Observación microscópica de la dinámica de linfocitos en los parches de Rat Peyer

Resumen

Aquí, describimos un método preciso para recoger linfocitos de conductos torácicos y observar la migración de linfocitos trópicos intestinales en parches de rata Peyer durante 3 horas utilizando fotografía de lapso de tiempo. Esta técnica puede aclarar cómo la dinámica de los linfocitos se ve afectada en condiciones inflamatorias.

Resumen

Los linfocitos ingenuos recirculan de la sangre a los tejidos linfoides bajo condición fisiológica y comúnmente se reconoce como un fenómeno importante en la inmunidad intestinal. El estroma de órganos linfoides secundarios, como los parches de Peyer (PPs) o los ganglios linfáticos mesentericos, es donde los linfocitos ingenuos detectan antígenos. Los linfocitos ingenuos circulan a través del torrente sanguíneo para llegar a ventules endoteliales altos, el portal de entrada en PPs. Se estima que algunos inmunomoduladores influyen en la migración de linfocitos, pero la evaluación precisa de la dinámica de microcirculación es muy difícil, y establecer un método para observar la migración de linfocitos in vivo puede contribuir a la clarificación de los mecanismos precisos. Refinamos el método de recolección de linfocitos del conducto linfático y observando la dinámica detallada de los linfocitos trópicos intestinales en los PPs de rata. Elegimos la microscopía de escaneo láser confocal para observar los PPs de rata in vivo y la grabamos usando fotografía de lapso de tiempo. Ahora podemos obtener imágenes claras que puedan contribuir al análisis de la dinámica de los linfocitos.

Introducción

Los parches de Peyer consisten en cientos de folículos linfoides en la propria lamina del intestino delgado. Los PPs se dividen en folículos, la región interfollicular y los centros germinales ubicados en la parte inferior de los folículos, donde los linfocitos son estimulados por la presentación de antígenos. No hay vasos linfáticos aferentes, y los antígenos invaden la propria lamina del lúmenes intestinales a través de la capa celular epitelial. La región epitelial que cubre folículos linfoides se llama epitelio asociado al folículo, dentro del cual las células M intercaladas especializadas captan antígenos mucosos. Las células M toman antígenos del lado luminal y los antígenos son capturados por células dendríticas y presentados hacia linfocitos ingenuos que fluyen en PPs a través del endotelio de ventules endoteliales altos (HEV)^1. Los PPs desempeñan un papel importante en la inmunidad intestinal y están relacionados con la etapa temprana de la inflamación. Muchas interacciones moleculares implican la entrada de linfocitos a órganos linfoides secundarios (SLOs), incluyendo moléculas de adhesión, quimioquinas^2,3y esfingosina-1-fosfato^4; por lo tanto, hay muchas dianas terapéuticas esperadas. Por lo tanto, observar la dinámica de linfocitos dentro de los PPs nos permite echar un vistazo a la etapa muy temprana de la inflamación y examinar la utilidad de varios fármacos prometedores.

El método aquí se centra en la migración de linfocitos en PPs, que incluye varios procedimientos (cannulación en el conducto torácico⁵ y recolección de linfocitos y observación a largo plazo después de la inyección en linfocitos recogidos). Dado que estos procedimientos son complejos y era difícil ver exactamente cómo se realizaba cada procedimiento en informes anteriores, mencionamos aquí algunos consejos para lograr una observación exitosa. Por ejemplo, la canulación de los tubos en el conducto torácico fue muy difícil, y la tasa de éxito inicial de la canulación fue inferior al 50%. Sin embargo, mejoramos el método y logramos una tasa de éxito superior al 80%. Mencionamos algunos otros consejos en este manuscrito que son necesarios para la observación exitosa para permitir la evaluación cuantitativa de la migración transendotelial de linfocitos en varias condiciones.

En informes anteriores, era difícil entender los cambios tridimensionales con el tiempo, como la inyección intravenosa de tinta india para manchar la estructura vascular de los PPs^6,o el microscopio siendo monofocal^7. En los últimos años, un método observacional utilizando algunos animales transgénicos de proteína de fluorescencia fotoconvertible como ratones Kaede han aclarado los movimientos celulares sistemáticos in vivo⁸. El otro estudio aclaró el apagado independiente CD69 de la salida de linfocitos de PPs^9. Utilizamos microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) debido a su alta capacidad analítica. Ahora podemos obtener fácilmente imágenes de alta resolución y utilizarlas para analizar la dinámica de los linfocitos.

En este informe, demostramos una serie de métodos para evaluar la migración de linfocitos en los PPs. En primer lugar, mostramos métodos refinados de canulación de conductos torácicos para recolectar linfocitos. En segundo lugar, mejoramos los métodos de observación de varias maneras para mantener órganos objetivos siempre que sea posible bajo observación microscópica, lo que nos permite obtener imágenes de alta calidad durante 3 horas. En tercer lugar, cuantificamos los movimientos celulares de la migración de linfocitos para evaluar los efectos de algunos medicamentos. Estos protocolos modificados contribuirán al desarrollo de evaluaciones de inmunología mucosa.

