Inflado al aire de los pulmones murinos con fijación de perfusión vascular

Resumen

Se presenta un método para la inflación del aire con fijación de perfusión vascular de los pulmones que preserva la ubicación de las células dentro de las vías respiratorias, los alvéolos y el intersticio para los análisis de estructura-función. La presión constante de las vías respiratorias se mantiene con una cámara de inflado de aire, mientras que el fijador se perfunde a través del ventrículo derecho. Los pulmones se procesan para estudios histológicos.

Resumen

La histología pulmonar se utiliza a menudo para investigar las contribuciones proporcionadas por las células del espacio aéreo durante la homeostasis pulmonar y la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, los métodos de fijación basados en la instilación comúnmente utilizados pueden desplazar las células del espacio aéreo y el moco en las vías respiratorias terminales y pueden alterar la morfología del tejido. En comparación, las técnicas de fijación de perfusión vascular son superiores para preservar la ubicación y la morfología de las células dentro de los espacios aéreos y el revestimiento de la mucosa. Sin embargo, si la presión positiva en las vías respiratorias no se aplica simultáneamente, las regiones de los pulmones pueden colapsar y los capilares pueden abultarse en los espacios alveolares, lo que lleva a la distorsión de la anatomía pulmonar. Aquí, describimos un método económico para la inflación del aire durante la fijación de perfusión vascular para preservar la morfología y la ubicación de las células de las vías respiratorias y alveolares y el intersticio en los pulmones murinos para estudios histológicos aguas abajo. La presión de aire constante se entrega a los pulmones a través de la tráquea desde una cámara sellada y llena de aire que mantiene la presión a través de una columna de líquido ajustable mientras que el fijador se perfunde a través del ventrículo derecho.

Introducción

La histología pulmonar representa el estándar de oro para evaluar la arquitectura pulmonar durante la salud y la enfermedad y es una de las herramientas más utilizadas por los investigadores pulmonares¹. Uno de los aspectos más críticos de esta técnica es el adecuado aislamiento y preservación del tejido pulmonar, ya que la variabilidad en este paso puede conducir a una mala calidad del tejido y resultados erróneos^1,2,3. En animales vivos, el volumen pulmonar está determinado por el equilibrio entre el retroceso elástico hacia adentro del pulmón y las fuerzas hacia afuera transmitidas desde la pared torácica y el diafragma por la tensión superficial. En consecuencia, cuando se ingresa al tórax, se pierden fuerzas externas y el pulmón colapsa. Las secciones histológicas preparadas a partir de pulmones colapsados tienen una apariencia abarrotada y los límites entre los compartimentos anatómicos (es decir, los espacios aéreos, la vasculatura y el intersticio) pueden ser difíciles de distinguir. Para eludir este desafío, los investigadores a menudo inflan los pulmones durante la fijación química para que se mantenga el tamaño y la arquitectura del espacio aéreo.

Los pulmones se pueden inflar con aire o líquido. La presión necesaria para inflar los pulmones al mismo volumen difiere entre la inflación de aire y líquido debido a las fuerzas intermoleculares en la interfaz aire-líquido. Se requiere una presión más alta (por ejemplo, 25 cmH₂O) durante el inflado del aire que la inflación líquida (por ejemplo, 12 cmH₂O) para superar la tensión superficial y abrir los alvéolos colapsado⁴. Una vez que los alvéolos han sido reclutados, una presión más baja puede mantener los alvéolos abiertos al mismo volumen que las mesetas de la curva presión-volumen, y las presiones se igualan en todo el pulmón de acuerdo con la ley de Pascal^4,5,6,7,8.

Existen dos métodos principales de inflación y fijación pulmonar para preservar los pulmones murinos para la histología. Más comúnmente, los espacios aéreos se inculcan con líquido, a menudo conteniendo un fijador. La principal ventaja de este enfoque es que es relativamente fácil y requiere poca capacitación. Mientras que la instilación intratraqueal de fijador puede ser preferida en estudios que se centran en la vasculatura, el líquido que se instila a través de la tráquea tiende a empujar las células de las vías respiratorias proximales y las mucinas hacia regiones del espacio aéreo más distales, mientras que la inflación del aire no es^{1,3,4,9,10,11.} Además, el desprendimiento involuntario de leucocitos del epitelio durante la inflación líquida altera su morfología, dándoles artificualmente una apariencia simple y redondeada^4,10,11,12. Finalmente, la inflación de los pulmones con líquido puede comprimir involuntariamente el intersticio^4,10,11. Juntos, estos factores pueden distorsionar la anatomía normal y las distribuciones celulares dentro de los pulmones preservados, limitando así la técnica.

