de confluencia.
3. Ordenación de celdas de flujo
   NOTA: P0 mBMSCs fueron identificados fenotípicamente y purificados sobre todo con la clasificación de la célula del flujo.
   1. Aspirar y desechar el medio de cultivo y luego lavar el plato con PBS. Descarte el PBS.
   2. Añadir 1 mL de tripsina al 0,25% con EDTA al 0,02% en el plato. Digiera las células a 37 °C durante 5 min, luego agregue 2 mL de α-MEM (con 10% de FBS) para detener la reacción.
   3. Transfiera la suspensión de las células a un tubo centrífuga de 15 mL y la centrífuga a 800 x g durante 5 min.
   4. Resuspend las células en 120 μL de PBS (con el 10% FBS) después de la centrifugación.
   5. Bloquee estas suspensiones celulares con 1 μL de anticuerpo contra CD16/CD32 a 4 °C durante 15 min.
   6. Transferir 100 μL de la suspensión celular en un nuevo tubo de microcentrífuga, teñir las células con Ficoeritrina (PE)-anticuerpo conjugado contra CD45, fluoresceína-isotiocianato (FITC)-anticuerpo conjugado contra CD90 y Aloficianina (APC)-anticuerpo contra CD29 a 4 °C durante 1 h en la oscuridad^13,15. La concentración de anticuerpos utilizados en este experimento se muestra en la Tabla 2. Utilice los otros 20 μL de suspensión celular como control negativo no manchado.
   7. Luego centrifugar los tubos a 800 x g durante 5 min, desechar la suspensión y resuspensar las células en 0.5 mL de PBS (con 10% de FBS).
   8. Añadir 10 μL de 0,01 mg/mL DAPI durante 10 min antes del análisis.
   9. Utilice filtros de 40 nm colocados en tubos centrífugos para filtrar las células.
   10. Analice las células en el clasificador de células activado por fluorescencia. Establezca los paneles de la siguiente manera. En primer lugar, eliminar las células muertas de la cuenta celular total por gating DAPI^- células, a continuación, puerta CD29⁺CD90⁺CD45^- en las células seleccionadas como mBMSCs dirigidos.
   11. Recoja las células CD29⁺CD90⁺CD45^- clasificadas en un tubo de centrífuga de 15 mL con 3 mL de α-MEM (con 10% de FBS) pre-preparado.
   12. Centrifugar los tubos a 800 x g durante 5 min. Quite el buffer de la colección y agregue 1 mL de α-MEM fresco (con el 10% FBS) para resuspend las células. Luego plaéalos en un plato de cultivo de 6 cm.

3. Capacidad de formación de colonias

NOTA: Este paso se realizó para comprobar la capacidad de división de mBMSC. ^15.

1. Seleccione los mBMSCs del segundo paso (P2) para este experimento. Cuando la confluencia celular alcanzó del 80% al 90%, reseseed las células en un gradiente serial en una placa de 6 pozos para evaluar su capacidad clonal de proliferación.
   NOTA: Se recomienda establecer el gradiente de 1 x 10² a 1 x 10³ células por pocillo, pero las diluciones finales de diferentes líneas celulares de origen humano o animal se determinaron empíricamente.
2. Cultíe las células en α-MEM (con el 10% FBS) por aproximadamente dos semanas hasta que un buen número de las unidades formantes de la colonia se pudieran considerar bajo microscopio ligero. Actualice el medio de cultivo cada 3 días.
3. Aspirar y desechar el medio de cultivo, lavar los pozos con PBS dos veces durante 5 min a la vez. A continuación, agregue la solución de paraformaaldehído al 4% a cada pozo y arregle durante al menos 10 min.
4. Retire el paraformalido y enjuague los pozos dos veces con PBS.
5. Manche las células con una solución de tinción de violeta cristalina e incubarlas en 37 °C durante aproximadamente 10 min.
   NOTA: El tiempo de tinción se ajustó adecuadamente hasta que se logre la sombra deseada.
6. Retire la solución de tinción y lave las muestras con agua destilada para detener la reacción.
7. Imagen bajo un estereomicroscopio y recuento de colonias celulares dispersas que consistían en al menos 50 células.

4. Diferenciación multilínea de mBMSCs

NOTA: Los mBMSCs P2 se utilizaron para experimentos posteriores a menos que se describa lo contrario.

