Una plataforma "casera" asequible y eficiente para estudios de comportamiento de Drosophila , y un protocolo complementario para la respirometría mitocondrial de larvas

Resumen

Proporcionamos protocolos para que cualquier persona con una mente de "cultura maker" comience a construir un flylab para el análisis cuantitativo de una miríada de parámetros de comportamiento en Drosophila melanogaster, mediante la impresión en 3D de muchos de los equipos necesarios. También describimos un protocolo de respirometría de alta resolución que utiliza larvas para combinar datos de comportamiento y metabolismo mitocondrial.

Resumen

La utilidad de Drosophila como organismo modelo para el estudio de las enfermedades humanas, los comportamientos y la biología básica es incuestionable. Aunque práctica, la investigación sobre Drosophila carece de popularidad en los países en desarrollo, posiblemente debido a la idea errónea de que establecer un laboratorio y realizar experimentos relevantes con insectos tan pequeños es difícil y requiere aparatos costosos y especializados. Aquí, describimos cómo construir un flylab asequible para analizar cuantitativamente una miríada de parámetros de comportamiento en D. melanogaster, mediante la impresión 3D de muchos de los equipos necesarios. Proporcionamos protocolos para construir estantes de viales internos, arenas de cortejo, aparatos para ensayos locomotores, etc., que se utilizarán para el mantenimiento general de moscas y para realizar experimentos de comportamiento con moscas adultas y larvas. También proporcionamos protocolos sobre cómo utilizar sistemas más sofisticados, como un oxígrafo de alta resolución, para medir el consumo de oxígeno mitocondrial en muestras de larvas, y mostramos su asociación con cambios de comportamiento en las larvas tras la expresión xenotópica de la oxidasa alternativa mitocondrial (AOX). AOX aumenta la actividad larvaria y la respiración por fuga mitocondrial, y acelera el desarrollo a bajas temperaturas, lo que es consistente con un papel termogénico de la enzima. Esperamos que estos protocolos inspiren a los investigadores, especialmente de los países en desarrollo, a utilizar Drosophila para combinar fácilmente datos de comportamiento y metabolismo mitocondrial, lo que puede conducir a información sobre genes y/o condiciones ambientales que también pueden regular la fisiología humana y los estados de enfermedad.

Introducción

Drosophila melanogaster fue introducida a la comunidad científica como un organismo modelo potencialmente poderoso hace más de 100 años. Ese potencial ha sido firmemente validado en varias áreas de las ciencias biológicas y biomédicas, como la genética, la evolución, la biología del desarrollo, la neurobiología y la biología molecular y celular. Como resultado, se han otorgado seis Premios Nobel de Medicina o Fisiología a diez investigadores de Drosophila que han contribuido sustancialmente a nuestra comprensión de la herencia, la mutagénesis, la inmunidad innata, los ritmos circadianos, el olfato y el desarrollo¹. Quizás lo más importante es que D. melanogaster no ha dejado de proporcionarnos nuevos modelos de biología y enfermedades humanas, ya que una búsqueda rápida en PubMed revela casi 600 publicaciones en los últimos 5 años, utilizando el término de búsqueda "modelo de Drosophila" (², a partir de febrero de 2021). En los Estados Unidos, donde Drosophila es un organismo modelo ampliamente extendido en la comunidad biomédica, alrededor del 2,2% de todos los premios de investigación R01 otorgados por los NIH en 2015 se asignaron a investigadores de Drosophila ³. En Brasil, por otro lado, una búsqueda de proyectos actualmente financiados en el sitio web de la Fundación de Apoyo a la Investigación Científica de São Paulo (FAPESP), la más importante agencia de financiación de la investigación en todas las áreas científicas del estado de São Paulo, mostró solo 24 becas y becas con Drosophila como tema principal de estudio⁴. Considerando la totalidad de los 13205 proyectos financiados actualmente por la FAPESP (⁵, hasta febrero de 2021), esos 24 proyectos de Drosophila representan una proporción de menos del 0,2% del total de proyectos, que es casi 12 veces inferior a la del NIH. Si eliminamos los proyectos financiados que tienen como objetivo estudiar Drosophila desde un punto de vista ecológico y/o evolutivo, y asumimos que los proyectos restantes utilizan este organismo como modelo para comprender los procesos biológicos humanos en la salud y la enfermedad, esa proporción disminuye a un impactante ~0,1%.

De hecho, se justifica una investigación adecuada para revelar las razones por las que la investigación de Drosophila en Brasil/São Paulo no parece ser tan significativa en el número de proyectos financiados. El cultivo de Drosophila no es costoso ^6,7,8 y es relativamente sencillo, ya que, a diferencia de los vertebrados, no es necesario el permiso de un comité de bioética para la experimentación ^9,10. Sin embargo, en Brasil se requiere una aprobación para trabajar con líneas de moscas genéticamente modificadas¹¹, lo que agrega una capa de burocracia inherente a todo trabajo que involucra organismos genéticamente modificados. Sin embargo, es probable que esto no impida que los investigadores interesados inicien un flylab. Especulamos que la información errónea sobre el poder del modelo y sobre los altos costos esperados asociados con la creación de un flylab y la realización de experimentos significativos son factores importantes en esta decisión. Al igual que para la mayoría de los equipos e insumos científicos, los aparatos apropiados para realizar el mantenimiento general de las moscas y los análisis del comportamiento deben ser importados a Brasil desde América del Norte, Europa y/o otros lugares, lo que es un proceso costoso y extremadamente lento^12,13.

