Grabaciones de electrocardiograma en ratones anestesiados usando plomo II

Resumen

Presentamos un protocolo ECG que es técnicamente fácil, barato, rápido y asequible en ratones pequeños, y se puede realizar con mayor sensibilidad. Sugerimos este método como un enfoque de cribado para el estudio de agentes farmacológicos, modificaciones genéticas y modelos de enfermedades en ratones.

Resumen

El electrocardiograma es una herramienta valiosa para evaluar el sistema de conducción cardíaca. La investigación en animales ha ayudado a generar información genética y farmacológica novedosa sobre el electrocardiograma. Sin embargo, realizar mediciones de electrocardiogramas en animales pequeños in vivo, como ratones, ha sido un desafío. Para ello, utilizamos un método de registro de electrocardiograma en ratones anestesiados con muchas ventajas: es un procedimiento técnicamente simple, es barato, tiene un tiempo de medición corto y es asequible, incluso en ratones jóvenes. A pesar de las limitaciones con el uso de anestesia, las comparaciones entre el control y los grupos experimentales se pueden realizar con mayor sensibilidad. Tratamos ratones con agonistas y antagonistas del sistema nervioso autónomo para determinar la validez de este protocolo y comparamos nuestros resultados con informes anteriores. Nuestro protocolo ECG detectó aumento de las frecuencias cardíacas y los intervalos QTc en el tratamiento con atropina, disminución de las frecuencias cardíacas e intervalos QTc después del tratamiento con carbachol, y mayores frecuencias cardíacas e intervalos QTc con isoprenalina, pero no notó ningún cambio en los parámetros de ECG en la administración de propranolol. Estos resultados son soportados por informes anteriores, lo que confirma la fiabilidad de este protocolo ECG. Por lo tanto, este método se puede utilizar como un enfoque de cribado para realizar mediciones de ECG que de otro modo no se intentarían debido a los altos costos y dificultades técnicas.

Introducción

El electrocardiograma (ECG), una prueba que mide la actividad eléctrica de los latidos del corazón, es una herramienta valiosa para evaluar el sistema de conducción cardíaca. Los parámetros medidos por un ECG incluyen frecuencia cardíaca, intervalo PR, duración QRS e intervalo QT. En resumen, el intervalo PR corresponde al tiempo necesario para que un impulso eléctrico viaje desde el nodo del seno auricular a través del nodo auriculoventricular hasta las fibras de Purkinje; La duración de QRS es el tiempo para que la despolarización ventricular se produzca a través del sistema Purkinje y el miocardio ventricular; y el intervalo QT es la duración de la repolarización ventricular.

Las grabaciones de ECG en ratones han ayudado a los investigadores a examinar la función cardíaca y determinar los mecanismos fisiológicos y fisiopatológicos de los fenotipos cardíacos, como la arritmia, la fibrilación auricular y la insuficiencia cardíaca. La mayoría de las investigaciones cardiovasculares han implicado estudios en modelos de ratón genéticamente diseñados. A menudo es difícil obtener datos significativos sobre las grabaciones de ECG de ratones pequeños que han sido manipulados genéticamente.

Existen varios métodos para realizar ECG en ratones¹. Los estudios sugieren que las grabaciones de ECG en animales conscientes son preferidas sobre los animales anestesiados cuando sea posible ya que los efectos de la anestesia en la función cardíaca han sido bien establecidos². Dos protocolos que registran ECG en ratones conscientes son de la nota¹. El sistema de radiotelemetría ECG es el estándar de oro para la monitorización continua a largo plazo del ECG en ratones conscientes^1,3. A pesar de su fuerza en ser grabado en un estado consciente, las mediciones de ECG acopladas a radiotelemetría tienen varias limitaciones, incluyendo el alto gasto para la configuración y para el implante, su requisito de un operador altamente experimentado, un período de estabilización de más de 1 semana, su necesidad de ratones grandes (> 20 g), y la adquisición de una sola ventaja de grabación ECG¹. Otro sistema que utiliza electrodos conductores del tamaño de una pata incrustados en una plataforma permite grabaciones de ECG en ratones conscientes sin anestesia o implantes^1,,4. Este sistema no invasivo es un método alternativo en situaciones en las que los sistemas de radiodametría no están disponibles ya que tiene muchas ventajas: sin necesidad de tratamiento quirúrgico, sin necesidad de anestesia, bajo coste por ratón (sólo la configuración inicial es costosa), poco tiempo de medición, y asequibilidad de neonatos^1,,4. La principal desventaja de este sistema es que no es adecuado para el monitoreo continuo a largo plazo¹.

