Электрокардиограмма Записи в анестетических мышей с использованием свинца II

Резюме

Мы представляем протокол ЭКГ, который технически прост, недорог, быстр и доступен для маленьких мышей и может выполняться с повышенной чувствительностью. Мы предлагаем этот метод в качестве скринингового подхода для изучения фармакологических агентов, генетических модификаций и моделей заболеваний у мышей.

Аннотация

Электрокардиограмма является ценным инструментом для оценки системы проводимости сердца. Исследования на животных помогли получить новую генетическую и фармакологическую информацию об электрокардиограмме. Тем не менее, сделать измерения электрокардиограммы у мелких животных in vivo, таких как мыши, было сложной задачей. С этой целью мы использовали метод записи электрокардиограммы у обезболивания мышей со многими преимуществами: это технически простая процедура, недорогая, имеет короткое время измерения и доступна даже у молодых мышей. Несмотря на ограничения с использованием анестезии, сравнение между контрольными и экспериментальными группами может быть выполнено с повышенной чувствительностью. Мы лечили мышей с агонистами и антагонистами вегетативной нервной системы, чтобы определить достоверность этого протокола и сравнили наши результаты с предыдущими отчетами. Наш экГ-протокол обнаружил повышенные частота сердечных сокращений и интервалы на лечение атропином, снижение частота сердечных сокращений и интервалы к ТК после лечения карбабола, а также более высокие частота сердечных сокращений и интервалы с изопреналином, но не заметили никаких изменений в параметрах ЭКГ при администрировании пропранолола. Эти результаты подтверждаются предыдущими отчетами, подтверждающими надежность этого протокола ЭКГ. Таким образом, этот метод может быть использован в качестве скринингового подхода к проведению измерений ЭКГ, которые в противном случае не были бы предприняты из-за высокой стоимости и технических трудностей.

Введение

Электрокардиограмма (ЭКГ), тест, который измеряет электрическую активность своего сердцебиения, является ценным инструментом для оценки системы сердечной проводимости. Параметры, измеряемые ЭКГ, включают частоту сердечных сокращений, интервал PR, продолжительность ЗРС и интервал ЗТ. Короче говоря, PR интервал соответствует времени, которое требуется для электрического импульса для перемещения из предсердного синусового узла через атриовентрикулярный узел к волокнам Purkinje; Продолжительность ЗР – это время для деполяризации желудочков через систему Пуркинье и желудочковый миокард; и интервалом ЗТ является продолжительность ретрикулярной репаларизации.

Записи ЭКГ на мышах помогли исследователям изучить сердечную функцию и определить физиологические и патофизиологические механизмы сердечных фенотипов, таких как аритмия, мерцательная аритмия и сердечная недостаточность. Большинство сердечно-сосудистых исследований включает в себя исследования в генетически модифицированных моделях мыши. Часто бывает сложно получить значимые данные о записях ЭКГ от маленьких мышей, которыми генетически манипулировали.

Существует несколько методов для выполнения ЭКГ у мышей¹. Исследования показывают, что записи ЭКГ у сознательных животных предпочтительнее, чем обезболивающие животные, когда это возможно, так как влияние анестезии на сердечную функцию были хорошо установлены². Два протокола, которые записывают ЭКГ в сознательных мышей, имеют примечание¹. Система радиотелеметрии ЭКГ является золотым стандартом для непрерывного долгосрочного мониторинга ЭКГ у сознательных мышей^1,3. Несмотря на свою силу в записи в сознательном состоянии, радиотелеметрии связаны ЭКГ измерений имеют ряд ограничений, в том числе высокие расходы на установку и для имплантата, его требование к опытным оператором, период стабилизации более 1 недели, его потребность в больших мышей ()gt; 20 г), и приобретение только одного свинца ЭКГ записи¹. Другая система, которая использует лапы размера проводящих электродов встроенных в платформу позволяет ЭКГ записи в сознательных мышей без анестезии или имплантатов^1,4. Эта неинвазивная система является альтернативным методом в ситуациях, в которых радиотелеметрические системы недоступны, поскольку она имеет много преимуществ: отсутствие требования хирургического лечения, отсутствие необходимости анестезии, низкая стоимость на мышь (только начальная установка стоит дорого), короткое время для измерения, и доступность новорожденных^1,4. Основным недостатком этой системы является то, что она не подходит для непрерывного долгосрочного мониторинга^1.