Recientemente, ha surgido una alternativa a la importación de aparatos especializados, ya que las impresoras 3D se han vuelto más asequibles y accesibles para cualquier persona, incluidos los investigadores de Drosophila en los países en desarrollo. La tecnología de impresión 3D ha sido ampliamente utilizada en los últimos 10 años por los miembros de la "cultura maker", que se basa en la idea de la autosuficiencia en lugar de depender exclusivamente de productos fabricados por la empresa¹⁴. Esta idea siempre ha estado presente en los laboratorios de investigación académica de todo el mundo, por lo que no es de extrañar que las impresoras 3D se hayan convertido en un equipo de laboratorio estándar en muchos lugares^15,16. Durante varios años, hemos estado imprimiendo en 3D estantes de viales para moscas, arenas de apareamiento, aparatos de escalada, entre otros dispositivos, por una fracción del costo de los equivalentes de marca. La reducción de los costes de impresión y montaje de equipos de laboratorio caseros está representada clásicamente por la FlyPi, que se puede construir por menos de 100,00 € y sirve como microscopio óptico y de fluorescencia capaz de utilizar una sofisticada estimulación optogenética y termogenética del pez cebra, Drosophila y nematodos genéticamente tratables¹⁵. Aquí, proporcionamos una serie de protocolos para que cualquier persona interesada en convertirse en un investigador de Drosophila (o en expandir su propio flylab existente) imprima en 3D gran parte del material necesario. Invirtiendo tiempo y desarrollando un poco de experiencia, el lector podrá incluso optimizar los protocolos presentados aquí para imprimir aparatos que se adapten mejor a sus propias necesidades de investigación.

Sin embargo, un flylab no es un lugar solo para equipos "baratos", especialmente cuando uno tiene la intención de asociar los análisis de comportamiento con los fenómenos metabólicos subyacentes. También nos hemos interesado en el papel de las mitocondrias en la modulación de los patrones de comportamiento de Drosophila, ya que estos orgánulos son responsables de la producción masiva de ATP en la mayoría de los tejidos a través de varias vías metabólicas cuyos productos convergen a la fosforilación oxidativa (OXPHOS). Analizar el consumo de oxígeno mitocondrial como una forma de comprender el metabolismo mitocondrial requiere un oxígrafo, que es un equipo más sofisticado que desafortunadamente aún no se puede imprimir en 3D. Debido a que OXPHOS impacta prácticamente todos los procesos celulares, ya que depende de una serie de reacciones redox exergónicas que ocurren en la célula^17,18, las tasas de consumo de oxígeno basadas en el sustrato oxidable proporcionado a las mitocondrias pueden ayudar a revelar si el funcionamiento del orgánulo es causa o consecuencia de un comportamiento particular. Por lo tanto, también proporcionamos aquí un protocolo para medir el consumo de oxígeno mitocondrial en muestras de larvas, ya que nos damos cuenta de que la gran mayoría de los protocolos publicados se centran en el análisis de muestras adultas. Demostramos que los cambios en la respiración mitocondrial, inducidos por la expresión transgénica de la oxidasa alternativa a la Ciona intestinalis (AOX), conducen a un aumento de la movilidad larvaria bajo estrés por frío. Lo más probable es que esto se deba a la termogénesis, ya que AOX es una oxidasa terminal no productora de protones que puede eludir la actividad de los complejos OXPHOS III Y IV (CIII y CIV), sin contribuir al potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) y a la producción de ATP 19,20,21. Ningún insecto, incluyendo Drosophila, o vertebrado posee naturalmente AOX 21,22,23, pero su expresión en una miríada de sistemas modelo 24,25,26,27,28,29 ha tenido éxito en mostrar su potencial terapéutico para condiciones de estrés respiratorio mitocondrial general, especialmente cuando es causado por CIII y/o CIV sobrecarga. AOX confiere resistencia a niveles tóxicos de antimicina A²⁴ y cianuro^24,25, y mitiga diversos fenotipos relacionados con la disfunción mitocondrial 24,25,30,31,32. El hecho de que la expresión de AOX cambie el comportamiento larvario y la función mitocondrial justifica estudios más profundos de las funciones de esta enzima en el metabolismo y la fisiología de las células y tejidos de los metazoos^33,34.

Esperamos que con este artículo podamos ayudar a crear conciencia dentro de la comunidad científica de países en desarrollo como Brasil de que utilizando el excelente conjunto de herramientas genéticas que presenta D. melanogaster , en combinación con aparatos caseros eficientes y asequibles para análisis de comportamiento, puede generar datos de investigación básica relativamente rápidos sobre procesos biológicos interesantes con un impacto traslacional significativo. Apoyar futuros estudios terapéuticos en investigación clínica. El desarrollo de tales ideales comunales beneficiaría enormemente a los droosófilos, a los investigadores médicos y a las ciencias biológicas y biomédicas. Y lo que es más importante, beneficiaría a la sociedad en general, ya que la financiación pública podría aplicarse de forma más traslacional para comprender y tratar las enfermedades humanas.

Los protocolos que proporcionamos aquí para la impresión 3D, los aparatos para un flylab fueron diseñados para su uso con la impresora 3D RepRap, basada en el modelo Prusa I3 DIY disponible en³⁵. Utilizamos el filamento de ácido poliláctico blanco (PLA) de 1,75 mm (SUNLU) como materia prima para la impresión, la plataforma Tinkercad³⁶ para el diseño de modelos y el software Repetier-Host³⁷ para la conversión de STL a código G, un paso necesario para proporcionar coordenadas a la impresora. Se requiere una mayor optimización de los protocolos en caso de que el lector desee utilizar equipos, materiales y software alternativos.

