Доступная и эффективная «домашняя» платформа для поведенческих исследований дрозофил и сопутствующий протокол для личиночной митохондриальной респирометрии

Резюме

Мы предоставляем протоколы для всех, кто придерживается «культуры создателей», чтобы начать создание флайлаборатора для количественного анализа множества поведенческих параметров у Drosophila melanogaster путем 3D-печати многих необходимых единиц оборудования. Мы также описываем протокол респирометрии высокого разрешения с использованием личинок для объединения поведенческих и митохондриальных данных метаболизма.

Аннотация

Полезность дрозофилы в качестве модельного организма для изучения болезней человека, его поведения и основ биологии неоспорима. Несмотря на практическую целесообразность, исследования дрозофил не пользуются популярностью в развивающихся странах, возможно, из-за ошибочной идеи о том, что создание лаборатории и проведение соответствующих экспериментов с такими крошечными насекомыми является сложным процессом и требует дорогостоящих специализированных аппаратов. В этой статье мы расскажем, как построить доступную по цене флайлабораторию для количественного анализа множества поведенческих параметров D. melanogaster путем 3D-печати многих необходимых единиц оборудования. Мы предоставляем протоколы для создания штативов для флаконов, арен для ухаживания, аппаратов для локомоторных анализов и т. д., которые будут использоваться для общего содержания мух и проведения поведенческих экспериментов с участием взрослых мух и личинок. Мы также предоставляем протоколы о том, как использовать более сложные системы, такие как оксиграф с высоким разрешением, для измерения потребления митохондриального кислорода в образцах личинок и показать его связь с поведенческими изменениями у личинок на ксенотопическую экспрессию митохондриальной альтернативной оксидазы (AOX). AOX увеличивает активность личинок и митохондриальное дыхание, а также ускоряет развитие при низких температурах, что согласуется с термогенной ролью фермента. Мы надеемся, что эти протоколы вдохновят исследователей, особенно из развивающихся стран, использовать дрозофилу для легкого объединения данных о поведении и метаболизме митохондрий, что может привести к получению информации о генах и/или условиях окружающей среды, которые также могут регулировать физиологию человека и его болезненные состояния.

Введение

Drosophila melanogaster была представлена научному сообществу как потенциально мощный модельный организм более 100 лет назад. Этот потенциал был твердо подтвержден в нескольких областях биологических и биомедицинских наук, таких как генетика, эволюция, биология развития, нейробиология, а также молекулярная и клеточная биология. В результате, шесть Нобелевских премий по медицине и физиологии были присуждены десяти исследователям дрозофил, которые внесли существенный вклад в наше понимание наследственности, мутагенеза, врожденного иммунитета, циркадных ритмов, обоняния и развития^. Возможно, еще более важно то, что D. melanogaster не перестает предоставлять нам новые модели биологии и болезней человека, поскольку быстрый поиск на PubMed выдает почти 600 публикаций за последние 5 лет с использованием поискового термина «модель дрозофилы» (², по состоянию на февраль 2021 года). В США, где дрозофила является широко распространенным модельным организмом в биомедицинском сообществе, около 2,2% всех исследовательских премий R01, присужденных NIH в 2015 году, были выделены^{исследователям} дрозофилы. С другой стороны, в Бразилии поиск финансируемых в настоящее время проектов на веб-сайте Исследовательского фонда Сан-Паулу (FAPESP), самого важного агентства по финансированию исследований во всех научных областях в штате Сан-Паулу, показал только 24 гранта и стипендии с дрозофилой в качестве основного предмета^{исследования.} Учитывая все 13205 проектов, которые в настоящее время финансируются FAPESP (⁵, по состоянию на февраль 2021 года), эти 24 проекта Drosophila составляют менее 0,2% от общего числа проектов, что почти в 12 раз ниже, чем у NIH. Если мы уберем финансируемые проекты, направленные на изучение дрозофилы с экологической и/или эволюционной точки зрения, и предположим, что оставшиеся проекты используют этот организм в качестве модели для понимания биологических процессов человека в здоровье и болезни, то это соотношение уменьшится до шокирующих ~0,1%.

На самом деле, необходимо провести надлежащее расследование, чтобы выявить причины, по которым исследования дрозофилы в Бразилии/Сан-Паулу не кажутся столь значительными в числе финансируемых проектов. Выращивание дрозофилы ^{не является дорогостоящим 6,7,8} и относительно простым, так как в отличие от позвоночных, для экспериментов не требуется разрешение биоэтического комитета ^9,10. Тем не менее, в Бразилии¹¹ требуется разрешение на работу с генетически модифицированными нахлыстовыми лесками, что добавляет слой бюрократии, присущий всем работам, связанным с генетически модифицированными организмами. Тем не менее, это, вероятно, не помешает заинтересованным исследователям инициировать создание флайлаб. Мы предполагаем, что неверная информация о мощности модели и об ожидаемых высоких затратах, связанных с созданием flylab и проведением значимых экспериментов, являются важными факторами при принятии этого решения. Как и в случае с большинством научного оборудования и расходных материалов, соответствующие аппараты для выполнения общего технического обслуживания мух и поведенческого анализа должны быть импортированы в Бразилию из Северной Америки, Европы и/или других стран, что является дорогостоящим и чрезвычайно трудоемким^{процессом.}