1. Inducción osteogénica de mBMSCs
   1. Digiera los mBMSCs como se describió arriba. Células de semilla a una densidad de 2,5 x 10^5/cm2 en una placa de 12 pozos suplementada con 1 mL α-MEM (con 10% de FBS).
   2. Cuando la confluencia celular alcanzó el 60-70%, cambie el medio en medios de inducción osteogénica al 30%. Cultíe las células con α-MEM (con FBS al 10%) como control negativo y cambie el medio cada 2 días.
      NOTA: Después de que un gran buen número de nódulos de calcio aparezcan durante la osteogénesis, se recomienda cambiar el patrón de intercambio medio a un intercambio medio de medio volumen cada 2 días, para evitar que los osteoblastos flote.
   3. Después de cultivar durante siete días, evaluar la calcificación de estas células por la fosfatasa alcalina tinción^16,17.
   4. Retire el medio de cultivo y fije las células con paraformadehído al 4% durante 10 min. Enjuague las células usando 1 mL de PBS por pozo durante 3 min dos veces.
   5. A continuación, mantejen las células con solución de tinción de fosfatasa alcalina e incuben a 37 °C durante 10-30 min.
      NOTA: La incubación se puede realizar durante la noche a temperatura ambiente para obtener el color requerido.
   6. Lave los pozos con agua destilada para detener la reacción. Tome fotografías bajo microscopio de luz. Los gránulos pigmentados rojos representan actividad de la fosfatasa alcalina (MONTAN@A).
   7. Después de cultivar las células restantes durante otros 7 días, realice la tinción de alizarina en rojo para evaluar la capacidad de mineralización de las células.
   8. Manteje las células con una solución de tinción de alizarina al 0,5% después de la fijación celular durante 10 min^16,18. Detener la reacción cromógena con agua destilada después de 3-5 min.
      NOTA: El tiempo de reacción se puede ampliar dependiendo del color desarrollado.
   9. Finalmente, coloque la placa de cultivo debajo del microscopio de luz para observar el efecto de la tinción osteogénica; los nódulos rojos indican los depósitos del calcio de estas células.
2. Inducción adipógena de mBMSCs
   1. Semilla P2 mBMSCs en una placa de 12 pozos como se describió anteriormente.
   2. Después de que el pozo se convierta en 90% confluente, cultivo de las células con medio de diferenciación adipogénico A. Utilice células cultivadas en α-MEM medio de cultivo (con 10% FBS) como control negativo.
   3. Después de 2 días de inducción, aspirar el medio A del pozo y añadir 1 mL de medio de diferenciación adipógena B en cada pozo.
   4. Después de un día, retire el medio B y comience el ciclo de nuevo con el medio A añadido de nuevo en el pozo. Cultíe las células alternativamente usando los medios A y B.
   5. Aplicar el medio de diferenciación A y B alternativamente durante tres ciclos y detectar la adipogénesis de estas células mediante aceite rojo O tinción^16,18.
      NOTA: Un montón de gotitas de lípidos redondos y grandes se pueden observar mediante el cultivo de estas células con el medio de diferenciación B durante un adicional de 2 a 3 días.
   6. Retire el medio y fije las células con paraformadehído al 4% durante 10 min. Lave las células con PBS.
   7. Manteje las células con la solución de tinción de O de color rojo aceite e incube a 37 °C durante aproximadamente 3 min.
   8. Retire la solución de tinción y lave los pozos con agua destilada.
   9. Observe la adipogénesis bajo microscopio de luz.
3. Inducción de la condrogénesis de mBMSCs
   1. Semilla P2 mBMSCs en tubo centrífugo de 15 mL a una densidad de 5 x 10^5/cm2.
   2. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
   3. Resuspend las células con 0,5 mL de medio de diferenciación condrogénica. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min.
   4. Afloje la tapa del tubo de la centrífuga e incube a 37 °C en una incubadora de CO_{2 al 5%.} Renueve el medio cada 2 días.
      NOTA: Las células comienzan a peletizar después de 24 h. Se recomienda no mover el tubo de la centrífuga durante 48 h. Tenga cuidado de no aspirar el pellet celular al cambiar el medio.
   5. Después de 21 días de inducción, fije los pellets celulares con paraformadehído al 4%, seguido de deshidratación, incrustación de parafina y seccionamiento.
   6. Después de la desparafinación e hidratación, manche los portaobjetos en solución azul alciano durante al menos 15 min^18,19,20,21,luego lave con agua destilada para detener la reacción. Captura las fotografías bajo microscopio de luz.
   7. Para la tinción inmunofluorescente de colágeno tipo II, realice los pasos a continuación.
      1. Incubar los portaobjetos con 5 μg/mL de proteinasa K durante 15 min a 37 °C después de la etapa de desparafinación e hidratación.
      2. Incubar los portaobjetos en tampón de bloqueo durante 1 h a 37 °C.
      3. Aplicar 1 μL de colágeno tipo II anticuerpo en 200 μL de tampón de bloqueo a los portaobjetos e incubar durante la noche a 4 °C.
      4. Al día siguiente, lave los portaobjetos con PBS dos veces e incube con anticuerpos secundarios a 37 °C durante 1 h.
      5. Incubar las rodajas con 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min.
   8. Tome fotografías de cada diapositiva bajo microscopia de fluorescencia.