Protocolo

Diseño de modelos 1. 3D

NOTA: El flujo de trabajo para la impresión 3D tiene tres pasos básicos: (1) modelado 3D; (2) importar el modelo en el software de corte; y (3) seleccionar el filamento correcto, configurar la impresora y, finalmente, imprimir. A continuación se muestra un protocolo básico para modelar un estante/bandeja de viales de mosca pequeña; Este bastidor se utiliza con viales de mosca estándar, que tienen aproximadamente 2,5 cm de diámetro y 9,8 cm de altura. Para los nuevos diseños de modelos, las herramientas proporcionadas por el software Tinkercad permiten el fácil manejo de estructuras tridimensionales, mediante la creación de piezas de diferentes formas, tamaños y grosores, según las propias necesidades. Para los drosófilos que se aventuran por primera vez en el ámbito de la impresión 3D, seguir los protocolos a continuación, incluso con todos sus detalles, puede ser un desafío, por lo que recomendamos encarecidamente familiarizarse con el software para obtener los mejores resultados.

1. Inicie sesión en Tinkercad en línea³⁸ (Figura 1A). Para acceder a la plataforma, de forma gratuita, es necesario registrarse previamente con información personal.
2. Haga clic en Crear un nuevo proyecto para comenzar un nuevo diseño y cambie el nombre del proyecto en la esquina superior derecha de la ventana. Pulse Intro para dirigirse al plano de trabajo del proyecto (Figura 1B).
3. Verifique si el plano de trabajo tiene las dimensiones correctas de 200 mm x 200 mm, haciendo clic con el botón izquierdo del mouse en Editar cuadrícula en la esquina inferior derecha (cuadrado rojo en la Figura 1B). En la ventana emergente (Figura 1C), asegúrese de que las "Unidades" sean milímetros y que los "Ajustes preestablecidos" sean los predeterminados. Ingrese 200.00 en los campos "Ancho" y "Longitud", y haga clic en Actualizar cuadrícula para guardar los cambios.
4. Verifique si la cuadrícula de ajuste está configurada en 1,0 mm (cuadrado rojo en la Figura 1B). Si no es así, haga clic en el menú desplegable y seleccione 1,0 mm.
5. En el menú Formas básicas de la derecha (cuadrado azul 2 en la Figura 1B), seleccione un cuadro sólido y arrástrelo al centro del plano de trabajo.
6. Haga clic en cualquier parte del cuadro del plano de trabajo con el botón izquierdo del ratón para ver sus bordes y vértices. Haga clic en cualquier vértice (que luego se volverá rojo) para mostrar las dimensiones de la caja (cuadrados rojos en la Figura 1D). Haga clic con el botón izquierdo del ratón en cada dimensión y escriba 130 mm para la longitud (L), 130 mm para la anchura (W) y 40 mm para la altura (H). Vuelva a centrar el cuadro arrastrándolo al centro del plano de trabajo.
7. Haga clic en la herramienta Regla en la esquina superior derecha de la pantalla (cuadrado rojo 1 en la Figura 1E). Haga clic inmediatamente en el vértice inferior izquierdo del cuadro, como se indica en la Figura 1E (cuadrado rojo 2), para establecer el punto inicial (x = 0, y = 0, z = 0) de un sistema de coordenadas cartesianas tridimensional. Tenga en cuenta que ahora se mostrará la distancia entre el vértice seleccionado y el punto inicial de la coordenada (cuadrados rojos en la Figura 1F), donde "A", "B" y "C" representan la distancia a los ejes x, y y z (que debería ser cero en este caso), respectivamente.
8. A continuación, seleccione un cuadro vacío (agujero) en el menú Formas básicas de la derecha (cuadrado azul 2 en la Figura 1B) y arrástrelo al plano de trabajo. Establezca sus dimensiones en 30 (L) x 30 (W) x 40 (H) mm, y elévelo 2 mm desde el plano de trabajo, escribiendo "2.00" en el cuadro de texto junto a la punta de flecha verde en la esquina inferior derecha de la caja vacía (cuadrado rojo en la Figura 1G). Coloque la caja vacía dentro de la caja sólida a 2 mm del punto inicial de la coordenada x,y, escribiendo "2.00" en los cuadros de texto junto a las flechas verdes en la esquina inferior izquierda de la caja (cuadrados rojos en la Figura 1H; comparar con la Figura 1G).
9. Con la caja vacía aún seleccionada, presione las teclas CtrL + D en el teclado para desplegar el comando "duplicar" y crear una nueva caja vacía de exactamente las mismas dimensiones. Coloque la nueva caja vacía dentro de la caja sólida, junto a la primera caja vacía, escribiendo "34.00" en el cuadro de texto junto a la flecha verde a lo largo del eje y, y "2.00" en los cuadros de texto junto a las dos flechas verdes restantes (cuadrados rojos en la Figura 1I).
10. Repita este paso, ajustando las distancias correctas desde el punto inicial de la coordenada, hasta que toda la caja sólida esté llena de cajas vacías espaciadas a 2 mm entre sí (Figura 1J).
11. Seleccione todas las casillas (sólidas y vacías) haciendo clic con el botón izquierdo del ratón y arrastrándolas a toda la zona. Presione las teclas CtrL + G en el teclado para desplegar el comando "group" y crear una sola caja con 16 espacios vacíos para viales de mosca (Figura 1K). Este es el diseño final de la gradilla de viales.
12. Haga clic en Exportar en la esquina superior derecha de la ventana de Tinkercad. En el cuadro de ventana que se muestra (Figura 1L), seleccione Todo en el diseño junto a Incluir y . STL en Para impresión 3D como tipo de archivo. Elija un nombre propio para el archivo de diseño y guárdelo en un lugar apropiado en la computadora.

2. 3D impresión

NOTA: En esta sección, proporcionamos instrucciones sobre cómo utilizar el archivo STL creado en el paso 1 y convertirlo en el archivo de código G que contiene las instrucciones de impresión en la impresora 3D. Este es el proceso de corte, para el cual utilizamos el software Repetier-Host.