Un método alternativo de preservación de tejidos es la fijación de perfusión vascular. En este método, el fijador se perfunde en la vasculatura pulmonar a través de la vena cava o el ventrículo derecho. Este método preserva la ubicación y la morfología de las células en la luz del espacio aéreo. Sin embargo, a menos que los pulmones se inflen durante la fijación de perfusión, es probable que el tejido pulmonar colapse.

El inflado de aire con fijación de perfusión vascular aprovecha las fortalezas de cada una de las técnicas de fijación anteriores. Aquí proporcionamos un protocolo para esta técnica. Los materiales y equipos que se requieren son relativamente baratos y se pueden obtener y ensamblar fácilmente. La configuración completa, que se muestra en la Figura 1A,proporciona presión constante de las vías respiratorias a los pulmones a través de una columna ajustable llena de líquido, mientras que una bomba peristáltica administra fijador a través del ventrículo derecho. Los pulmones con morfología preservada pueden procesarse posteriormente para análisis de estructura-función.

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Protocolo

Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de National Jewish Health.

NOTA: El protocolo está organizado en tres componentes. El primer componente detalla la construcción del inflado de aire con equipos de perfusión/fijación. Una segunda sección describe cómo configurar el equipo para un experimento. La sección final describe cómo preparar al animal y realizar el experimento.

1. Construcción del aparato de columna de agua (Figura 1B)

1. Retire el émbolo de una jeringa de punta deslizante de 60 ml.
2. Coloque cinta adhesiva alrededor de la jeringa en la marca de 30 ml. Ajuste la altura de la jeringa a esta marca para la presión de inflado inicial de 25 cmH₂O. Aquí es también donde debe estar el nivel de agua en la columna durante todo el procedimiento. Etiquete la cinta como "25 cm" (como se muestra en la Figura 1A)o "inflación".
   NOTA: Se utiliza una presión de inflado de 25 cmH₂O para garantizar el reclutamiento de espacios aéreos colapsado. Una vez que se han reclutado los alvéolos, la presión se reduce a 20 cmH₂O para garantizar que los espacios aéreos no estén distendidos.
3. Mida 5 cm desde la cinta hacia el extremo del émbolo y conecte otro trozo de cinta a la jeringa. Mueva la jeringa hacia abajo hasta esta marca para reducir la presión de inflado a 20 cmH₂O durante la fijación. Etiquete la cinta como "20 cm" (como se muestra en la Figura 1A)o "fijación".
4. Conecte el tubo de cloruro de polivinilo (PVC) 180 al extremo de la punta deslizante de la jeringa. La longitud del tubo depende de la distancia entre la jeringa y la cámara de inflado de aire (aproximadamente 25-30 cm).
5. Coloque una camiseta macho luer (2) estilo hilo (1.219 pulgadas de longitud, 0.904 pulgadas de altura, 0.0904 pulgadas de diámetro interior) en el otro extremo del tubo. Este Luer macho se conectará a la llave de paso de la cámara de inflado de aire (Paso 2.4).

2. Construcción de la cámara de inflado de aire (Figura 1C)

1. Perfore dos orificios (aproximadamente 4 mm de diámetro) en un recipiente de plástico de 500 ml con una tapa atornillada. Los orificios deben ser del mismo tamaño que los Luers hembra (1.224 pulgadas de longitud, 0.312 pulgadas de altura, 0.098 pulgadas de diámetro interior).
   NOTA: Se pueden utilizar medios vacíos o contenedores de amortiguación para la cámara de inflado de aire.
2. Cubra los hilos de Luers hembra con el fabricante de juntas de silicona y coloque el lado más pequeño en los orificios preperforados del recipiente.
3. Agregue el fabricante de juntas de silicona alrededor de los Luers hembra donde ingresan al recipiente para garantizar un sello hermético.
4. Atornille una llave de paso unidirección en el Luer hembra inferior en la cámara de inflado de aire.
5. Corte el tubo a la longitud de aproximadamente 25 cm y fije los Luers machos a los extremos libres del tubo. Conecte el Luer macho en un extremo del tubo con el Luer hembra libre en la cámara de inflado de aire. El otro Luer macho se conectará al contenedor de procesamiento de animales.