В последнее время появилась альтернатива импорту специализированных аппаратов, так как 3D-принтеры стали более дешевыми и доступными для любого человека, в том числе для исследователей дрозофил в развивающихся странах. Технология 3D-печати широко используется в последние 10 лет представителями «культуры производителей», в основе которой лежит идея самодостаточности, а не исключительно полагаясь^{на продукцию собственного} производства. Такая идея всегда присутствовала в академических исследовательских лабораториях по всему земному шару, поэтому неудивительно, что 3D-принтеры стали стандартным лабораторным оборудованием во^{многих местах.} В течение нескольких лет мы печатали на 3D-принтере стеллажи для флаконов, брачные арены, альпинистские снаряды, среди прочего, за небольшую часть стоимости брендовых аналогов. Снижение затрат на печать и сборку самодельного лабораторного оборудования классически представлено FlyPi, который может быть изготовлен менее чем за 100,00 евро и служит световым и флуоресцентным микроскопом, способным использовать сложную опто- и термогенетическую стимуляцию генетически податливых рыбок данио, дрозофил и нематод^. Здесь мы предоставляем серию протоколов для всех, кто заинтересован в том, чтобы стать исследователем дрозофил (или расширить свою собственную существующую лабораторию Flylab) для 3D-печати многих необходимых материалов. Потратив время и накопив немного опыта, читатель даже сможет оптимизировать представленные здесь протоколы для печатных устройств, лучше адаптированных к его собственным исследовательским потребностям.

Тем не менее, flylab — это не только «дешевое» оборудование, особенно когда предполагается связать поведенческий анализ с основными метаболическими явлениями. Нас также интересовала роль митохондрий в модуляции поведенческих паттернов дрозофилы, поскольку эти органеллы отвечают за массовое производство АТФ в большинстве тканей через несколько метаболических путей, продукты которых сходятся к окислительному фосфорилированию (OXPHOS). Анализ потребления кислорода митохондриями как способ понять метаболизм митохондрий требует оксиграфа, который представляет собой более сложное оборудование, которое, к сожалению, пока не может быть напечатано на 3D-принтере. Поскольку OXPHOS влияет практически на все клеточные процессы, поскольку он зависит от ряда эксергонных окислительно-восстановительных реакций, происходящих в клетке^17,18, скорость потребления кислорода, основанная на окисляемом субстрате, обеспечиваемом митохондриями, может помочь определить, является ли функционирование органеллы причиной или следствием определенного поведения. Поэтому мы также приводим здесь протокол для измерения потребления кислорода митохондриями в образцах личинок, поскольку мы понимаем, что подавляющее большинство опубликованных протоколов сосредоточено на анализе образцов взрослых особей. Мы показываем, что изменения в митохондриальном дыхании, вызванные трансгенной экспрессией альтернативной оксидазы Ciona intestinalis (AOX), приводят к увеличению подвижности личинок при холодовом стрессе. Скорее всего, это связано с термогенезом, так как AOX является непротонной насосной оксидазой, которая может обходить активность комплексов OXPHOS III и IV (CIII и CIV), не внося свой вклад в потенциал митохондриальной мембраны (ΔΨm) и продукцию АТФ 19,20,21. Ни одно насекомое, включая дрозофилу или позвоночных, в природе не обладает AOX 21,22,23, но его экспрессия в мириадах модельных систем 24,25,26,27,28,29 успешно продемонстрировала его терапевтический потенциал при состояниях общего митохондриального респираторного стресса, особенно когда они вызваны CIII и/или CIV перегрузка. AOX придает устойчивость к токсическим уровням антимицина А²⁴ и цианида^24,25 и смягчает различные фенотипы, связанные с митохондриальной дисфункцией 24,25,30,31,32. Тот факт, что экспрессия AOX изменяет поведение личинок и функцию митохондрий, оправдывает более глубокие исследования роли этого фермента в метаболизме и физиологии клеток и тканей многоклеточных^33,34.

Мы надеемся, что с помощью этой статьи мы сможем помочь повысить осведомленность научного сообщества развивающихся стран, таких как Бразилия, о том, что использование превосходного набора генетических инструментов, представленных D. melanogaster , в сочетании с эффективными и доступными самодельными аппаратами для поведенческого анализа, может относительно быстро получить базовые исследовательские данные об интересных биологических процессах со значительным трансляционным воздействием. поддержка будущих терапевтических исследований в клинических исследованиях. Развитие таких общинных идеалов принесло бы большую пользу дрозофилам, медицинским исследователям, а также биологическим и биомедицинским наукам. Самое главное, это принесет пользу обществу в целом, поскольку государственное финансирование может быть использовано более трансляционно для понимания и лечения болезней человека.

Протоколы, которые мы приводим здесь для 3D-печати Аппараты для флайлаба были разработаны для использования с 3D-принтером RepRap на основе модели Prusa I3 DIY, доступной в³⁵ лет. Мы используем 1,75-миллиметровую нить белой полимолочной кислоты (PLA) (SUNLU) в качестве сырья для печати, платформу Tinkercad³⁶ для проектирования моделей и программное обеспечение Repetier-Host³⁷ для преобразования STL в G-код, что является необходимым шагом для предоставления координат принтеру. Дальнейшая оптимизация протоколов требуется в случае, если читатель хочет использовать альтернативное оборудование, материалы и программное обеспечение.