1. Descargue el Archivo Suplementario 1 y guárdelo en un lugar apropiado de la computadora. Se trata de un archivo .rcp que contiene las configuraciones de impresora que se utilizarán a continuación. Para obtener más información sobre el tipo de archivo .rcp, visite³⁹.
2. Abra el software Repetier-Host, que ya debería estar instalado en la computadora, siguiendo las instrucciones de³⁷. Presione las teclas CtrL + O en el teclado para abrir el archivo STL en la computadora creada en el Protocolo 1.
3. Una vez abierto, haga clic en el bastidor de viales diseñado y presione la tecla R en el teclado para abrir el menú de edición en el lado derecho de la pantalla (cuadrado rojo 1 en la Figura 2A). Centralice el objeto en la mesa de impresión haciendo clic en el botón Centrar objeto, indicado con el cuadrado rojo 2 en la Figura 2A, en la pestaña Colocación de objetos .
4. Haga clic en la pestaña Segmentación (cuadrado rojo 1 en la figura 2B) junto a la pestaña Ubicación de objetos y, a continuación, haga clic en el botón Configuración (cuadrado rojo 2 en la figura 2B) a continuación. Tenga en cuenta que se abrirá una nueva ventana a la izquierda donde se pueden definir los parámetros de la impresora, como la velocidad, el grosor de la capa y los soportes (consulte más detalles en la discusión a continuación).
5. Haga clic en el botón Importar (cuadrado rojo 3 en la Figura 2E), seleccione Archivo complementario 1 de los archivos y presione Entrar. Tenga en cuenta que este archivo .rcp (descargado en el paso 2.1) proporciona los parámetros para la configuración automática de la impresora que hemos optimizado para este rack de viales.
6. Para finalizar la configuración de los parámetros de impresión, seleccione Ninguno para Tipo de soporte en el menú de la derecha (cuadrado rojo 4 en la Figura 2E), ya que la impresión de esta pieza no requiere un soporte para evitar doblarse u otras deformidades. En Densidad de relleno (cuadrado rojo 5 en la Figura 2E), elija 20% para crear una estructura sólida (consulte más detalles sobre estos parámetros en la Discusión a continuación).
7. Haga clic en Slice with CuraEngine en la esquina superior derecha de la pantalla para ejecutar el programa de corte y generar el G-Code, que tiene la información necesaria para que la impresora imprima la pieza. Tenga en cuenta que en la pestaña Vista previa de impresión en el menú de la derecha (junto a la pestaña Segmentación ), se mostrará información sobre el tiempo y la cantidad de material necesario para que se complete el trabajo de impresión (cuadrado rojo 1 en la Figura 2F).
8. Haga clic en Guardar para impresión SD para guardar el archivo de código G en una tarjeta SD (cuadrado rojo 2 en la Figura 2F). Tenga en cuenta que el código G contiene las coordenadas 3D de la pieza diseñada, cortadas en capas, para el correcto funcionamiento de la impresora.
9. Inserte la tarjeta SD en la impresora 3D RepRap y, a continuación, siga la información que se muestra en la pantalla de la impresora para seleccionar la impresión desde la tarjeta SD.
10. Seleccione el archivo de código G de la gradilla de viales. Tenga en cuenta que la impresora se calentará automáticamente y comenzará a imprimir la pieza diseñada, lo que debería tardar varias horas. El bastidor (Figura 3A) debe estar listo para su uso inmediatamente después de que se complete el trabajo de impresión.

3. Aparatos de análisis conductual

NOTA: Los pasos descritos en los Protocolos 1 y 2 se pueden repetir con los ajustes adecuados para imprimir varias de las piezas de equipo de laboratorio necesarias. Sin embargo, nos damos cuenta de que el diseño de nuevas piezas puede ser un desafío y llevar mucho tiempo para los usuarios principiantes de Tinkercad, por lo que en lugar de proporcionar protocolos paso a paso sobre cómo diseñar todos los modelos, estamos poniendo a disposición para su descarga varios modelos de diseño que creamos como archivos STL (ver Archivos Suplementarios 2-11).