3. Construcción del contenedor de procesamiento de animales (Figura 1D)

1. Perfore un orificio (aproximadamente 4 mm de diámetro) en el costado de un recipiente de plástico grande. El agujero debe ser del diámetro de la hembra Luer. El recipiente de plástico es necesario para atrapar el exceso de solución de fijación.
   NOTA: Se utilizó un contenedor de almacenamiento de plástico de 30 cm x 22 cm y 3,8 L.
2. Cubra los hilos de una hembra luer con un fabricante de juntas de silicona y coloque el lado más pequeño en el orificio precarillado del recipiente.
3. Agregue el fabricante de juntas de silicona alrededor del Luer hembra donde entra y sale del recipiente para garantizar un sellado hermético.
4. Atornille una llave de paso unidirección en la hembra Luer. Los tubos de la cámara de inflado de aire se unirán a esta llave de paso.

4. Preparación de soluciones

1. Solución de heparina
   1. Llene un recipiente con PBS libre de calcio y heparina (20 U/mL). Prepare un total de 10 ml de solución de heparina para cada ratón. La heparina es un anticoagulante que evita que se formen coágulos de sangre en los vasos durante la fijación por perfusión. La solución de heparina se usará para eliminar la sangre de los pulmones antes de la fijación por perfusión.
2. Solución fijadora
   PRECAUCIÓN: Los fijadores pueden presentar un peligro para la salud y deben usarse en una campana de humos químicos. Todos los aparatos están instalados en una campana de humos químicos para evitar la inhalación de fijadores.
   1. Llene un recipiente con PBS libre de calcio y paraformaldehído (concentración final del 4%). Prepare un total de 50 ml de solución fijadora para cada ratón.
      NOTA: El tipo de fijador utilizado puede variar y dependerá de los estudios histológicos posteriores.

5.   Preparación de aparatos de perfusión

NOTA: Se sugiere una bomba peristáltica para la entrega de fluidos en la vasculatura para garantizar un caudal constante. Las siguientes instrucciones son para configurar la bomba peristáltica y pueden ser diferentes para cada modelo. Alternativamente, si no se dispone de una bomba peristáltica, se puede construir un segundo aparato de columna de agua para perfundir fluidos desde una altura de 35 cm H₂O.

1. Primero coloque el tubo alrededor del conjunto del rodillo.
2. Asegure el tubo en los postes con muescas.
3. Cierre las palancas en su lugar colocando primero la palanca izquierda alrededor del tubo y asegurándola en su lugar con la palanca superior y luego la derecha.
4. Coloque el extremo proximal del tubo en la solución de heparina y el extremo distal en el recipiente de procesamiento animal.
5. Precargue la solución de heparina en el tubo haciendo funcionar la bomba para expulsar el aire del tubo.
6. Asegure una aguja de 25G x 5/8" en el extremo del lado izquierdo del tubo.

6. Preparación de aparatos de inflado de aire

1. Coloque la jeringa para la columna de agua en un soporte de anillo.
2. Mida una altura vertical de 25 cm desde la plataforma del animal hasta la marca de cinta de "25 cm" (Paso 1.2) en la columna de agua.
3. Fije el extremo del tubo de la columna de agua a la llave de paso de la cámara de aire.
4. Conecte un tubo desde el Luer hembra de la cámara de aire a la llave de paso en el contenedor de procesamiento de animales.
   NOTA: Si la cámara de inflado de aire se construye como se muestra en la Figura 1C,la fijación de tubos en orden inverso puede hacer que el agua se filtre en el tubo que se conecta a la cánula traqueal.
5. Asegúrese de que la tapa de la cámara de aire esté bien cerrada.
6. Asegúrese de que la llave de paso en el exterior del recipiente de procesamiento de animales esté cerrada y que la llave de paso en el tubo que va desde la columna de agua hasta la cámara de inflado de aire esté abierta.
7. Llene la jeringa con agua hasta la marca de "25 cm". El agua saldrá de la jeringa a través del tubo hacia la cámara de aire. Una vez que la presión se iguala, el agua dejará de fluir.
   1. Es posible que el agua se filtre lentamente en la cámara de inflado de aire a medida que fluctúa la presión del aire ambiente dentro de la campana química. Vigile el nivel de agua dentro de la jeringa y agregue más si es necesario. Mantenga el nivel de agua en la marca de "25 cm" durante todo el procedimiento.
      NOTA: Por lo general, los niveles de agua se mantendrán constantes durante la primera parte de la inflación del aire a 25 cmH₂O; sin embargo, es probable que se deba agregar más agua a la jeringa durante la fijación. Si el agua no deja de fluir, es probable que exista una fuga de aire dentro de la cámara de inflado de aire. Es posible que sea necesario aplicar más fabricante de juntas de silicona alrededor de los Luers para evitar fugas de aire.