Здесь мы вводим еще один недорогой, простой и быстрый метод записи ЭКГ у обезбольных мышей и демонстрируем его достоверность и чувствительность, выполняя ЭКГ после вегетативной блокады/стимуляции системы сердечной проводимости. Мы предлагаем этот метод ЭКГ для скрининга эффектов фармакологических агентов, генетических модификаций и моделей болезней у мышей.

протокол

Все процедуры для животных были одобрены местным комитетом по уходу и использованию лабораторных животных Университета Кён Хи (номер лицензии: KHUASP(SE)-18-108) и соответствовали Руководству Национальных институтов здравоохранения США по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Экспериментальные животные

1. Храните всех мышей (39 мышей, Balb/c, мужчин, 7'u20129 недель) в патоген-бесплатно объекта в соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных.
2. Поддерживайте мышей на 12 ч светлого/темного цикла при постоянной температуре с бесплатным доступом к пище и воде.

2. Приготовление анестезии

ПРИМЕЧАНИЕ: Трибромоэтанол используется в комбинации кетамина и изофлуран, на основе стабильности частоты сердечных сокращений и воспроизводимости эхокардиографии у триброзэтанол-амеселовы-анестезированных мышей^1,5,6

1. Сделать стоковый раствор из 2,2,2-трибромоэтанола с концентрацией 1 г на 1 мл третичного амил-спирта. Теплый при 40'u201245 C в течение 24 ч. Магазин при 4 градусах Цельсия в течение 12 месяцев.
2. Для рабочего раствора разбавить 0,5 мл раствора в 19,5 мл солевого раствора (0,9% NaCl) до 25 мг/мл. Теплый при 40'u201245 C за 1 ч. Магазин при 4 градусах Цельсия в течение 1 месяца.

3. Настройка системы ЭКГ

1. Убедитесь в том, чтобы настроить систему так, что нет шума или вибрации в пределах 2 м, так как ЭКГ сигналы в мыши чувствительны к шуму окружающей среды и движения.
2. Подготовьте аппаратную установку: систему получения данных, биоусилитель и компьютер, который устанавливается с программным обеспечением для анализа экГ данных.
   1. Подключите систему получения данных к сети (AC) с помощью силового кабеля.
   2. Подключите систему получения данных к компьютеру с помощью USB-кабеля.
   3. Подключите выход сигнала на задней панели биоусилителя к аналоговому входу на передней панели системы получения данных с помощью кабеля.
   4. Подключите выход I²C системы получения данных к вводу I²C биоусилителя с помощью кабеля I²C.
   5. Подключите 3-ведущий биоусилитель кабеля к 6-контактной розетке на передней панели биоусилителя.
   6. Включите систему получения данных с помощью выключателя на задней панели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Короче говоря, сигналы усиливаются через биоусилитель и регистрируются с помощью компьютеризированной системы получения и анализа данных со следующими настройками канала: частота выборки 2 к/с, диапазон 20 мВ и настройка фильтра низкого прохода 200 Гц.
3. Откройте программу анализа и настрои ее для получения данных ЭКГ.
   1. Перейти к настройке Настройки канала. Установите частоту выборки до 2 к/с. Установите диапазон до 20 мВ. Установите усилитель ввода до 200 Гц низкого прохода.
   2. Перейти к анализу ЭКГ (ru) Настройки ЭКГ. Выберите "Мышь" в настройках предустановленного обнаружения и анализа.
   3. В панели усреднения, выберите конкатент N (например, 4 удара или 60 с) последовательные сердечные циклы в один средний сигнал для усреднения просмотра и просмотра таблицы.
   4. В панели QTC, выберите "Bazett" метод, который определяется как частота сердечных сокращений скорректированное значение интервала: T T / (RR/100)^0,5, RR интервал 60 / частота сердечных сокращений⁷.

4. Измерение ЭКГ

1. Поместите мышь в точном масштабе и зафиксируйте ее вес.
2. Индуцировать анестезию в мышке путем интраперитонеальной (т.е.) инъекции рабочего раствора триброзэтанола (18 мЛ рабочего раствора на кг массы тела (b.w.)).
3. Поместите анестезируемую мышь в положение на спине. Убедитесь, что мышь полностью анестезируется (менее 2 мин).
4. Вставьте электроды с иглоукалыванием иглы подкожно в правой и левой передние конечности и левой задней задняя часть в соответствии с свинцом II ЭКГ схеме и исправить их с лентой (Рисунок 1). Убедитесь, что глубина и положение вставленных электродов соответствуют на протяжении всего эксперимента.
5. Подключите другие концы электродов, нажав на них в три разъема оснастки на другом конце свинцовых проводов 3-ведущего биоусилителя кабеля.
6. Инъекционные наркотики (т.е.) 3 мин после анестезии были доставлены(Рисунок 2).
7. Начните запись ЭКГ 10 мин после введения анестезии. После завершения записи используйте данные ЭКГ от 12 до 17 минут после инъекции анестезии для анализа.
8. В конце сеанса записи ЭКГ тщательно удалите электроды.