протокол

1. 3D дизайн модели

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс 3D-печати состоит из трех основных этапов: (1) 3D-моделирование; (2) импорт модели в программное обеспечение для нарезки; и (3) выбор правильного филамента, настройка принтера и, наконец, печать. Ниже приведен базовый протокол моделирования небольшой решетки/лотка для флаконов с мухами; Этот штатив предназначен для использования со стандартными флаконами от мух, которые имеют диаметр около 2,5 см и высоту 9,8 см. Для новых моделей инструменты, предоставляемые программным обеспечением Tinkercad, позволяют легко работать с трехмерными структурами, создавая детали различных форм, размеров и толщины в соответствии с собственными потребностями. Для дрозофилов, впервые решающихся на 3D-печать, следование приведенным ниже протоколам, даже со всеми их деталями, все еще может быть сложной задачей, поэтому мы настоятельно рекомендуем ознакомиться с программным обеспечением для достижения наилучших результатов.

1. Войдите в Tinkercad online³⁸ (рис. 1A). Для бесплатного доступа к платформе требуется предварительная регистрация с использованием личной информации.
2. Нажмите « Создать новый проект », чтобы начать новый дизайн, и переименуйте проект соответствующим образом в правом верхнем углу окна. Нажмите клавишу Enter , чтобы перейти к рабочей плоскости проекта (Рисунок 1B).
3. Убедитесь, что рабочая плоскость имеет правильные размеры 200 мм x 200 мм, щелкнув левой кнопкой мыши по Edit Grid в правом нижнем углу (красный квадрат на рисунке 1B). Во всплывающем окне (Рисунок 1С) убедитесь, что «Единицы» указаны в миллиметрах, а «Пресеты» установлены по умолчанию. Введите 200.00 в поля "Ширина" и "Длина" и нажмите " Обновить сетку ", чтобы сохранить изменения.
4. Убедитесь, что сетка привязки установлена на 1,0 мм (красный квадрат на рисунке 1B). Если его нет, нажмите на выпадающее меню и выберите 1,0 мм.
5. В меню «Основные фигуры» справа (синий квадрат 2 на рисунке 1B) выберите сплошной прямоугольник и перетащите его в центр рабочей плоскости.
6. Щелкните в любом месте прямоугольника рабочей плоскости левой кнопкой мыши, чтобы увидеть его края и вершины. Нажмите на любую вершину (которая затем станет красной), чтобы показать размеры коробки (красные квадраты на рисунке 1D). Щелкните левой кнопкой мыши по каждому размеру и введите 130 мм для длины (L), 130 мм для ширины (W) и 40 мм для высоты (H). Отцентрируйте коробку, перетащив ее в середину рабочей плоскости.
7. Нажмите на инструмент Линейка в правом верхнем углу экрана (красный квадрат 1 на рисунке 1Е). Немедленно щелкните по нижней левой вершине прямоугольника, как показано на рисунке 1E (красный квадрат 2), чтобы установить начальную точку (x = 0, y = 0, z = 0) трехмерной декартовой системы координат. Обратите внимание, что теперь будет отображаться расстояние между выбранной вершиной и начальной точкой координат (красные квадраты на рисунке 1F), где "A", "B" и "C" представляют расстояние до осей x, y и z (которые в данном случае должны быть равны нулю) соответственно.
8. Затем выберите пустое поле (отверстие) в меню «Основные фигуры» справа (синий квадрат 2 на рисунке 1B) и перетащите его в рабочую плоскость. Установите его размеры на 30 (Д) x 30 (Ш) x 40 (В) мм и поднимите его на 2 мм от рабочей плоскости, набрав «2.00» в текстовом поле рядом с зеленой стрелкой в правом нижнем углу пустого поля (красный квадрат на рисунке 1G). Расположите пустое поле внутри сплошного поля на расстоянии 2 мм от начальной точки координат x,y, набрав «2.00» в текстовых полях рядом с зелеными стрелками в левом нижнем углу поля (красные квадраты на рисунке 1H; сравните с рисунком 1G).
9. Выделив пустое поле, нажмите клавиши CtrL+D на клавиатуре, чтобы развернуть команду «дублировать» и создать новое пустое поле точно таких же размеров. Поместите новое пустое поле внутри сплошного поля, рядом с первым пустым полем, набрав «34.00» в текстовом поле рядом с зеленой стрелкой по оси y и «2.00» в текстовых полях рядом с двумя оставшимися зелеными стрелками (красные квадраты на рисунке 1I).
10. Повторяйте этот шаг, корректируя правильные расстояния от начальной точки координат, пока весь твердый короб не заполнится пустыми коробками, расположенными на расстоянии 2 мм друг от друга (рисунок 1J).
11. Выделите все поля (сплошные и пустые), щелкнув левой кнопкой мыши и перетащив их на всю область. Нажмите клавиши CtrL+G на клавиатуре, чтобы развернуть команду «group» и создать одну коробку с 16 пустыми местами для флаконов с мухами (рис. 1K). Такова окончательная конструкция стеллажа для флаконов.
12. Нажмите на кнопку «Экспорт» в правом верхнем углу окна Tinkercad. В открывшемся окне (рис. 1L) выберите Everything in the design рядом с Include и . STL в разделе Для 3D-печати в качестве типа файла. Выберите собственное имя для файла дизайна и сохраните его в соответствующем месте на компьютере.

2. 3D печать

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе мы предоставляем инструкции о том, как использовать файл STL, созданный на шаге 1, и преобразовать его в файл G-кода, содержащий инструкции по печати на 3D-принтере. Это процесс нарезки, для которого мы используем программное обеспечение Repetier-Host.