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Protocolo

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Investigación Animal del Colegio Médico de Defensa Nacional (nº 16058). Los animales se mantuvieron en la comida de laboratorio estándar (CLEA Japan Inc, Tokio, Japón). Los animales de laboratorio fueron tratados de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Recolección y separación de linfocitos

NOTA: Dado que los linfocitos deben estar frescos y no pueden almacenarse, deben ser recogidos de ratas para cada experimento. Además, los linfocitos trópicos intestinales deben recogerse directamente del conducto torácico donde circulan. Se espera que todos los procedimientos se completen en un plazo de 6 horas, y todos los instrumentos, guantes y superficies estén limpios. Con el fin de mantener a los animales en un estado fisiológicamente estable, todos los salinas y otros fluidos utilizados en el experimento deben mantenerse calientes.

1. Formar un tubo de canulación (1 mm de diámetro) como una curva de heparina (un radio de unos 5 mm) después de sumergirlo en agua caliente (aproximadamente 80-90 °C) y fijarlo a una placa de plástico utilizando cinta adhesiva durante unas horas de antelación.
2. Anestesiar una rata Wistar macho (8-12 semanas) con inyección intraperitoneal de una mezcla de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) y Betulphar (2,5mg/kg) y cortar el vello corporal del abdomen usando un cortapelos. Retire el cabello firmemente después de afeitarse para que el cabello no entre en la cavidad abdominal.
3. Después de confirmar que la profundidad estable de la anestesia requerida para el procedimiento se obtiene mediante pellizco de dedo del pie, hacer una incisión con tijeras quirúrgicas horizontalmente desde la línea media hasta el área subcostal izquierda. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos en el peritoneo parietal observando los vasos bajo la luz.
4. Envuelva el estómago con gasa húmeda y mueva el estómago suavemente hacia la derecha fuera del cuerpo para revelar los órganos retroperitoneales. Inserte una muesca entre los músculos erectores de la columna vertebral y el tejido adiposo usando tijeras quirúrgicas y sepámelas sin rodeos con los dedos.
5. Retire cuidadosamente el tejido conectivo alrededor del conducto torácico. El exceso de tejido conectivo aumenta con la edad. Exponga el conducto torácico desde justo debajo de los crus izquierdos del diafragma caudalmente hasta que se visibilizó una longitud de 20 mm del conducto torácico. Separe suavemente las adherencias entre el conducto torácico y la aorta utilizando pinzas de precisión o hisopos de algodón húmedo.
   1. Realice este proceso cuidadosamente porque algunas ratas tienen arterias ramificadas de la arteria abdominal cruzando sobre el conducto torácico o un conducto torácico corto debido a una posición más alta del plexo linfático (pequeños conductos torácicos que se propagan como telarañas). Evite el contacto innecesario con el conducto torácico para evitar inducir edema.
6. Aplicar una ligadura por una cuerda (3-0 de seda) en el conducto torácico justo debajo de los crus izquierdos del diafragma. El conducto torácico caudal se distete.
7. Hacer un agujero (5 mm de diámetro) en la pared abdominal apuñalando el filo de las tijeras quirúrgicas, pasar el tubo de canulación curvada de horquilla, y ligar el tubo en el músculo iliopsoas en un momento dado. Llene el tubo de canulación con solución salina normal que contenga 10 heparinaS/ml.
8. Después de colocar una cuerda (3-0 de seda) debajo del conducto torácico distecido, apuñale el conducto torácico con el borde de corte afilado de un tubo de canulación, lo cannulate hacia la cola de unos 5 mm y ligar el conducto torácico con tubo de canulación para su fijación.
9. Para suministrar solución salina para evitar la deshidratación, cree un agujero (3 mm de diámetro) en la pared anterior del átrum del estómago utilizando pinzas de precisión y pase el tubo de silicio (2 mm de diámetro) al duodeno a través del anillo pilórico. Después de coser una herida y mantener a los animales en las jaulas de Bollman, comience a infundir solución salina cargada de azúcar en el duodeno de cada rata desde el tubo de silicio a un caudal de 3 ml/h. Cubra toda la jaula con una toalla de papel para mantenerla caliente.
10. Fije el tubo de canulación al agujero en el centro de la tapa de un tubo cónico de 50 ml sobre hielo que contenga 6 heparina U/ml, 10% suero bovino fetal y MEDIO RPMI 1640 (pH 7.4; ver la tabla de materiales) y recoger linfocitos de conducto torácico (TDL) en hielo. Tenga cuidado de no entrar en contacto con la punta del tubo a la pared del tubo cónico para evitar la oclusión del tubo cannulado debido a la formación de coágulos de fibrina dentro del tubo. El líquido linfático (aproximadamente 20 ml) incluyendo aproximadamente 1.0 x 10⁸~ 10⁹ linfocitos se puede obtener en 6 horas. Para obtener los linfocitos bajo anestesia completa, se controla el plano de anestesia y se observa adecuadamente el flujo linfático. Los mismos anestésicos se añaden a la misma dosis unas 3 horas después de que las ratas son puestas en la jaula de Ballman para obtener anestesia profunda continuamente durante 6 horas.