5. Анализ данных ЭКГ

1. Перейти к анализу ЭКГ (ru) Усреднение просмотра и убедитесь, что программное обеспечение правильно определяет начало и конец P волны, комплекс ЗРС, и T волны в отдельных ударов. При необходимости ручная коррекция этих волн и интервалов возможна путем перемещения неуместных курсоров в соответствующие позиции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано на рисунке 3A, PR интервал охватывает начало P волны, что из комплекса ЗРС (в основном отсутствует волна в экГ мыши). Длительность ЗРС простирается от начала волны (прежде всего волны R в экГ мыши) до конца волны S. Интервал ЗТ включает в себя наступление волны (в основном волны R в экГ мыши) до конца T-волны. Обратите внимание на более короткую продолжительность и отсутствие волны и сегмента ST в мышиной ЭКГ по отношению к человеческой ЭКГ⁸.
2. Перейти к анализу ЭКГ (ru) Просмотр таблицы и выбор правильно идентифицированных данных ЭКГ, проверяя отдельные удары в окне усреднения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3 показано несколько примеров фактических сигналов ЭКГ мыши. Рисунок 3A представляет собой нормальный сигнал дикого типа, который был правильно идентифицирован в отношении P-волны, комплекса ЗРС и T-волны. Компьютеризированный выбор волн P'RS может понести ошибочные неуместности, например, на рисунке 3B нормальный сигнал дикого типа, который неуместно начинает P-волну. На рисунке 3C ЭКГ сигнал, который неуместно конца комплекса ЗРС, что приводит к завышению продолжительности ЗРС. На рисунке 3D ЭКГ сигнал, который неуместно конца комплекса ЗРС, в результате чего недооценка комплекса ЗРС из-за неоднозначной волны T и рисунок 3E сигнал ЭКГ с неопределимой Т волны. Без исключения или ручной коррекции интервалы ПЗРС могут быть более или занижены. Обязательно выберите сигналы ЭКГ, которые были правильно идентифицированы, и сигналы, которые не пропускают целевые пики. Следовательно, такие случаи, в том числе B, C, D и E(рисунок 3),исключаются при точной оценке параметров ЭКГ в целом.
3. Выберите данные ЭКГ, представляющие интерес для Table View, и скопировать/вставить их в файл электронной таблицы.

6. Статистический анализ

1. Выполните статистический анализ с помощью статистической программы. Проанализируйте данные с помощью ослепли экспериментальные условия. Выполните студентов т-тести Манн-Уитни U-тест для 2-групповых сравнений. Цифры в каждой цифре указывают количество мышей, которые используются для каждой группы. Сообщите о результатах как средние и SEM.
2. Рассмотрим различия p с р-лт; 0,05 по U-тесту, чтобы быть статистически значимыми: з, р-л; 0,05; - р-л; 0,01; и q, p q lt; 0.005 против соответствующих элементов управления.

Результаты

Фармакологические эксперименты

Чтобы определить, отражает ли наше неинвазивное измерение ЭКГ влияние вегетативной модуляции на систему сердечной проводимости, нормальные мыши Balb/c были оспорены агонистами и антагонистами вегетативной нервной системы (ANS). Атр...

Обсуждение

В протоколе есть несколько важных этапов. Окружающая среда должна быть свободна от шума и вибрации. ЭЛЕКТРОДы ЭКГ должны быть вставлены под кожу стабильно и последовательно, из которых шаг вставки требует предварительных экспериментов, пока исследователь технически опытный. Кроме тог...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G	anesthetics, Avertin
Animal	Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan		Balb/c mice, male, aged 7-9 weeks
Atropine	Sigma-Aldrich	A0123	parasympathetic antagonist
BioAmp	AD Instruments, Bella Vista, Australia	ML132	bio amplifier
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382	parasympathetic agonist
Electrodes with acupuncture needles	DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea	DB106	0.20 x 15 mm
Isoprenaline	Sigma-Aldrich	I2760	sympathetic agonist
LabChart 8	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data analysis software
Mouse food	LabDiet, St. Louis, MO, USA	5L79	Mouse diet
PowerLab 2/28	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data acquisition system
Propranolol	Sigma-Aldrich	P0884	sympathetic antagonist
SPSS Statistics program	SPSS	SPSS 25.0	statistics program