1. Скачайте Supplemental File 1 и сохраните его в соответствующем месте на компьютере. Это файл .rcp, содержащий конфигурации принтера, которые будут использоваться ниже. Чтобы получить дополнительную информацию о типе файла .rcp, посетите^{сайт 39}.
2. Откройте программное обеспечение Repetier-Host, на котором уже должен быть установлен компьютер, следуя инструкции от³⁷. Нажмите клавиши CtrL+O на клавиатуре, чтобы открыть файл STL на компьютере, созданном в соответствии с протоколом 1.
3. После открытия нажмите на предназначенную штатив для флаконов и нажмите клавишу R на клавиатуре, чтобы открыть меню редактирования в правой части экрана (красный квадрат 1 на рисунке 2A). Централизуйте объект на печатном столе, нажав кнопку « Центрировать объект », обозначенную красным квадратом 2 на рисунке 2A, на вкладке «Размещение объекта ».
4. Нажмите на вкладку «Срез» (красный квадрат 1 на рисунке 2B) рядом с вкладкой «Размещение объекта », а затем нажмите на кнопку «Конфигурация » (красный квадрат 2 на рисунке 2B) ниже. Обратите внимание, что слева откроется новое окно, в котором можно задать параметры принтера, такие как скорость, толщина слоя и держатели (подробнее см. в разделе Обсуждение ниже).
5. Нажмите на кнопку Import (красный квадрат 3 на рисунке 2E), выберите Supplemental File 1 из файлов и нажмите Enter. Обратите внимание, что этот файл .rcp (загруженный на шаге 2.1) предоставляет параметры для автоматической настройки принтера, который мы оптимизировали для этой стойки для флаконов.
6. Чтобы завершить настройку параметров печати, выберите «Нет» в поле «Тип поддержки» в меню справа (красный квадрат 4 на рисунке 2E), так как печать этой детали не требует опоры для предотвращения изгиба или других деформаций. В поле «Плотность заполнения » (красный квадрат 5 на рисунке 2E) выберите 20% для создания твердотельной структуры (подробнее об этих параметрах см. в разделе «Обсуждение» ниже).
7. Нажмите « Срез с помощью CuraEngine » в правом верхнем углу экрана, чтобы запустить программу нарезки и сгенерировать G-код, который содержит информацию, необходимую принтеру для печати детали. Обратите внимание, что на вкладке «Предварительный просмотр печати » в меню справа (рядом с вкладкой «Срез») будет отображаться информация о времени и количестве материала, необходимого для выполнения задания на печать (красный квадрат 1 на рисунке 2F).
8. Нажмите « Сохранить для печати на SD», чтобы сохранить файл G-кода на SD-карте (красный квадрат 2 на рисунке 2F). Обратите внимание, что G-код содержит 3D-координаты спроектированной детали, нарезанные на слои, для правильной работы принтера.
9. Вставьте SD-карту в 3D-принтер RepRap, а затем следуйте инструкциям на экране принтера, чтобы выбрать печать с SD-карты.
10. Выберите файл G-кода штатива для флаконов. Обратите внимание, что принтер автоматически прогреется и начнет печать разработанного изделия, что должно занять несколько часов. Штатив (рис. 3A) должен быть готов к использованию сразу после завершения задания на печать.

3. Аппараты поведенческого анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, описанные в Протоколах 1 и 2, могут быть повторены с соответствующими настройками для печати нескольких необходимых единиц лабораторного оборудования. Тем не менее, мы понимаем, что проектирование новых деталей может быть сложным и трудоемким для начинающих пользователей Tinkercad, поэтому вместо того, чтобы предоставлять пошаговые протоколы по проектированию всех моделей, мы делаем доступными для загрузки несколько созданных нами проектных моделей в виде файлов STL (см. Дополнительные файлы 2-11).