Aquí introducimos otro método de registro de ECG barato, simple y rápido en ratones anestesiados y demostramos su validez y sensibilidad realizando un ECG después del bloqueo/estimulación autonómica del sistema de conducción cardíaca. Sugerimos este método de ECG para el cribado de los efectos de agentes farmacológicos, modificaciones genéticas y modelos de enfermedades en ratones.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el comité local para el cuidado y uso de animales de laboratorio, Universidad Kyung Hee (número de licencia: KHUASP(SE)-18-108) y se ajustaron a la Guía de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Animales experimentales

1. Mantener todos los ratones (39 ratones, Balb/c, machos, 7-u20129 semanas de edad) en una instalación libre de patógenos según la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
2. Mantenga a los ratones en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a temperatura constante con acceso libre a alimentos y agua.

2. Preparación de anestésicos

NOTA: El tribromoetanol se utiliza sobre las combinaciones de ketamina e isoflurano, basado en la estabilidad de la frecuencia cardíaca y la reproducibilidad de la ecocardiografía en ratones tribromoetanol-anestesiados^1,5,6

1. Hacer una solución de stock de 2,2,2-tribromoetanol a una concentración de 1 g por 1 ml de alcohol amilo terciario. Calentar a 40oF201245oC durante 24 h. Almacenar a 4oC durante 12 meses.
2. Para la solución de trabajo, diluir 0,5 ml de solución en stock en 19,5 ml de solución salina (0,9% NaCl) a 25 mg/ml. Calentar a 40oF201245oC durante 1 h. Almacenar a 4oC durante 1 mes.

3. Configuración del sistema ECG

1. Asegúrese de configurar el sistema de forma que no haya ruido ni vibración en un radio de 2 m, ya que las señales de ECG en un ratón son sensibles al ruido y el movimiento del medio ambiente.
2. Prepare la configuración de hardware: un sistema de adquisición de datos, un bioamplificador y un ordenador que se instala con un software de análisis de datos ECG.
   1. Conecte el sistema de adquisición de datos a la red eléctrica (CA) mediante el cable de alimentación.
   2. Conecte el sistema de adquisición de datos al ordenador mediante un cable USB.
   3. Conecte la salida de señal en el panel posterior del bioamplificador a una entrada analógica en el panel frontal del sistema de adquisición de datos mediante un cable.
   4. Conecte la salida I²C del sistema de adquisición de datos a la entrada I²C del bioamplificador utilizando el cable I²C.
   5. Conecte el cable bioamplificador de 3 tiempos a la toma de entrada de 6 pines en el panel frontal del bioamplificador.
   6. Encienda el sistema de adquisición de datos con el interruptor del panel posterior.
      NOTA: En resumen, las señales se amplifican a través de un bioamplificador y se registran utilizando un sistema computarizado de adquisición y análisis de datos con los siguientes ajustes de canal: frecuencia de muestreo de 2 k/s, rango de 20 mV y ajuste de filtro de paso bajo de 200 Hz.
3. Abra el programa de software de análisis y configurelo para la adquisición de datos ECG.
   1. Ir a Configuración ? Ajustes de canal. Establezca la Frecuencia de muestreo en 2 k/s. Establezca el Rango en 20 mV. Ajuste el amplificador de entrada a 200 Hz de paso bajo.
   2. Ir a Análisis de ECG ( ECG Analysis) Ajustes ECG. Seleccione "Ratón" en los ajustes Detección y Análisis.
   3. En el panel Promedio, elija concatenar N (por ejemplo, 4 latidos o 60 s) ciclos cardíacos consecutivos en una sola señal promedio para Vista de promedio y Vista de tabla.
   4. En el panel QTc, seleccione el método "Bazett", que se define como el valor corregido por frecuencia cardíaca del intervalo QT: QTc - QT / (RR/100)^0,5, intervalo RR a 60 / frecuencia cardíaca⁷.

4. Medición de ECG

1. Coloque un ratón en una escala de precisión y registre su peso.
2. Inducir la anestesia en el ratón mediante la inyección intraperitoneal (i.p.) de una solución de trabajo de tribromoetanol (18 ml de solución de trabajo por kg de peso corporal (p.v.)).
3. Coloque un ratón anestesiado en posición supina. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado (menos de 2 min).
4. Inserte los electrodos con agujas de acupuntura por vía subcutánea en las extremidades delanteras derecha e izquierda y la extremidad posterior izquierda de acuerdo con el esquema de ECG de plomo II y fijelos con cinta (Figura 1). Asegúrese de que la profundidad y la posición de los electrodos insertados sean consistentes a lo largo de los experimentos.
5. Conecte los otros extremos de los electrodos haciendo clic en los tres conectores de presión en el otro extremo de los cables de plomo del cable bioamplificador de 3 tiempos.
6. Inyectar drogas (i.p.) 3 min después de la entrega de los anestésicos (Figura 2).
7. Comience a grabar el ECG 10 min después de inyectar anestésicos. Una vez completada la grabación, utilice los datos del ECG de 12 a 17 minutos después de la inyección de anestésicos para el análisis.
8. Al final de la sesión de grabación de ECG, retire cuidadosamente los electrodos.