1. Descargue el Archivo Suplementario 2 para ver un modelo de un pequeño embudo (Figura 3B), que se usa habitualmente en los laboratorios de moscas para ayudar a transferir moscas adultas a nuevos viales o botellas evitando que las moscas trepen por las paredes internas de estos recipientes para escapar.
2. Descargue el Archivo Suplementario 3 para un soporte de tapete de golpeteo (Figura 3C), que puede contener una espuma de etileno-acetato de vinilo o un tapete de algodón grueso sobre el cual se pueden golpear frascos o botellas de vidrio cuando uno está volcando moscas en nuevos recipientes con alimentos recién hechos.
3. Descargue el Archivo Suplementario 4 y el Archivo Suplementario 5 para el modelo de un soporte de cámara que llamamos Stalker (Figura 3D).
   NOTA: El aparato permite colocar cualquier cámara (profesional, webcams, teléfonos móviles, etc.) sobre una base donde se pueda visualizar o grabar en vídeo una placa de Petri que contenga larvas o moscas adultas. Stalker permite la obtención de imágenes del comportamiento animal que tienen lugar horizontalmente, siempre a la misma distancia de la placa de Petri, lo que evita introducir variabilidad en las mediciones experimentales si las grabaciones deben realizarse en días diferentes, por ejemplo, o si la cámara necesita ser utilizada para otro propósito entre grabaciones. El aparato es convenientemente modular y se puede ensamblar fácilmente después de imprimir la base y la parte superior del archivo complementario 4, y los lados del archivo complementario 5. Los cuadrados de 1 cm^{y 2} en la base, que se pueden resaltar con un marcador permanente, ayudan a rastrear la distancia recorrida por los animales individuales. Imprime el aparato (al menos la base) con filamento blanco, de modo que haya suficiente contraste entre el fondo y los animales para que el software de seguimiento identifique a cada mosca.
4. Descargue el Archivo Suplementario 6 para el diseño imprimible del Fly Motel (Figura 3E), que tiene diez arenas de cortejo y apareamiento (habitaciones) organizadas de manera que faciliten las grabaciones de video de diez parejas de apareamiento individuales a la vez. Nótese que el Fly Motel se basa en el dispositivo publicado en el^{año 40}, donde se encuentra una explicación detallada de su uso en estudios de comportamiento. Además de las piezas impresas en 3D, el aparato requiere 12 tornillos (3 x 8 mm) para fijar la parte superior a la inferior para estabilizar el dispositivo ensamblado, una placa acrílica (60 x 60 x 3 mm) y una cremallera hermética. Debido a que la estructura del Fly Motel es más compleja, también proporcionamos un video instructivo (Archivo Suplementario 7) de cómo ensamblarlo correctamente, dado que todas las piezas necesarias y un destornillador están disponibles.
5. Descargue el Archivo Suplementario 8 para el modelo de un Laberinto T (Figura 3F), que se utiliza para ensayos de memoria con moscas adultas. Una explicación detallada de cómo se utiliza el T-Maze para hacer que las moscas asocien estímulos de olor repulsivos con su comportamiento fototrópico se encuentra en la publicación original⁴¹. El aparato también hace uso de dos tubos cónicos translúcidos de 15 mL, que se encuentran comúnmente en cualquier laboratorio y están unidos a las aberturas circulares de 2 cm de ancho a cada lado de la pieza central. Tenga en cuenta que la impresión del T-Maze requiere un soporte (ver más detalles en la leyenda de la Figura 2). Seleccione "En todas partes" para el tipo de soporte (cuadrado rojo 4 en la Figura 2E) después de seguir los pasos 2.1-2.6 anteriores.
6. Descargue el Archivo Suplementario 9 y el Archivo Suplementario 10 para el diseño de las piezas imprimibles de nuestra versión del aparato para ensayos de geotaxis negativos iterativos rápidos (RING) (Figura 3G), utilizado para realizar ensayos de escalada con moscas adultas de varios genotipos o condiciones ambientales simultáneamente, generando resultados de una manera más estandarizada y de mayor rendimiento⁴². El aparato RING también es modular, y además de las piezas impresas en 3D, requiere otras piezas que se pueden comprar fácilmente en línea o en una ferretería a bajo costo: dos ejes rectificados de Φ8 x 300 mm, cuatro cojinetes lineales de Φ8 mm, gomas elásticas (o trozos de una cuerda), una pieza de madera de 240 x 60 x 20 mm para la base, y ocho tornillos para madera (8 mm) para fijar las piezas impresas a la base de madera. Descargue el Archivo Suplementario 11 para obtener instrucciones sobre cómo ensamblar el dispositivo una vez que todas las piezas estén impresas o compradas. Una explicación detallada de cómo utilizar el aparato RING se encuentra en la publicación original⁴².

4. Ensayo de movilidad larvaria

NOTA: Hemos optimizado este protocolo, originalmente basado en Nichols et ^al.42, para estudiar los efectos de la expresión de AOX en el desarrollo de Drosophila bajo estrés por frío. Las líneas 3xtubAOX²⁵ y w¹¹¹⁸, utilizadas como ejemplos de larvas expresoras y control de AOX, respectivamente, se cultivaron en dieta estándar²⁴ a 12 °C, según Saari et al.34. Recomendamos este protocolo para analizar la movilidad de muestras de larvas de cualquier condición genética, cultivadas bajo cualquier condición ambiental de interés.

1. Prepare placas de agar al 2% hirviendo la cantidad equivalente de agar en agua desionizada, vertiéndolas en placas de Petri de Φ90 X 15 mm y dejando que se solidifiquen a temperatura ambiente. Para placas con un volumen final de 20 mL cada una, use 0,4 g de agar.
2. Recoja cuidadosamente las larvas L3 errantes del costado de los viales/frascos de cultivo con un par de pinzas de punta redonda o un cepillo, y coloque los individuos en una placa de Petri de Φ90 x 15 mm con agua desionizada durante menos de 10 segundos para enjuagar las partículas de alimentos adheridas a su cuerpo.
3. Transfiera la larva individual a platos con agarosa y espere 5 minutos para que los animales se aclimaten.
4. Coloque los platos que contienen la larva individual encima de un papel cuadriculado (cuadrícula de 0,2^cm2 ) y cuente el número de líneas atravesadas por el animal durante 1 minuto, a medida que se mueve sobre el agar. Cada línea cruzada representa una distancia de 2 mm. Repita el procedimiento con el mismo individuo de 10 a 15 veces para obtener réplicas técnicas.
5. Repita el paso 4.4 con al menos 8-10 individuos de diferentes tubos/matraces, cultivados en diferentes momentos para obtener réplicas biológicas de la misma línea.
6. Repita los pasos 4.4 y 4.5 para obtener datos para la otra línea de mosca (o para tantas líneas como se pretenda analizar).
7. Las mismas larvas individuales utilizadas en los pasos 4.4-4.6 pueden utilizarse para obtener datos adicionales sobre el movimiento corporal colocando las placas de agar con una larva individual bajo un microscopio estereoscópico y contando el número de contracciones peristálticas de la pared corporal durante 1 minuto. Obtener réplicas técnicas y biológicas para estimar la movilidad media entre las líneas de mosca analizadas.
8. Aplicar la prueba estadística para calcular la probabilidad de que los valores de estos parámetros de movilidad larvaria sean distintos entre las líneas de interés. Debido a que estamos comparando aquí datos de solo dos líneas, se puede aplicar una prueba t de Student.