1. Загрузите Дополнительный файл 2 для модели небольшой воронки (рис. 3B), обычно используемой в flylabs для переноса взрослых мух в новые флаконы или бутылки, избегая мух, заползающих вверх по внутренним стенкам этих контейнеров, чтобы сбежать.
2. Загрузите Дополнительный файл 3 для подставки для коврика (рис. 3C), который может удерживать пенопласт из этилен-винилацетата или толстый хлопчатобумажный коврик, по которому можно постучать стеклянными флаконами или бутылками, когда вы опрокидываете мух в новые контейнеры со свежеприготовленной едой.
3. Загрузите Дополнительный файл 4 и Дополнительный файл 5 для модели подставки для камеры, которую мы назвали Сталкер (Рисунок 3D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство позволяет разместить любую камеру (профессиональную, веб-камеры, мобильные телефоны и т.д.) на вершине основания, где можно сфотографировать или записать на видео чашку Петри, содержащую личинок или взрослых мух. Stalker позволяет визуализировать поведение животных, которое происходит горизонтально, всегда на одном и том же расстоянии от чашки Петри, что позволяет избежать внесения вариативности в экспериментальные измерения, например, если записи должны быть сделаны в разные дни, или если камеру необходимо использовать для другой цели в промежутках между записями. Аппарат имеет удобную модульную конструкцию и может быть легко собран после печати основания и верхней части из Supplemental File 4, а боковых сторон из Supplemental File 5. Квадраты размером 1 см² квадрата у основания, которые можно выделить с помощью перманентного маркера, помогают отслеживать расстояние, пройденное отдельными животными. Напечатайте устройство (по крайней мере, основание) с помощью белой нити, чтобы контраст между фоном и животными был достаточным для того, чтобы программное обеспечение для слежения могло идентифицировать каждую муху.
4. Загрузите Дополнительный файл 6 для печатного дизайна мотеля «Флай» (Рисунок 3E), в котором есть десять арен (комнат) для ухаживания и спаривания, организованных таким образом, чтобы облегчить видеозапись десяти отдельных брачных пар одновременно. Отметим, что в основе мотеля «Флай» лежит устройство, опубликованное в^40-м году, где найдено подробное объяснение его использования в поведенческих исследованиях. Помимо напечатанных на 3D-принтере деталей, для аппарата требуется 12 винтов (3 х 8 мм) для крепления верхней части к нижней для стабилизации собранного устройства, акриловая пластина (60 х 60 х 3 мм) и застежка-молния. Поскольку конструкция мотеля Fly более сложная, мы также предоставляем обучающее видео (Дополнительный файл 7) о том, как правильно его собрать, учитывая, что все необходимые детали и отвертка доступны.
5. Загрузите дополнительный файл 8 для модели Т-образного лабиринта (рисунок 3F), который используется для анализа памяти у взрослых мух. Подробное объяснение того, как Т-лабиринт используется для того, чтобы заставить мух ассоциировать отталкивающие запаховые стимулы с их фототропным поведением, можно найти в оригинальной публикации⁴¹. В аппарате также используются две полупрозрачные конические трубки объемом 15 мл, которые обычно встречаются в любой лаборатории и прикреплены к круглым отверстиям шириной 2 см с каждой стороны центрального элемента. Обратите внимание, что для печати T-Maze требуется опора (подробнее см. в легенде к рисунку 2). Выберите «Везде» в поле «Тип поддержки» (красный квадрат 4 на рисунке 2E) после выполнения шагов 2.1-2.6 выше.
6. Загрузите Дополнительный файл 9 и Дополнительный файл 10 для разработки печатных частей нашей версии аппарата для быстрых итеративных отрицательных геотаксисов (RING) (Рисунок 3G), используемого для проведения лазающих анализов у взрослых мух с несколькими генотипами или условиями окружающей среды одновременно, что позволяет получить результаты более стандартизированным и высокопроизводительным способом⁴². Аппарат RING также является модульным, и в дополнение к деталям, напечатанным на 3D-принтере, для него требуются другие детали, которые можно легко приобрести в Интернете или в хозяйственном магазине по низкой цене: два ректифицированных вала Φ8 x 300 мм, четыре линейных подшипника Φ8 мм, резиновые ленты (или куски струны), кусок дерева 240 x 60 x 20 мм для основания, и восемь шурупов по дереву (8 мм) для крепления напечатанных деталей к деревянной основе. Загрузите Дополнительный файл 11 для получения инструкций по сборке устройства после того, как все детали будут напечатаны или куплены. Подробное объяснение того, как пользоваться аппаратом RING, можно найти в оригинальной публикации⁴².

4. Анализ подвижности личинок

Примечание: Мы оптимизировали этот протокол, первоначально основанный на Nichols et ^al.42, для изучения влияния экспрессии AOX на развитие дрозофил в условиях холодового стресса. Линии 3xtubAOX²⁵ и w¹¹¹⁸, используемые в качестве примеров личинок, экспрессирующих и контролирующих AOX, соответственно, культивировали на стандартной диете²⁴ при 12 °C, согласно Saari et al.34. Мы рекомендуем использовать этот протокол для анализа подвижности образцов личинок любого генетического состояния, культивируемых в любых условиях окружающей среды, представляющих интерес.

1. Приготовьте 2% агаровые пластины, сварив эквивалентное количество агара в деионизированной воде, вылив в чашки Петри Φ90 X 15 мм, и дайте им застыть при комнатной температуре. Для тарелок с конечным объемом 20 мл каждая используйте 0,4 г агара.
2. Осторожно соберите блуждающих личинок L3 с боков флаконов/колб с культурой с помощью пары щипцов с круглым наконечником или щетки и поместите особей в чашку Петри размером Φ90 x 15 мм с деионизированной водой менее чем на 10 секунд, чтобы промыть частицы пищи, прикрепленные к их телу.
3. Переложите отдельных личинок в посуду с агарозой и подождите 5 минут, пока животные акклиматизируются.
4. Расположите чашки с отдельной личинкой на миллиметровой бумаге (0,2 см² сетки) и подсчитайте количество линий, пересеченных животным в течение 1 минуты, когда оно перемещается по агару. Каждая перечеркнутая линия представляет собой расстояние в 2 мм. Повторите процедуру с одной и той же особью 10-15 раз, чтобы получить технические реплики.
5. Повторите шаг 4.4 по меньшей мере с 8-10 особями из разных пробирок/колб, культивируемыми в разное время, чтобы получить биологические реплики одной и той же линии.
6. Повторите шаги 4.4 и 4.5, чтобы получить данные для другой нахлыстовой лески (или для такого количества лесок, которое предполагается анализировать).
7. Те же отдельные личинки, использованные на шагах 4.4-4.6, могут быть использованы для получения дополнительных данных о движении тела путем помещения агаровых чашек с отдельной личинкой под стереомикроскоп и подсчета числа перистальтических сокращений стенки тела в течение 1 минуты. Получите технические и биологические реплики для оценки средней подвижности среди анализируемых нахлыстовых линий.
8. Примените статистический тест для вычисления вероятности того, что значения этих параметров подвижности личинок будут различимы среди интересующих линий. Поскольку здесь мы сравниваем данные только из двух линий, можно применить t-критерий Стьюдента.