5. Análisis de datos de ECG

1. Ir a Análisis de ECG ( ECG Analysis) Promediando Ver y asegurarse de que el software identifica correctamente el inicio y el final de la onda P, el complejo QRS y la onda T en ritmos individuales. Si es necesario, la corrección manual de estas ondas e intervalos es posible moviendo los cursores extraviados a las posiciones adecuadas.
   NOTA: Como se muestra en la Figura 3A,el intervalo PR abarca el inicio de la onda P hasta el del complejo QRS (en su mayoría falta onda Q en un ECG de ratón). La duración de QRS se extiende desde el inicio de la onda Q (principalmente una onda R en un ECG de ratón) hasta el final de la onda S. El intervalo QT comprende el inicio de la onda Q (principalmente la onda R en un ECG del ratón) hasta el final de la onda T. Tenga en cuenta la duración más corta y la ausencia de una onda Q y un segmento ST en el ECG del ratón en relación con el ECG humano⁸.
2. Ir a Análisis de ECG ( ECG Analysis) Vista de tabla y seleccione los datos de ECG identificados correctamente comprobando los ritmos individuales en la ventana Vista de promedio.
   NOTA: La Figura 3 muestra varios ejemplos de señales ECG reales del ratón. La Figura 3A representa una señal de tipo salvaje normal que se ha identificado correctamente con respecto a la onda P, el complejo QRS y la onda T. La selección computarizada de ondas PQRS puede incurrir en extravíos erróneos erróneos, como en la Figura 3B una señal de tipo salvaje normal que extravte el inicio de la onda P. En la Figura 3C una señal ECG que extravia el final del complejo QRS, lo que resulta en una sobreestimación de la duración de QRS. En la Figura 3D una señal ECG que extravia el final del complejo QRS, lo que resulta en la subestimación del complejo QRS debido a la ambigua onda T y la Figura 3E una señal ECG con una onda T no identificable. Sin exclusiones ni correcciones manuales, los intervalos PQRS pueden superarse o subestimarse. Asegúrese de seleccionar las señales ECG que se han identificado correctamente y las señales que no se pierdan los picos objetivo. Por consiguiente, estos casos, incluidos B, C, D y E(Figura 3), se excluyen para estimar con precisión los parámetros del ECG en general.
3. Seleccione los datos de ECG de interés en la Vista de tabla y cópielos/pegue en un archivo de hoja de cálculo.

6. Análisis estadístico

1. Realice el análisis estadístico utilizando un programa de estadísticas. Analizar los datos con las condiciones experimentales cegadas. Realizar la prueba tde Student y Mann-Whitney U-test para comparaciones de 2 grupos. Los números de cada figura indican el número de ratones que se utiliza para cada grupo. Reporte los resultados como media de SEM.
2. Considere que las diferencias con p < 0.05 por U-test son estadísticamente significativas: *, p < 0.05; **, p < 0.01; y ***, p < 0.005 frente a los controles respectivos.

Resultados

Experimentos farmacológicos

Para determinar si nuestra medición de ECG no invasiva refleja la influencia de la modulación autonómica en el sistema de conducción cardíaca, los ratones Balb/c normales fueron desafiados con agonistas y antagonistas del sistema nervioso autónomo (ANS). La atropina y el carbachol se utilizaron para provocar el bloqueo autonómico parasimpático y la estimulación, respectivamente, mientras que propranolol e isoprenalina se administraron para...

Discusión

Hay varios pasos críticos en el protocolo. El entorno circundante debe estar libre de ruido y vibraciones. Los electrodos ECG deben insertarse debajo de la piel de forma estable y consistente de los cuales el paso de inserción requiere experimentos preliminares hasta que el investigador tenga experiencia técnicamente. Además, el anestésico debe prepararse y almacenarse adecuadamente y utilizarse a la dosis adecuada. Por último, las ondas PQRS deben ubicarse adecuadamente en latidos de ECG individuales en la ventana...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G	anesthetics, Avertin
Animal	Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan		Balb/c mice, male, aged 7-9 weeks
Atropine	Sigma-Aldrich	A0123	parasympathetic antagonist
BioAmp	AD Instruments, Bella Vista, Australia	ML132	bio amplifier
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382	parasympathetic agonist
Electrodes with acupuncture needles	DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea	DB106	0.20 x 15 mm
Isoprenaline	Sigma-Aldrich	I2760	sympathetic agonist
LabChart 8	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data analysis software
Mouse food	LabDiet, St. Louis, MO, USA	5L79	Mouse diet
PowerLab 2/28	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data acquisition system
Propranolol	Sigma-Aldrich	P0884	sympathetic antagonist
SPSS Statistics program	SPSS	SPSS 25.0	statistics program