5. Respirometría mitocondrial mediante homogeneizados larvarios

NOTA: El siguiente protocolo fue optimizado para medir el consumo de oxígeno mitocondrial de los homogeneizados larvarios de la línea de expresión de AOX 3xtubAOX y el control w¹¹¹⁸, cultivados a 12°C, pero también recomendamos su uso para muestras de larvas de cualquier condición genética y ambiental. Nos damos cuenta de que la realización de este tipo de experimentos no debe incluirse como un objetivo "asequible" para un flylab "casero", a diferencia de todos los demás protocolos que proporcionamos en este artículo, ya que se debe realizar una inversión inicial considerable para que un laboratorio adquiera un oxígrafo de alta resolución. El protocolo se utilizará con el Oxygraph-2k (O2k) y el software DatLab de Oroboros Instruments, por lo que se requiere una mayor optimización en caso de que el lector desee utilizar un equipo alternativo.

1. Encienda el O2k e inicie el software DatLab en la computadora conectada al oxígrafo. Las barras magnéticas dentro de las cámaras de ensayo deben comenzar a agitarse automáticamente. Retire la solución de almacenamiento de etanol de las cámaras.
2. Lavar las cámaras al menos 3 veces con etanol 100% y 3 veces con agua ultrapura.
3. En DatLab, la ventana O2k Control se abrirá automáticamente. En Temperatura del bloque [°C], introduzca 12 °C (o la temperatura preferida en el rango de 2-47 °C) y pulse OK.
4. A continuación, se abrirá automáticamente una segunda ventana, Editar experimento. Introduzca los nombres de las muestras en los campos Muestra , de acuerdo con lo que se añadirá en las cámaras A y B, y pulse Guardar.
5. Añadir 1800 μL del tampón de ensayo (120 mM de KCl, 5 mM de KH₂PO₄, 3 mM de Hepes, 1 mM de EGTA, 1 mM de MgCl₂, 2% de BSA, pH 7,4) en cada cámara y cerrarlas parcialmente, permitiendo aún el intercambio de oxígeno con el aire exterior. Permita que la concentración de oxígeno y las señales de flujo de oxígeno se estabilicen, mostrando fluctuaciones mínimas durante al menos 10 minutos. Este paso proporcionará la calibración del equipo con el aire exterior el día del experimento (véanse los pasos 6.3 y 6.4 a continuación para obtener más detalles sobre las calibraciones experimentales).
6. Durante la etapa de calibración del aire, inicie la preparación de la muestra recogiendo cuidadosamente de los tubos/matraces de cultivo 20 larvas errantes del genotipo apropiado, utilizando un par de pinzas o un pincel pequeño.
7. Enjuague cada larva rápida pero minuciosamente con agua desionizada o 1x PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM de Na₂HPO₄ y 2 mM de KH₂PO₄) y transfiérelas a un homogeneizador de vidrio de 1 mL en hielo, que contenga 500 μL de tampón de aislamiento helado (250 mM de sacarosa, 5 mM de Tris HCl, 2 mM EGTA, pH 7,4)
8. Homogeneizar las larvas enteras con 5 golpes y verter el homogeneizado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL sobre hielo.
9. Añadir 300 μL de tampón de aislamiento al homogeneizador de vidrio, macerar aún más los tejidos larvarios restantes con 3 pasadas y verter de nuevo el homogeneizado en el mismo tubo de microcentrífuga sobre hielo.
10. Añadir 200 μL de tampón de aislamiento al homogeneizador de vidrio, macerar aún más los tejidos larvales residuales con 2 pasadas y verter de nuevo el homogeneizado en el mismo tubo de microcentrífuga sobre hielo.
11. Mezcle el homogeneizado final (~ 1 mL) invirtiendo el tubo dos veces suavemente y manténgalo en hielo hasta que se procese la segunda muestra.
12. Repita los pasos 5.6-5.11 para obtener el homogeneizado larvario del otro genotipo.
13. Abra las cámaras de oxígrafo A y B y transfiera 200 μL de cada homogeneizado al tampón de ensayo en cada cámara, que debe estar exactamente a 12 °C en este punto. Cierre las cámaras completamente y permita que la concentración de oxígeno y las señales de flujo de oxígeno se estabilicen durante aproximadamente 10 minutos.
14. Inicie las mediciones de consumo de oxígeno añadiendo a cada cámara 5 μL de una solución de piruvato 2 M, 2 M de prolina (concentración final en las cámaras = 5 mM cada una) y 7,5 μL de una solución de malato 0,4 M (1,5 mM). Espere al menos 5 minutos para la estabilización de la señal. Tenga en cuenta que en este punto, las mitocondrias se cargarán con sustratos oxidables para iniciar las reacciones del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). Cualquier aumento en la señal de consumo de oxígeno puede deberse a las funciones de desacoplamiento de proteínas (o debido a otros fenómenos de desacoplamiento), y se puede utilizar para calcular la respiración desacoplada general (también conocida como respiración por fuga en ausencia de adenilatos, L_N- consulte los resultados representativos para obtener más detalles).
15. Añada a cada cámara 4 μL de una solución de 0,5 M de ADP (1 mM) y espere al menos 5 minutos para la estabilización de la señal. Por lo general, se observa inmediatamente un aumento significativo en la señal de consumo de oxígeno, que representa la respiración fosforiladiva oxidativa (OXPHOS). La gran mayoría de esta respiración de OXPHOS es impulsada por el complejo I (CI).
16. Añadir a cada cámara 2 μL de una solución de 0,05 M de antimicina A (0,05 mM) para inhibir la CIII, y esperar al menos 5 minutos para la estabilización de la señal. En la muestra de control w ¹¹¹⁸ se debe observar una disminución en la señal de consumo de oxígeno hasta los niveles basales observados antes de la adición de piruvato, prolina y malato. La respiración mitocondrial de las larvas que expresan AOX será parcialmente resistente a la antimicina-A, ya que los electrones ahora se pueden dirigir a AOX. Alrededor del 40% de la respiración total de OXPHOS debe permanecer después de la inhibición de CIII, que debe ser respaldada únicamente por AOX.
17. Añadir a cada cámara 4 μL de una solución de 0,1 M de propilgalato (0,2 mM) para inhibir la AOX, y espere al menos 15 minutos para la estabilización de la señal. Los niveles de consumo de oxígeno en las muestras de larvas que expresan AOX ahora deberían disminuir a los niveles basales observados antes de la adición de piruvato, prolina y malato. Esta disminución demuestra que la respiración resistente a la antimicina-A observada se debe a la función AOX.
18. Añadir a cada cámara 1 μL de rotenona 0,01 M (0,005 mM) para inhibir la IC, y esperar al menos 5 minutos para que la señal se estabilice para obtener la señal de consumo de oxígeno de la muestra independiente de la respiración mitocondrial. Esta señal suele ser tan baja como la observada antes de la adición de piruvato, prolina y malato.
19. Guarde el experimento y cierre el software DatLab.

6. Procesamiento de datos de la respirometría mitocondrial

NOTA: Los valores de consumo de oxígeno se obtienen como un promedio de las señales de flujo de oxígeno en un período de tiempo determinado y se expresan como pmol O₂ consumido por segundo por mg de proteína total en la muestra. Los valores se comparan en primer lugar con la concentración máxima de oxígeno disponible en el tampón de ensayo el día del experimento, en función de la temperatura experimental (denominada saturación de aire) y la concentración mínima de oxígeno, que se determina previamente en cada cámara mediante la adición de Na₂S₂O₄ al tampón de ensayo (véase ⁴³ para las pautas del fabricante para obtener una calibración de oxígeno cero). Los valores también se normalizan por la cantidad de proteína total en los homogeneizados larvarios añadidos al tampón de ensayo de cada cámara.

1. Determinar la concentración total de proteína de cada muestra utilizando el método de Bradford⁴⁴. Vuelva a abrir el experimento guardado en el software DatLab, presione Experimento en el menú superior y, a continuación, Editar. En la ventana abierta, seleccione mg en la sección Unidad y en la sección Cantidad introduzca la cantidad de proteína contenida en los 200 μL de la muestra añadida en cada cámara. La concentración será calculada automáticamente por el software, considerando el volumen total de la cámara de 2 mL. Presione el botón Guardar .
2. Presione Gráfico en el menú superior y, a continuación, Seleccionar gráficos. En la ventana abierta, seleccione Flujo por masa para ambos gráficos (1 y 2, que se refieren a las cámaras A y B, respectivamente). Presione Aceptar. El resultado experimental ahora está normalizado por la concentración de proteína de las muestras (pmol O₂/s/mg de proteína total).
3. En la esquina superior derecha de cada gráfico (1 y 2) de la página principal de resultados experimentales, haga clic en Concentración de_O2. A lo largo del eje x, identifique un intervalo de tiempo antes de la adición de las muestras en las cámaras, en el que la concentración de oxígeno y las señales de flujo son muy estables.
   1. Mantenga presionada la tecla Shift en el teclado de la computadora, haga clic con el botón izquierdo del mouse en la hora inicial seleccionada, arrastre el cursor a lo largo del eje de tiempo para seleccionar la región deseada y suelte el botón del mouse. Realice este procedimiento para cada uno de los gráficos individualmente.
   2. Haga doble clic en las barras azules de las áreas seleccionadas en la parte inferior de los gráficos y escriba "aire" para indicar que estas son las regiones seleccionadas utilizadas para calcular la saturación de oxígeno y aire.
4. Haga clic en Calibración en la barra de menú superior y seleccione A: Oxígeno, O₂ para calibrar la cámara A. En la ventana abierta, verifique que O₂ Calib esté seleccionado (color amarillo).
   1. Para la calibración cero, haga clic en Copiar de archivo y elija el archivo con la calibración de oxígeno cero realizada anteriormente (consulte ⁴³ para conocer las pautas del fabricante).
   2. En Calibración de aire, seleccione aire en la columna Seleccionar marca . Haga clic en Calibrar y copiar al portapapeles.
5. Haga clic en Calibración en la barra de menú superior, seleccione B: Oxígeno, O₂ y repita el paso 6.4 para calibrar la cámara B.
6. En la esquina superior derecha de cada gráfico (1 y 2) de la página principal de resultados experimentales, haga clic en Flujo de O₂ por masa. Seleccione las regiones estables deseadas de la señal de consumo de oxígeno manteniendo presionada la tecla Shift en el teclado, haciendo clic con el botón izquierdo del mouse y arrastrando el cursor a lo largo del eje de tiempo. Las regiones estables seleccionadas entre las adiciones de piruvato/prolina/malato y ADP representan el L_N; entre ADP y antimicina A, OXPHOS; entre la antimicina A y el galato de propilo (tras la inhibición de CIII), respiración resistente a la antimicina A; entre galato de propilo y rotenona (tras la inhibición de CIII+AOX), respiración residual; después de la rotenona (tras la inhibición de CI+CIII+AOX), respiración no mitocondrial residual. Haga doble clic en las barras rojas de las áreas seleccionadas en la parte inferior de los gráficos e introduzca las etiquetas adecuadas.
7. Haga clic en Marcas en la barra de menú superior y luego en Estadísticas. En la pestaña Mostrar de la ventana abierta, desmarque todas las opciones excepto O₂ flujo por masa. En la pestaña Seleccionar de la misma ventana, seleccione la cámara A para obtener los datos de respiración de la primera muestra. Haga clic en Copiar al portapapeles y pegue los datos en una hoja de cálculo. Repita el procedimiento para obtener los datos de la segunda muestra en la cámara B.
8. En una hoja de cálculo, reste todos los valores de respiración por la respiración residual no mitocondrial (los datos después de la adición de rotenona). Calcule promedios a partir de múltiples réplicas experimentales y trace los datos como prefiera.