5. Митохондриальная респирометрия с использованием личиночных гомогенатов

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был оптимизирован для измерения потребления митохондриального кислорода личиночными гомогенатами линии экспрессии AOX 3xtubAOX и контрольной линии w¹¹¹⁸, культивируемой при 12°C, но мы также рекомендуем использовать его для образцов личинок с любыми генетическими условиями и условиями окружающей среды. Мы понимаем, что проведение таких экспериментов не должно быть включено в число «доступных» целей для «самодельной» флайлаб, в отличие от всех других протоколов, которые мы приводим в этой статье, поскольку для приобретения лабораторией оксиграфа с высоким разрешением должны быть сделаны значительные первоначальные инвестиции. Протокол предназначен для использования с Oxygraph-2k (O2k) и программным обеспечением DatLab от Oroboros Instruments, поэтому требуется дальнейшая оптимизация, если считыватель хочет использовать альтернативное оборудование.

1. Включите O2k и запустите программу DatLab на компьютере, подключенном к оксиграфу. Магнитные стержни внутри пробирных камер должны начать автоматически перемешиваться. Удалите раствор для хранения этанола из камер.
2. Промойте камеры не менее 3 раз 100% этанолом и 3 раза сверхчистой водой.
3. В DatLab окно O2k Control откроется автоматически. В поле Температура блока [°C] введите 12 °C (или предпочтительную температуру в диапазоне от 2 до 47 °C) и нажмите OK.
4. Второе окно, «Редактировать эксперимент», откроется автоматически. Введите названия образцов в поля Образцы , в соответствии с тем, что будет добавлено в камеры А и В, и нажмите Сохранить.
5. Добавьте 1800 мкл буфера для анализа (120 мМ KCl, 5 мМ KH₂PO₄, 3 мМ Hepes, 1 мМ EGTA, 1 мМ MgCl₂, 2% BSA, pH 7,4) в каждую камеру и частично закройте их, продолжая обеспечивать обмен кислорода с наружным воздухом. Дайте концентрации кислорода и сигналам потока кислорода стабилизироваться, показывая минимальные колебания в течение не менее 10 минут. На этом этапе будет проведена калибровка оборудования с использованием наружного воздуха в день проведения эксперимента (более подробную информацию об экспериментальной калибровке см. в шагах 6.3 и 6.4 ниже).
6. На этапе калибровки воздуха начните подготовку образца, осторожно собрав из пробирок с культурой 20 блуждающих личинок соответствующего генотипа с помощью щипцов или небольшой кисти.
7. Быстро, но тщательно промойте каждую личинку деионизированной водой или 1x PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na₂HPO₄ и 2 мМ KH₂PO₄) и перенесите их в стеклянный гомогенизатор объемом 1 мл на льду, содержащий 500 мкл ледяного изоляционного буфера (250 мМ сахарозы, 5 мМ Tris HCl, 2 мМ EGTA, pH 7,4)
8. Гомогенизируйте всех личинок за 5 ходов и вылейте гомогенат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл на льду.
9. Добавьте в стеклянный гомогенизатор 300 мкл изоляционного буфера, дополнительно мацерируйте оставшиеся личиночные ткани за 3 хода и снова вылейте гомогенат в ту же микроцентрифужную пробирку на льду.
10. Добавьте в стеклянный гомогенизатор 200 мкл изоляционного буфера, дополнительно мацерируйте остаточные личиночные ткани за 2 удара и снова вылейте гомогенат в ту же микроцентрифужную пробирку на лед.
11. Смешайте окончательный гомогенат (~1 мл), дважды осторожно перевернув пробирку, и держите ее на льду до обработки второго образца.
12. Повторите шаги 5.6-5.11 для получения гомогената личинок другого генотипа.
13. Откройте камеры оксиграфа А и В и переведите по 200 мкл каждого гомогената в буфер для анализа в каждой камере, температура которого в этот момент должна быть точно при 12 °C. Полностью закройте камеры и дайте стабилизировать концентрацию кислорода и сигналы потока кислорода в течение примерно 10 минут.
14. Начните измерения потребления кислорода, добавив в каждую камеру по 5 мкл раствора 2 М пирувата, 2 М пролина (конечная концентрация в камерах = 5 мМ в каждой) и 7,5 мкл раствора 0,4 М малата (1,5 мМ). Подождите не менее 5 минут для стабилизации сигнала. Обратите внимание, что на этом этапе митохондрии будут заряжены окисляемыми субстратами, чтобы инициировать реакции цикла трикарбоновых кислот (ТСА). Любое увеличение сигнала потребления кислорода может быть связано с функциями разобщающих белков (или с другими явлениями разъединения) и может быть использовано для расчета общего несвязанного дыхания (также называемого дыханием утечки в отсутствие аденилатов, L_N- см. Репрезентативные результаты для получения подробной информации).
15. Добавьте в каждую камеру по 4 мкл раствора 0,5 М АДФ (1 мМ) и дайте не менее 5 минут на стабилизацию сигнала. Обычно сразу же наблюдается значительное увеличение сигнала потребления кислорода, представляющее собой окислительно-фосфорилированное (OXPHOS) дыхание. Подавляющее большинство этого дыхания OXPHOS обусловлено комплексом I (ДИ).
16. Добавьте в каждую камеру по 2 мкл раствора 0,05 М антимицина А (0,05 мМ) для ингибирования CIII и дайте не менее 5 минут для стабилизации сигнала. Для контрольного образца w¹¹¹⁸ следует наблюдать снижение сигнала потребления кислорода до базальных уровней, наблюдавшихся до добавления пирувата, пролина и малата. Митохондриальное дыхание личинок, экспрессирующих AOX, будет частично устойчивым к антимицину-А, поскольку электроны теперь могут быть направлены в AOX. Около 40% от общего объема дыхания OXPHOS должно оставаться после ингибирования CIIII, которое должно поддерживаться исключительно AOX.
17. Добавьте в каждую камеру по 4 мкл раствора 0,1 М пропилгаллата (0,2 мМ) для ингибирования AOX и дайте не менее 15 минут для стабилизации сигнала. Уровни потребления кислорода в образцах личинок, экспрессирующих AOX, теперь должны снизиться до базальных уровней, наблюдавшихся до добавления пирувата, пролина и малата. Это снижение доказывает, что наблюдаемое дыхание, устойчивое к антимицину-А, обусловлено функцией AOX.
18. Добавьте в каждую камеру 1 мкл 0,01 М ротенона (0,005 мМ) для ингибирования ДИ и дайте не менее 5 минут на стабилизацию сигнала, чтобы получить сигнал потребления кислорода образцом независимо от митохондриального дыхания. Этот сигнал обычно такой же низкий, как и тот, который наблюдался до добавления пирувата, пролина и малата.
19. Сохраните эксперимент и закройте программу DatLab.

