Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
В этой статье представлен метод, который сочетает в себе соблюдение всего костного мозга и цитометрии потока сортировки для изоляции, культивирования, сортировки и выявления мезенхимальных стволовых клеток костного мозга из крысиных челюстей.
Здесь мы представляем эффективный метод изоляции и культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (mBMSCs) в пробирке для быстрого получения многочисленных высококачественных клеток для экспериментальных требований. mBMSCs может быть широко использован в терапевтическом применении в качестве тканевых инженерных клеток в случае черепно-мозговых заболеваний и черепно-челюстно-лицевой регенерации в будущем из-за отличной способности к самообувечиваем и потенциалу дифференциации нескольких линий. Поэтому важно получать mBMSCs в больших количествах.
В этом исследовании костный мозг был смыт из челюсти и первичных mBMSCs были изолированы через весь костный мозг приверженец культивирования. Кроме того, CD29иCD90иCD45и mBMSCs были очищены с помощью флуоресцентной сортировки клеток. Второе поколение очищенных MBMSCs были использованы для дальнейшего изучения и отображается потенциал в дифференциации на остеобласты, адипоциты и хондроциты. Используя эту модель in vitro, можно получить большое количество пролиферативных mBMSCs, которые могут облегчить изучение биологических характеристик, последующую реакцию на микроокнивиронику и другие применения mBMSCs.
Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMSCs) являются негематопоэтическими стволовыми клетками, полученными из костного мозга, которые проявляют сильную способность к пролиферациии потенциал многослойной дифференциации 1,2,3,4. Действительно, BMSCs были рассмотрены в качестве идеального кандидата для костной ткани инженерии и регенерации с тех пор они были обнаружены. В течение многих лет, подвиховый гребень или длинные кости, такие как голени и бедренной кости были наиболее распространенным источником BMSCs для черепно-мозговой регенерации. Однако орафасовые БМС, такие как мандибулярные БМС (МБМКС), демонстрируют некоторые отличия от длинных костных БМСК, такие как различное эмбриональное происхождение и структура развития. Челюсти возникают из нервных клеток гребня нейроэктодермного зародышевого слоя и проходят внутримембранное окостенение, в то время как осевые и аппендикулярные скелеты из мезодерма и проходят эндохонделальное окостенение. Кроме того, клинические наблюдения и экспериментальные исследования на животных постоянно указывают на то, что существуют функциональные различия между орафациальной и подвиховной гребень BMSCs5,6,7,8. Отчеты показали, что BMSCs производные от черепно-мозговой кости, такие как челюсти, челюстной кости и альвеолярной кости выставлены превосходное пролиферации, продолжительность жизни, и дифференциации возможности, чем у из осяных и аппендикулярныхкостей 9. mBMSCs, таким образом, считаются предпочтительными ресурсами для будущего терапевтического применения черепно-мозговых заболеваний, таких как херувим, опухоль челюсти, остеопороз челюстной кости, и дефектпародонтальной ткани 10,11,12. Чтобы понять потенциал лечения в доклинических экспериментах, необходимо установить метод быстрой изоляции и культивирования mBMSCs in vitro.
В этом исследовании, цель состояла в том, чтобы получить очищенные mBMSCs путем присоединения всего костного мозга и потока цитометрии сортировки. Анатомическая морфология крысиной челюсти, четко наблюдаемая с помощью микрокомитной томографии (Micro-CT) и гистологических секций, показала, что трабекулярная кость челюсти была между резцаторным медуллярным пространством и альвеолярной костью. Костный мозг из трабекулярной кости был промыт для получения клеток мсудистого мозга, но клетки, культурные таким образом, не были чистыми mBMSCs и,вероятно,состоят из нескольких типов клеток с неопределенными потенциями и различных линий, таких как клетки из костей, жира иэндотелиальных клеток 13,14. Следующим шагом очистки клеток было особенно важно. Поток цитометрии фильтрует клетки, распознавая сочетание белков клеточной поверхности и был широко принят в обогащении мезенхимальных стволовых клеток. Однородность клеток является основным преимуществом цитометрии потока, но процесс не определяет жизнеспособность клеток и может привести к ограниченной урожайности клеток. В этом исследовании P0 mBMSCs, полученные из всего костного мозга присоединения были отсортированы по цитометрии потока для получения mBMSCs с высокой чистотой и сильной пролиферативной способности.
Это исследование вводит воспроизводимый и надежный протокол для изоляции, культуры и дифференциации крысы мибибулярных BMSCs с использованием сочетания всего костного мозга присоединения и потока цитометрии сортировки. Это надежный и удобный метод для исследователей в смежных областях для использования.
Все экспериментальные процедуры для животных в этой статье были одобрены Комитетом по уходу за животными Шанхайской девятой народной больницы, Медицинской школой Шанхайского университета Цзяо Тонг.
1. Подготовка
2. Изоляция и культивирование крыс mBMSCs
ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные операции должны выполняться на льду как можно больше для поддержания жизнеспособности клеток.
3. Способность к образованию колоний
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг был выполнен, чтобы проверить способность деления mBMSCs. 15 Лет
4. Многолинейная дифференциация MBMSCs
ПРИМЕЧАНИЕ: P2 mBMSCs были использованы для последующих экспериментов, если не описано иное.
5. ПЦР в режиме реального времени
Используя этот протокол, большая часть клеток прилипла к пластине на третий день после первоначальной культуры. Как правило, после дополнительных 3-4 дней культуры, слияние клеток достигло 70 до 80%(рисунок 1B). При сортировке флуоресцентныхклеток,DAPI - CD29- CD90и
Этот протокол описывает метод изоляции BMSCs от крыс челюсти in vitro путем совмещать все присоединение костного мозга и флуоресцентную сортировку клетки, которая просто и надежный путь получить пролиферативные mBMSCs с сильной способностью дифференциации. Этот метод может предварительно оч?...
Все авторы заговорят, что у них нет конфликта интересов.
Благодарим за помощь Лабораторию оцифровке стоматологии и научно-исследовательский центр краниофациальных аномалий Шанхайской девятой народной больницы. Работа этой рукописи поддерживается грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC) (81570950,81870740,81800949), Шанхайский саммит - Плато Дисциплины, фонд SHIPM-mu от Шанхайского института точной медицины, Шанхайская девятая населения больница, Шанхайская школа медицины Университета Цзяо Тонга (JC201809), проект стимулирования высокоуровневой инновационной команды для Медицинской школы Шанхайского университета Цзяо Тонга. И Л.Д. является ученым выдающихся молодых медицинских талантов, Шанхай "Восходящие звезды медицинского таланта" Программа развития молодежи и "Чэнь Син" проекта из Шанхайского университета Цзяотун.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA(1X) | Gibco | 25200072 | |
10cm culture dish | Corning | ||
acutenaculum | |||
Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
Antibodies against CD16/CD32 | |||
Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
Centrifuge | cence | L500 | |
Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
micropipettor | Eppendorf | ||
Oil Red O | |||
Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Phosphate-buffered saline(1X) | Gibco | 20012027 | |
PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
scissor | |||
SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены