Микроскопическое наблюдение за динамикой лимфоцитов в патчах Крысы Пейера

Резюме

Здесь мы описываем точный метод сбора лимфоцитов грудного протока и наблюдения за миграцией кишечных лимфоцитов в патчах крысы Пейера в течение 3 часов с помощью замедленной фотографии. Этот метод может прояснить, как динамика лимфоцитов страдают при воспалительных условиях.

Аннотация

Наивные лимфоциты рециркуляции из крови в лимфоидные ткани в физиологическом состоянии, и это обычно признается в качестве важного явления в кишечнике иммунитета. Строма вторичных лимфоидных органов, таких как патчи Пейера (PPs) или мезентерические лимфатические узлы, где наивные лимфоциты смысле антигенов. Наивные лимфоциты циркулируют через кровоток, чтобы достичь высоких эндотелиальных венул, портал входа в PPs. Некоторые иммуномодуляторы, по оценкам, влияют на миграцию лимфоцитов, но точная оценка динамики микроциркуляции очень сложна, и создание метода наблюдения за миграцией лимфоцитов in vivo может способствовать уточнению точных механизмов. Мы усовершенствовали метод сбора лимфоцитов из лимфатического протока и наблюдения за детальной динамикой кишечных лимфоцитов в крысиных PPs. Мы выбрали конфокалиптальный лазерного сканирования микроскопии для наблюдения крыс PPs in vivo и записал его с помощью замедленной фотографии. Теперь мы можем получить четкие изображения, которые могут способствовать анализу динамики лимфоцитов.

Введение

Патчи Пейера (PPs) состоят из сотен лимфоидных фолликулов в ламина проприя тонкой кишки. PPs разделены на фолликулы, межфолликулярной области, и зародышевых центров, расположенных в нижней части фолликулов, где лимфоциты стимулируются антиген презентации. Есть нет афферентных лимфатических сосудов, и антигены вторгаются в ламина проприя из кишечного люмена через эпителиальный слой клеток. Эпителиальная область, покрывающая лимфоидные фолликулы, называется связанный с фолликулом эпителий, в рамках которого специализированные перемежаются M-клетки поглощения слизистых антигенов. M клетки принимают в антигены с люминесцентной стороны и антигены затем захвачены дендритных клеток и представлены к наивным лимфоцитов, которые входят в PPs через эндотелий высоких эндотелиальных венул (HEVs)¹. PPs играют важную роль в кишечном иммунитете и связаны с ранней стадией воспаления. Многие молекулярные взаимодействия включают вход лимфоцитов во вторичные лимфоидные органы (СЛО), включая молекулы адгезии,^{хемокины 2,3}и сфингозин-1-фосфат^4; таким образом, существует много ожидаемых терапевтических целей. Таким образом, наблюдение за динамикой лимфоцитов в PPs позволяет нам мельком увидеть очень раннюю стадию воспаления и изучить полезность нескольких перспективных препаратов.

Метод здесь фокусируется на миграции лимфоцитов в PPs, которая включает в себя несколько процедур (каннуляция в грудной^{проток 5 и} сбор лимфоцитов и долгосрочное наблюдение после инъекции в собранные лимфоциты). Поскольку эти процедуры являются сложными и было трудно понять, как именно каждая процедура была выполнена в предыдущих докладах, мы упомянули здесь несколько советов для достижения успешного наблюдения. Например, канюляция труб в грудной проток была очень трудной, а первоначальный показатель успеха канюляции был менее 50%. Тем не менее, мы усовершенствовали метод и достигли успеха, превышающего 80%. Мы упомянули некоторые другие советы в этой рукописи, которые необходимы для успешного наблюдения, чтобы дать количественную оценку трансендотелиальной миграции лимфоцитов при нескольких условиях.

В предыдущих докладах, было трудно понять трехмерные изменения с течением времени, такие как внутривенные инъекции чернил Индии, чтобы испачкать^{сосудистую структуру}PPs 6 , или микроскоп, будучи монофокальные⁷. В последние годы, наблюдательный метод с использованием некоторых фотоконвертируемых флуоресценции белка трансгенных животных, таких как мышей Kaede уточнили систематические клеточные движения in vivo⁸. Другое исследование уточнило CD69 независимое отключение лимфоцитов выход из PPs⁹. Мы использовали конфокальцированную микроскопию лазерного сканирования (CLSM) из-за ее высокой аналитической способности. Теперь мы можем легко получить изображения с высоким разрешением и использовать их для анализа динамики лимфоцитов.

В этом докладе мы продемонстрировали ряд методов оценки миграции лимфоцитов в PPs. Во-первых, мы показали усовершенствованные методы каннуляции грудного протока для сбора лимфоцитов. Во-вторых, мы усовершенствовали методы наблюдения несколькими способами поддержания объективных органов, когда это возможно, под микроскопическим наблюдением, что позволило нам получить высококачественные изображения в течение 3 часов. В-третьих, мы количественно клеточной миграции лимфоцитов для оценки последствий некоторых лекарств. Эти измененные протоколы будут способствовать разработке мукосал иммунологических оценок.