6. Обработка данных митохондриальной респирометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Значения потребления кислорода получены как среднее значение сигналов потока кислорода за определенный период времени и выражаются в расходе pmol O₂ в секунду на мг общего белка в образце. Эти значения сначала сравнивают с максимальной концентрацией кислорода, доступной в буфере для анализа в день эксперимента, на основе экспериментальной температуры (называемой насыщением воздуха), и минимальной концентрацией кислорода, которая определяется предварительно в каждой камере добавлением Na₂S₂O₄ в буфер для анализа (см. ⁴³ в соответствии с рекомендациями производителя по получению калибровки без кислорода). Значения также нормируются количеством общего белка в личиночных гомогенатах, добавляемых в буфер для анализа каждой камеры.

1. Определите общую концентрацию белка в каждом образце с помощью метода Брэдфорда⁴⁴. Повторно откройте сохраненный эксперимент в программном обеспечении DatLab, нажмите «Эксперимент» в верхнем меню, а затем «Редактировать». В открывшемся окне в разделе Unit (Единица) выберите mg (Unit) и в разделе Amount (Количество) введите количество белка, содержащегося в 200 μL образца, добавленного в каждую камеру. Концентрация будет автоматически рассчитана программным обеспечением с учетом общего объема камеры в 2 мл. Нажмите кнопку «Сохранить».
2. Нажмите кнопку График в верхнем меню, а затем выберите графики. В открывшемся окне выберите Flux per mass для обоих графиков (1 и 2, которые относятся к камерам A и B соответственно). Нажмите OK. В настоящее время результат эксперимента нормализуется по концентрации белка в образцах (пмоль O₂/с/мг общего белка).
3. В правом верхнем углу каждого графика (1 и 2) главной страницы результатов эксперимента нажмите на O₂ Concentration. По оси x определите временной диапазон перед добавлением образцов в камеры, в котором концентрация кислорода и сигналы потока очень стабильны.
   1. Нажмите и удерживайте клавишу Shift на клавиатуре компьютера, щелкните левой кнопкой мыши по первоначально выбранному времени, перетащите курсор вдоль оси времени, чтобы выбрать нужную область, и отпустите кнопку мыши. Проделайте эту процедуру для каждого из графиков по отдельности.
   2. Дважды щелкните по синим столбцам выбранных областей в нижней части графиков и введите «воздух», чтобы указать, что это выбранные области, используемые для расчета насыщения воздуха кислородом.
4. Нажмите « Калибровка » в верхней строке меню и выберите A: Oxygen, O₂ для калибровки камеры A. В открывшемся окне убедитесь, что выбран O₂ Calib (желтый цвет).
   1. Для калибровки нуля нажмите на кнопку Копировать из файла и выберите файл с ранее выполненной калибровкой нулевого уровня кислорода (рекомендации производителя см. ^{в пункте 43}).
   2. В поле Калибровка воздуха выберите воздух в столбце Выбрать метку . Нажмите « Калибровать» и скопируйте в буфер обмена.
5. Нажмите « Калибровка » в верхней строке меню, выберите B: Oxygen, O₂ и повторите шаг 6.4 для калибровки камеры B.
6. В правом верхнем углу каждого графика (1 и 2) главной страницы результатов эксперимента нажмите на O₂ flux per mass. Выберите нужные стабильные области сигнала потребления кислорода, удерживая клавишу Shift на клавиатуре, щелкая левой кнопкой мыши и перетаскивая курсор по оси времени. Стабильные области, выбранные между добавлениями пирувата/пролина/малата и АДФ, представляют собой L_N; между АДФ и антимицином А, OXPHOS; между антимицином А и пропилгаллатом (при ингибировании CIIII), антимицин А-резистентное дыхание; между пропилгаллатом и ротеноном (при ингибировании CIII+AOX), остаточное дыхание; после ротенона (при ингибировании CI+CIII+AOX) – остаточное немитохондриальное дыхание. Дважды кликните по красным столбцам выделенных областей в нижней части графиков, и введите соответствующие метки.
7. Нажмите « Метки » в верхней строке меню, а затем «Статистика». Во вкладке Показать открывшегося окна снимите флажки со всех параметров, кроме O₂ flux per mass. На вкладке « Выбрать » того же окна выберите камеру А, чтобы получить данные дыхания для первого образца. Нажмите « Копировать в буфер обмена » и вставьте данные в таблицу. Повторите процедуру для получения данных для второго образца в камере В.
8. В таблице вычтите все показатели дыхания на остаточное немитохондриальное дыхание (данные после добавления ротенона). Вычисление средних значений из нескольких экспериментальных повторений и построение графиков данных в соответствии с предпочтениями.