7. Preparación de los animales (Figura 2)

NOTA: Este procedimiento ha sido modificado a partir de Gage et al¹³. Hemos completado este procedimiento en ratones machos y hembras adultos de diferentes edades y no observamos sesgo de edad o sexo.

1. Eutanasiar al animal con pentobarbital sódico (150 mg/kg, por vía intraperitoneal). Asegúrese de que el animal esté muerto antes de comenzar la disección.
   NOTA: Si bien este procedimiento se realiza en animales sacrificados, este procedimiento se puede realizar en animales vivos para utilizar el corazón para bombear perfusatos a través del animal.
2. Haga dos incisiones laterales a través de la pared abdominal. Haga la primera incisión debajo de la caja torácica y la segunda por encima de las caderas. Corte a lo largo de la línea media desde la incisión inferior hacia la incisión superior.
3. Usando tijeras romas, haga cuidadosamente una incisión en el lado lateral del diafragma. Los pulmones deben colapsar tan pronto como se perfora el diafragma.
   NOTA: Se debe tener cuidado para evitar perforar los pulmones. Es menos probable que un pulmón perforado se infle durante los pasos posteriores.
4. Corte transversalmente a lo largo del diafragma para abrir la cavidad torácica.
5. Corte superiormente a lo largo del esternón desde el proceso xifoide hasta la muesca yugular y lateralmente por encima de la caja torácica para exponer completamente el corazón y los pulmones. Fije los lados de la caja torácica.
6. Haga una incisión en la línea media en el cuello por encima de la tráquea. Extirpar la piel, el músculo, la glándula tiroides y el tejido conectivo que rodea la tráquea.
7. Usando forrórceps curvas, deslice dos trozos de hilo o sutura debajo de la tráquea posterior. Use una pieza de sutura para mantener el adaptador Luer-stub de inflado en su lugar, y use la otra en última instancia para atar la tráquea al final de la inflación de aire y la fijación de perfusión vascular.
8. Haga un pequeño agujero en la tráquea con una aguja de 18G x 1"o tijeras de resorte Vannas.
9. Coloque un adaptador Luer-stub de 20G en este orificio de la tráquea.
10. Ate un hilo alrededor de la tráquea inmediatamente distal a donde entra el adaptador Luer-stub para mantenerlo en su lugar.
11. Transfiera el animal al contenedor de procesamiento de animales.
12. Conecte el adaptador Luer-stub a la hembra Luer en el interior del contenedor de procesamiento de animales.