протокол

Экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по исследованиям животных Национального оборонного медицинского колледжа (No 16058). Звери были сохранены на стандартной лабораторной чау (CLEA Japan Inc, Токио, Япония). Лабораторные животные лечились в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения.

1. Сбор и разделение лимфоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку лимфоциты должны быть свежими и не могут храниться, они должны быть собраны из крыс для каждого эксперимента. Кроме того, кишечные тропные лимфоциты должны быть собраны непосредственно из грудного протока, где они циркулируют. Ожидается, что все процедуры будут завершены в течение 6 часов, а все инструменты, перчатки и поверхности будут чистыми. Для того, чтобы держать животных в физиологически стабильном состоянии, все солевые и другие жидкости, используемые в эксперименте, должны быть теплыми.

1. Сформив канкуляционную трубку (диаметр 1 мм) как кривую гепарина (радиус около 5 мм) после погружения в горячую воду (около 80-90 градусов по Цельсию) и зафиксирует ее на пластиковой доске с помощью клейкой ленты на несколько часов вперед.
2. Обезболить самца крысы Wistar (8-12 недель) с внутриперитонеальной инъекцией смеси мидазолама (2 мг/кг), Домитора (0,15 мг/кг) и Белульфара (2,5 мг/кг) и подстричь волосы на теле живота с помощью ножницы для волос. Удалите волосы твердо после бритья, так что волосы не попадают в брюшную полость.
3. После подтверждения того, что стабильная глубина анестезии, необходимая для процедуры, получена с помощью щепотки, сделайте разрез хирургическими ножницами горизонтально от средней линии до левой подреберной области. Будьте осторожны, чтобы не повредить кровеносные сосуды в теменной брюшной полы, наблюдая за сосудами под светом.
4. Оберните желудок влажной марлей и аккуратно переместите желудок вправо за пределами тела, чтобы выявить ретроперитонеальные органы. Вставьте выемку между мышцами позвоночника и жировой ткани с помощью хирургических ножниц и прямо отделить их пальцами.
5. Аккуратно сдирайте соединительной ткани вокруг грудного протока. Избыток соединительной ткани увеличивается с возрастом. Разоблачить грудной проток из чуть ниже левой крест диафрагмы caudally до 20 мм длина грудного протока была видна. Аккуратно отделить спайки между грудным протоком и аортой с использованием точного пинцета или мокрых ватных тампонов.
   1. Выполните этот процесс тщательно, потому что некоторые крысы артериолы ветвясь от брюшной артерии пересечения через грудной проток или короткий грудной проток из-за более высокого положения лимфатического сплетения (малые грудные протоки распространяется как паутина). Избегайте ненужного контакта с грудным протоком, чтобы избежать индуцирования отеков.
6. Нанесите лигатуру на струну (3-0 шелка) на грудной проток прямо под левым крестом диафрагмы. Хвостовой грудной проток становится разтянутым.
7. Сделать отверстие (5 мм диаметром) в брюшной стенке, колоть передний край хирургических ножниц, пройти шпильки изогнутые трубки канюляции, и ligate трубки на мышце iliopsoas в одной точке. Заполните каннуляционную трубку нормальным солевым раствором, содержащим гепарин 10 U/mL.
8. После размещения строки (3-0 шелка) под разтянутый грудной проток, удар грудной проток с резко сократить край канюляционной трубки, cannulate его к хвосту около 5 мм, и ligate грудной проток с канюляционной трубки для фиксации.
9. Чтобы поставлять солевой раствор для предотвращения обезвоживания, создайте отверстие (диаметр 3 мм) на передней стенке желудочного стекла с помощью точного пинцета и перейдите кремниевую трубку (2 мм в диаметре) в двенадцатиперстную часть через пилорическое кольцо. После зашивания раны и поддержания животных в клетках Боллмана, начать вливать сахар груженый солевой раствор в двенадцатиперстной клетке каждой крысы из кремниевой трубки со скоростью потока 3 мл/ч. Обложка всей клетке с бумажным полотенцем, чтобы держать его в тепле.
10. Зафиксируйте каннуляционную трубку к отверстию в центре крышки конической трубки 50 мл на льду, содержащей 6 Гепарин U/mL, 10% сыворотки крупного рогатого скота плода и RPMI 1640 средний (рН 7.4; см. таблицу материалов), и соберите на льду лимфоциты грудного протока (TDL). Будьте осторожны, чтобы не связаться с кончиком трубки к стене конической трубки, чтобы предотвратить канюле-трубку окклюзии из-за образования сгустка фибрина внутри трубки. Лимфатическая жидкость (около 20 мл), в том числе около 1,0 х 10^{8 х}10^{9 лимфоцитов} могут быть получены в 6 часов. Для получения лимфоцитов под полной анестезией контролируется плоскость анестезии и надлежащим образом наблюдается лимфоток. Те же анестетики добавляются в той же дозе примерно через 3 часа после того, как крысы помещены в клетку Баллмана, чтобы получить глубокую анестезию непрерывно в течение 6 часов.