Результаты

Следуя шагам, описанным в Протоколах 1 и 2, можно спроектировать простую стойку для флаконов и пропустить STL-файл модели через программу нарезки для создания координат для 3D-принтера. На рисунке 3A показана напечатанная единица измерения модели рядом с е...

Обсуждение

Представленные здесь протоколы 3D-печати и файлы STL предназначены для облегчения создания новой flylab или для увеличения репертуара аппаратов в существующем поведенческом центре дрозофилы с использованием «самодельного» оборудования. Стратегия 3D-печати может бы?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer RapRep			A popular 3D-printer based on the Prusa I3 DIY mode, instructions available in https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/
3xtubAOX fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line expressing the AOX gene from C. intestinalis under the control of the constitutive α-tubulin promoter. 5 and 6 copies of this construct are present in males and females in homo/hemizigosity, respectively, one in each of the chromosomes X, 2 and 3.
Acrylic plate			60 x 60 x 3 mm
ADP	Sigma-Aldrich	A2754	Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 20398-34-9); ≥95%; molecular weight = 427.20 g/mol; solubility in water at 50 mg/ml
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight ~ 548.63 g/mol; solubility in 95% ethanol at 50 mg/mL
Agar	Kasv	K25-611001	For bacteriologal use; powder; solidifying agent (12-20 g/L)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free (CAS number 9048-46-8);pH 7; ≥98%; solubility in water 40g/ml
Deionized water
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 67-42-5); ≥97%; molecular weight = 380.35g/mol
Ethanol 99.5%
Ethylene-vinyl acetate foam			Can be replaced with thick pieces of cotton
Graph paper			0.2 cm2 grid
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9), BioPerformance Certified; ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight =238.30g/mol
Homogenizer	Sartorius		Hand glass homogenizer (S), 1 mL; composed of a cylinder made of borosilicate glass plus plunger S; often used for simple sample preparation, e.g. crushing of tissue samples.
KCl	Amresco	0395-2	Potassium chloride (CAS number 7447-40-7); ≥99,0%; molecular weight = 74.55g/mol
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Potassium phophate monobasic (CAS number 7778-77-0); ReagentPlus; molecular weight = 136.09g/mol
Linear bearings (LM8UU)			8 mm, any brand
Malate	Sigma-Aldrich	M1000	L-(-)-Malic acid (CAS number 97-67-6); ≥95-100%; molecular weight = 134.09 g/mol), solubility in water: 100 mg/mL. A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
MgCl2	Amresco	0288-1KG	Magnesium chloride, hexahydrate (CAS number 7791-18-6); 99%-102%; molecular weight = 203.3g/mol
Microcentrifuge tubes			1.5mL; Graduated every 100µL, autoclavable
Na2HPO4	Amresco	0348-1KG	Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (CAS number 7782-85-6); 98-102%; molecular weight = 268.07 g/mol
NaCl	Honeywell	31434-1KG	Sodium chloride (CAS number 7647-14-5); ≥99,5%; molecular weight 58,44g/mol. For laboratory use only.
Oxigraph-O2k	Oroboros	10000-02	Series D-G; O2k-Core: includes O2k-Main Unit with stainless steel housing, O2k-Assembly Kit, two OroboPOS (polarographic oxygen sensors) and OroboPOS-Service Kit, DatLab software, the ISS-Integrated Suction System and the O2k-Titration Set.
Permanent marker			Preferably black
Petri dishes			90 X 15 mm dishes; commonly used for bacteriological culture
PLA 3D Printing Filament	Quantum3D Printing	http://quantum3dprinting.com/	High quality polylatic acid filament (PLA), strongly recomended, (1.0 kg Roll), any brand
Proline	Sigma-Aldrich	P0380	L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	P3130	Propyl gallate (CAS number 121-79-9); powder; ≥98%; molecular weight = 212.2 0g/mol; solubility in ethanol at 50 mg/ml
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol; solubility in water at 100 mg/mL
Rectified shafts			8 x 300 mm, any brand
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/mol
Rubber bands			Can be replaced with pieces of a string
Screwdriver			To assemble some of the 3D-printed apparatuses
Screews			M3 x 8 mm
SD Card			At least 32Mb in size; usually provided with 3D printers
Software Repetier Host	Hot-World GmbH & Co. KG	https://www.repetier.com/	Excellent slicing software, available free of cost
Software Tinkercad	Autodesk	https://www.tinkercad.com	3D model design software, available free of cost
Stereomicroscope	Leica	M-80	Stereomicroscope, zoom 7.5-60X + Leica cls 150 led light source
Sucrose	Merck	107,651,000	Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1);
Tris	Amersham Biosciences	17-1321-01	Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (CAS number 77-86-1); 99,8-100.1%; molecular weight 121.14 g/mol
Tweezer/forceps	Stark	ST08710	Histological tweezer, straight, round tip, 12 cm, AISI-410 stainless steel
w1118 fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line used as genetic background control for 3XtubAOX
Wood plate			240 x 60 x 20 mm
Zip tights			2 x 210 mm, any brand