5. PCR en tiempo real

1. Extraiga el ARN total de mBMSCs usando un reactivo disponible comercialmente basado en el isotiocianato de guanidium.
2. Realice la transcripción reversa del ARN en la DNA complementaria usando un kit comercialmente disponible. Las condiciones de reacción de la transcripción inversa fueron las siguientes: 65 °C durante 5 min, 37 °C durante 15 min, 85 °C durante 15 s.
3. Realizar PCR en tiempo real para detectar genes específicos de osteogénesis y adipogénesis utilizando cebadores listados en la Tabla 3. El procedimiento de amplificación por PCR fue el siguiente: 95 °C durante 5 min. 95 °C durante 5 s, 60 °C durante 30 s durante 40 ciclos.

Resultados

Usando este protocolo, una gran proporción de células se adhirieron a la placa en el tercer día después de la cultura inicial. Típicamente, después de 3-4 días adicionales de cultivo, la confluencia celular alcanzó el 70-80% (Figura 1B). Con la clasificación de células fluorescentes, dapi^-CD29⁺CD90⁺CD45⁻ mBMSCs fueron purificados^18,22, que representaron alrededor del 81,1% en la...

Discusión

Este protocolo describe un método para aislar BMSCs de mandíbulas de la rata in vitro combinando adherencia entera de la médula y la clasificación fluorescente de la célula, que es una manera simple y confiable de obtener mBMSCs proliferativos con capacidad fuerte de la diferenciación. Este método podría purificar preliminarmente mBMSCs por la clasificación de células de flujo, pero si hay requisitos más altos para la homogeneidad celular, se pueden requerir métodos de purificación más precisos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA（1X）	Gibco	25200072
10cm culture dish	Corning
acutenaculum
Adipogenic differentiation medium	Cyagen biosciences inc.	MUBMX-90031
Alcian Blue	Beyotime Biotechnology
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Alkaline Phosphatase Color Development Kit	Beyotime Biotechnology	C3206
alpha-Minimum essential medium	GE Healthcare HyClone Cell Culture	SH30265.01B
Anti -CollagenII Rabbit pAb	Abcam	ab34712
Antibodies against CD16/CD32
Antifade Mounting Medium with DAPI	Beyotime Biotechnology	P0131
APC anti-mouse/rat CD29 Antibody	biolegend inc	102215
Biosafety cabinet	Esco	AC2-4S8-CN
CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0461-82
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience	Invitrogen	11-0900-85
Centrifuge	cence	L500
Chondrogenesis differentiation medium	cyagen biosciences inc.
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM880
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000
Crystal Violet Staining Solution	Beyotime Biotechnology	C0121
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare HyClone Cell Culture	SH30084.03
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150077
Incubator	Esco	CCL-170B-8
Inverted microscope	olympus	CKX53
Magzol reagent(Trizol reagent)	Magen
micropipettor	Eppendorf
Oil Red O
Osteogenic differentiation medium	cyagen biosciences inc.	MUBMX-90021
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063
Phosphate-buffered saline（1X）	Gibco	20012027
PrimeScript RT Master Kit	TakaRa Bio Inc	RR036A
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P6556
QuickBlock Blocking Buffer	Beyotime Biotechnology	P0260
scissor
SYBR1 Premix	TakaRa Bio Inc
Toluidine Blue	Beyotime Biotechnology
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061