2. Лимфоцит маркировки с carboxyfluorescein диацетат succinimidyl эстер (CFDSE)

1. Растворите CFDSE(Таблица материалов)в диметилсульфоксиде (DMSO) до 15,6 мМ (500 мкг CFDSE, растворенного в 60 МКЛ ДМСО).
2. Инкубировать лимфоциты (1 х^{10 8х 10 9}) в 50 мл RPMI 1640 с 50 йл раствора CFDSE в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию, как описано^{ранее 10}.

3. Экспериментальная установка для микрососудистых исследований

1. Анестезировать крыс-реципиентов (8-12 недель) с внутриперитонеальной инъекцией смеси мидазолам (2 мг/кг), Домитор (0,15 мг/кг) и Betulphar (2,5 мг/кг) и подтвердить глубину анестезии с помощью щепотки. Влажный живот перед уходом меха, чтобы свести к минимуму загрязнение волос. Затем откройте брюшную полость реципиента Wister крысы через разрез средней линии.
2. Положите крысу на портативную пластину из нержавеющей стали (около 120 х 300 мм) с прямоугольным отверстием вокруг центра, покрытого стеклянной горкой (24 х 50 мм). Выберите около 10 см сегмента ileal, включая PPs для наблюдения.
3. Держите кишечник как можно более теплым и влажным с фосфатом буферного солевого раствора (PBS) нагревается до 37 градусов по Цельсию. Замочите марлю, которая используется для покрытия тонкой кишки с PBS.
4. Давая непрерывную анестезию с 2% изофлюраном (см. таблицу материалов), положите слайд на сцену микроскопа и выберите подходящие области для наблюдения микроциркуляции в PPs, где некоторые HEVs проходят через серозу. PPs варьируются в размерах; более крупные из них подходят для наблюдения за микроциркуляцией с использованием CLSM. Тонкий кишечник не прямо в местах; прямой сегмент длиной не менее 2 см без напряжения подходит для наблюдения.
5. Обложка смежных кишечного сегмента и мезентерии с абсорбентом хлопка пропитанной PBS. Поместите сегмент кишечника между двумя свернутых ватных шариков и распоить его как можно ближе от тела крысы, чтобы предотвратить его от вибрирует сердцебиение крысы и дыхание.
6. Используя шприц 1 мл, медленно впрыскивает (более 1 мин) TDLs с маркировкой CFSE (1 x 10^{8 клеток)} в яремную вену крыс-реципиентов. Быстрая внутривенная инъекция может повлиять на системное кровообращение.

4. Микроциркуляция лимфоцитов

1. Непрерывно контролировать TDLs в микроваскулатуре PPs с помощью CLSM и записывать на компьютере в течение 3 часов с использованием замедленной фотографии с интервалом 30 с. Глубина от серозы до HEV PPs составляет около 25 мкм, что позволяет наблюдение стромы и капиллярных лимфатических сосудов на глубину 30 мкм.
2. Введите Техас Красно-декстран (25 мг/кг) в яремной вены каждого получателя крысы, чтобы окрашивать кровоток и Hoechest 33342 (5 мг/кг), чтобы испачкать ядра клеток.
3. (По желанию) Для количественной оценки динамики лимфоцитов, определить лимфоцитов, придерживающихся HEVs более 30 секунд, как "клей лимфоцитов" и лимфоцитов эмиграции из HEVs в Строма, как "мигрирующих лимфоцитов". Затем вычислите средний процент миграции (мигрирующие лимфоциты / клеевые лимфоциты и мигрирующие лимфоциты) на поле зрения (примерно 0,3^{мм 2).}

Результаты

Сбор лимфоцитов из лимфы
Чтобы подготовить крысу к каннуляции грудного протока, сделайте разрез в напряженном грудном протоке, как показано на рисунке 1, а затем поддерживать крысу в клетке Боллмана, как показано на рисунке 2.

Ко?...

Обсуждение

Здесь мы описали протокол для сбора наивных кишечных тропических лимфоцитов и наблюдения за их миграцией в крысиных PPs. Эти процедуры могут выявить, как лимфоциты движутся в микроваскулатуре PPs и дать возможность визуально сравнить их динамику при нормальном или лекарственном состоян?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A1R+	Nikon		Comfocal Laser Scanning Microscopy
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester	Thermo Fisher Scientific	C1157
Hoechest 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Isoflurane	Wako Pure Chemical Industries	099-06571
RPMI 1640 medium	GIBCO	11875093
Texas Red–dextran	Thermo Fisher Scientific	D1863