Resultados

Siguiendo los pasos de los Protocolos 1 y 2, uno debería ser capaz de diseñar un simple rack de viales de mosca, y ejecutar el archivo STL del modelo a través del programa de corte para generar coordenadas para la impresora 3D. La figura 3A muestra una unidad impresa del modelo junto a su diseño. También esperamos que el paso 1 pueda proporcionar las habilidades básicas para utilizar las formas básicas disponibles en la plataforma Tinkercad para crear...

Discusión

Los protocolos de impresión 3D y los archivos STL proporcionados aquí están destinados a facilitar la configuración de un nuevo flylab o a aumentar el repertorio de aparatos en una instalación de comportamiento de Drosophila existente, utilizando equipos "caseros". La estrategia de impresión 3D puede ser particularmente útil en países en desarrollo como Brasil, donde la investigación con Drosophila como organismo modelo para estudiar la biología humana parece ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer RapRep			A popular 3D-printer based on the Prusa I3 DIY mode, instructions available in https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/
3xtubAOX fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line expressing the AOX gene from C. intestinalis under the control of the constitutive α-tubulin promoter. 5 and 6 copies of this construct are present in males and females in homo/hemizigosity, respectively, one in each of the chromosomes X, 2 and 3.
Acrylic plate			60 x 60 x 3 mm
ADP	Sigma-Aldrich	A2754	Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 20398-34-9); ≥95%; molecular weight = 427.20 g/mol; solubility in water at 50 mg/ml
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight ~ 548.63 g/mol; solubility in 95% ethanol at 50 mg/mL
Agar	Kasv	K25-611001	For bacteriologal use; powder; solidifying agent (12-20 g/L)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free (CAS number 9048-46-8);pH 7; ≥98%; solubility in water 40g/ml
Deionized water
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 67-42-5); ≥97%; molecular weight = 380.35g/mol
Ethanol 99.5%
Ethylene-vinyl acetate foam			Can be replaced with thick pieces of cotton
Graph paper			0.2 cm2 grid
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9), BioPerformance Certified; ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight =238.30g/mol
Homogenizer	Sartorius		Hand glass homogenizer (S), 1 mL; composed of a cylinder made of borosilicate glass plus plunger S; often used for simple sample preparation, e.g. crushing of tissue samples.
KCl	Amresco	0395-2	Potassium chloride (CAS number 7447-40-7); ≥99,0%; molecular weight = 74.55g/mol
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Potassium phophate monobasic (CAS number 7778-77-0); ReagentPlus; molecular weight = 136.09g/mol
Linear bearings (LM8UU)			8 mm, any brand
Malate	Sigma-Aldrich	M1000	L-(-)-Malic acid (CAS number 97-67-6); ≥95-100%; molecular weight = 134.09 g/mol), solubility in water: 100 mg/mL. A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
MgCl2	Amresco	0288-1KG	Magnesium chloride, hexahydrate (CAS number 7791-18-6); 99%-102%; molecular weight = 203.3g/mol
Microcentrifuge tubes			1.5mL; Graduated every 100µL, autoclavable
Na2HPO4	Amresco	0348-1KG	Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (CAS number 7782-85-6); 98-102%; molecular weight = 268.07 g/mol
NaCl	Honeywell	31434-1KG	Sodium chloride (CAS number 7647-14-5); ≥99,5%; molecular weight 58,44g/mol. For laboratory use only.
Oxigraph-O2k	Oroboros	10000-02	Series D-G; O2k-Core: includes O2k-Main Unit with stainless steel housing, O2k-Assembly Kit, two OroboPOS (polarographic oxygen sensors) and OroboPOS-Service Kit, DatLab software, the ISS-Integrated Suction System and the O2k-Titration Set.
Permanent marker			Preferably black
Petri dishes			90 X 15 mm dishes; commonly used for bacteriological culture
PLA 3D Printing Filament	Quantum3D Printing	http://quantum3dprinting.com/	High quality polylatic acid filament (PLA), strongly recomended, (1.0 kg Roll), any brand
Proline	Sigma-Aldrich	P0380	L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	P3130	Propyl gallate (CAS number 121-79-9); powder; ≥98%; molecular weight = 212.2 0g/mol; solubility in ethanol at 50 mg/ml
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol; solubility in water at 100 mg/mL
Rectified shafts			8 x 300 mm, any brand
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/mol
Rubber bands			Can be replaced with pieces of a string
Screwdriver			To assemble some of the 3D-printed apparatuses
Screews			M3 x 8 mm
SD Card			At least 32Mb in size; usually provided with 3D printers
Software Repetier Host	Hot-World GmbH & Co. KG	https://www.repetier.com/	Excellent slicing software, available free of cost
Software Tinkercad	Autodesk	https://www.tinkercad.com	3D model design software, available free of cost
Stereomicroscope	Leica	M-80	Stereomicroscope, zoom 7.5-60X + Leica cls 150 led light source
Sucrose	Merck	107,651,000	Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1);
Tris	Amersham Biosciences	17-1321-01	Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (CAS number 77-86-1); 99,8-100.1%; molecular weight 121.14 g/mol
Tweezer/forceps	Stark	ST08710	Histological tweezer, straight, round tip, 12 cm, AISI-410 stainless steel
w1118 fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line used as genetic background control for 3XtubAOX
Wood plate			240 x 60 x 20 mm
Zip tights			2 x 210 mm, any brand