2. Etiquetado de linfocitos con éster de diacetato de carboxofluorescetina (CFDSE)

1. Disolver CFDSE (Tabla de Materiales) en sulfóxido de dimetil (DMSO) a 15,6 mM (500 μg de CFDSE disuelto en 60 μL de DMSO).
2. Incubar linfocitos (1 x 10⁸~10⁹⁾en 50 ml de RPMI 1640 con 50 μL de solución CFDSE durante 30 min a 37 °C como se describió anteriormente¹⁰.

3. Configuración experimental para estudios microvasculares

1. Ratas receptoras de anestesia (8-12 semanas) con inyección intraperitoneal de una mezcla de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) y Betulphar (2,5mg/kg) y confirmar la profundidad de la anestesia por pellizco de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos. Moje el abdomen antes de acicalar la piel para minimizar la contaminación del cabello. A continuación, abra el abdomen de la rata Wister receptora a través de una incisión de línea media.
2. Coloque una rata en una placa portátil de acero inoxidable (aproximadamente 120 x 300 mm) con un agujero rectangular alrededor del centro cubierto con un tobogán de vidrio (24 x 50 mm). Elija unos 10 cm del segmento ileal, incluidos los PPs para la observación.
3. Mantenga el intestino lo más caliente posible y húmedo con solución salina amortiguada por fosfato (PBS) calentada a 37 °C. Remoje la gasa que se utiliza para cubrir el intestino delgado con PBS.
4. Mientras que dar anestesia continua con 2 % isoflurano (ver tabla de materiales), poner la diapositiva en el escenario del microscopio y elegir áreas adecuadas para la observación de la microcirculación en PPs donde algunos HEV están corriendo a través de la serosa. Rango de PPs en tamaño; los más grandes son adecuados para la observación de la microcirculación utilizando CLSM. El intestino delgado no es recto en algunos lugares; un segmento recto de al menos 2 cm de largo sin ninguna tensión es adecuado para la observación.
5. Cubra el segmento intestinal adyacente y la mesentería con algodón absorbente empapado con PBS. Coloque el segmento intestinal entre dos bolas de algodón enrolladas y colóquelo lo más lejos posible del cuerpo de la rata para evitar que vibre los latidos del corazón y la respiración de la rata.
6. Usando una jeringa de 1 ml, inyecte lentamente (más de 1 min) TDL etiquetados con CFSE (1 x 10⁸ células) en la vena yugular de las ratas receptoras. Una inyección intravenosa rápida puede influir en la circulación sistémica.

4. Microcirculación de linfocitos

1. Supervise continuamente los TDLs en la microvasculatura de los PPs utilizando CLSM y grabe en un ordenador durante 3 horas utilizando fotografías de lapso de tiempo a intervalos de 30 s. La profundidad de la serosa al HEV de los PPs es de aproximadamente 25 μm, lo que permite la observación de los vasos linfáticos estroboscópicos y capilares a una profundidad de 30 μm.
2. Inyectar Texas Red-dextran (25 mg/kg) en la vena yugular de cada rata receptora para manchar el torrente sanguíneo y Hoechest 33342 (5 mg/kg) para manchar los núcleos celulares.
3. (Opcional) Para cuantificar la dinámica de los linfocitos, defina los linfocitos que se adhieren a los HEV durante más de 30 segundos como "linfocitos adhesivos" y linfocitos que emigran de hevs a estroboscómicos como "linfocitos migratorios". A continuación, calcule el porcentaje medio de migración (linfocitos migratorios / linfocitos adhesivos + linfocitos migratorios) por campo de visión (aproximadamente 0,3 mm^2).

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Resultados

Recolección de linfocitos de la linfa
Para preparar la rata para la canulación del conducto torácico, haga una incisión en el tenso conducto torácico como se muestra en la Figura 1 y luego mantenga a la rata en la jaula de un Bollman como se muestra en la Figura 2.

Cuando los linfocitos están bien recogidos, podemos obtener alrededor de 20 ml/6 h de líquido linfático que contiene aproximadamente 10⁷

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Discusión

Aquí describimos un protocolo para recolectar linfocitos ingenuas de intestino y trópicos y observar su migración en PPs de ratas. Estos procedimientos pueden revelar cómo los linfocitos se mueven en la microvasculatura de los PPs y permiten comparar visualmente su dinámica bajo una condición normal o medicada. La observación directa de estas dinámicas tiene mucho mérito para obtener una pista de modificación inmunológica por parte de algunos fármacos, aunque el período observacional se limita a sólo unas p...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A1R+	Nikon		Comfocal Laser Scanning Microscopy
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester	Thermo Fisher Scientific	C1157
Hoechest 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Isoflurane	Wako Pure Chemical Industries	099-06571
RPMI 1640 medium	GIBCO	11875093
Texas Red–dextran	Thermo Fisher Scientific	D1863