8. Inflado del aire, perfusión y fijación de los pulmones (Figura 2)

1. Coloque la aguja de 25G x 5/8" unida al tubo del aparato de perfusión en el ventrículo derecho del corazón.
2. Corte la aorta abdominal para permitir que la sangre drene del corazón y para promover el flujo de perfusato a través de los pulmones.
3. Abra la llave de paso en el exterior del recipiente de procesamiento animal para inflar los pulmones.
   NOTA: Puede tomar tiempo para que los pulmones se infles por completo. Observe el nivel de agua en la jeringa, no debe disminuir rápidamente a menos que haya una fuga en los pulmones.
4. Inflar los pulmones a 25 cmH₂O durante 5 minutos. La inflación a 25 cmH₂O precondicciona el pulmón y ayuda a reclutar regiones pulmonares atelectáticas.
   NOTA: Es posible que sea necesario agregar una pequeña cantidad de agua a la jeringa para mantener la altura de 25 cm. La inflamación y / o la lesión pulmonar inducida experimentalmente pueden influir en la inflación de los pulmones. En este caso, puede ser necesario aumentar la presión de inflado hasta un máximo de 35 cmH₂O para ayudar a reclutar regiones atelectáticas.
5. Durante el último minuto de la inflación pulmonar, encienda la bomba peristáltica a un caudal de 10 ml/min. La solución de heparina debe fluir desde la botella a través del tubo hacia el animal.
   1. El objetivo de la infusión de heparina es prevenir la formación de trombos en los vasos. En consecuencia, infunda heparina hasta que los pulmones se vuelvan blancos y carezcan de sangre. Si los pulmones no se vuelven blancos, puede ser necesario ajustar la aguja ventricular derecha.
6. Después de inflar durante 5 minutos, apague la bomba peristáltica y cambie el tubo de perfusión de la solución de heparina al fijador.
7. Baje la jeringa de la columna de agua hasta la marca de "20 cm" (Paso 1.3). Es normal que las burbujas de aire se muevan dentro de la columna de agua a medida que la presión cambia de 25 a 20 cmH₂O.
   1. Compruebe el nivel de agua en la jeringa. Debe estar en la marca de "25 cm". Puede ser necesario agregar más en este momento.
8. Espere 1 minuto para permitir que los pulmones se desinflen de 25 a 20 cmH₂O.
9. Reinicie la bomba de perfusión a un caudal de 6,5 ml/min.
10. Perfusión vascular fija durante 10 a 15 minutos.

9. Extracción de pulmones (Figura 3)

1. Ate firmemente el segundo trozo de hilo alrededor de la tráquea distal al adaptador Luer-stub. Retire el adaptador Luer-stub de la tráquea.
2. Retire la aguja del corazón.
3. Libere los pulmones y el corazón de la cavidad torácica cortando el tejido conectivo posterior al mediastino con tijeras romas. Tenga cuidado de evitar perforar los pulmones.
4. Retire con cuidado el corazón de los pulmones.
5. Coloque los pulmones en fijador durante la noche.
   NOTA: La duración del fijador varía dependiendo de los estudios histológicos posteriores.
   1. Coloque los pulmones en un tubo cónico de 50 ml que contenga 20-25 ml de fijador. Coloque la rosca que asegura la tráquea a través de la abertura del tubo cónico y asegúrelo por los hilos de la tapa. Invierta el tubo cónico para asegurarse de que los pulmones flotantes e inflados por aire permanezcan completamente sumergidos en fijador, de lo contrario flotarán hasta la parte superior del líquido.
6. Procesar los pulmones para estudios histológicos.

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Resultados

En un tórax intacto, los pulmones se mantienen abiertos por fuerzas externas aplicadas por la pared torácica a través del espacio pleural^6,14. Cuando se ingresa el diafragma durante la disección, la integridad del espacio pleural se abole y los pulmones deben colapsar(Figura 2A,2B). Para volver a expandir los pulmones, se realiza el inflado del aire. Como primer paso, se aplican 25 cm de presión de agua para gar...

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Discusión

Aunque se usan comúnmente, los métodos de fijación intratraqueales desplazan a los leucocitos de las vías respiratorias y pueden alterar la arquitectura pulmonar normal. El método de inflado de aire con fijación de perfusión vascular que se proporciona en este protocolo supera estos escollos y preserva con mayor precisión la anatomía pulmonar. Las claves para obtener tejido de alta calidad del método de fijación de perfusión vascular incluyen un monitoreo cuidadoso de las presiones de inflado de aire, evitar ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer	Cole-Parmer	Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF	Stopcock
BD 60 mL syringe, slip tip	BD	309654	Syringe used to construct the water column
BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	Needle for vascular perfusion/fixation
Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer	Nordson Medical	FTLLBMLRL-1	Female Luer
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3393	Heparin solution.
Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge	BD Biosciences	427564	Luer-Stub Adapter
Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee	Nordson Medical	LT787-9	Male Luer
Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing	ThermoFisher Scientific	8000-9020	Tubing
Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline
Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker	Permatex	81724	Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV	Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions
Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container	Sterilite	0342	Animal processing container