Establecimiento de un ecosistema de pulpos para la investigación biomédica y de bioingeniería

Resumen

Comprender las estructuras fisiológicas y anatómicas únicas de los pulpos puede tener un gran impacto en la investigación biomédica. Esta guía demuestra cómo configurar y mantener un entorno marino para acomodar a esta especie e incluye imágenes de vanguardia y enfoques analíticos para visualizar la anatomía y la función del sistema nervioso del pulpo.

Resumen

Muchos desarrollos en la investigación biomédica se han inspirado en el descubrimiento de mecanismos anatómicos y celulares que apoyan funciones específicas en diferentes especies. El pulpo es uno de estos animales excepcionales que ha dado a los científicos nuevos conocimientos en los campos de la neurociencia, la robótica, la medicina regenerativa y las prótesis. La investigación con esta especie de cefalópodos requiere la instalación de instalaciones complejas y cuidados intensivos tanto para el pulpo como para su ecosistema, que es fundamental para el éxito del proyecto. Este sistema requiere múltiples sistemas de filtrado mecánico y biológico para proporcionar un entorno seguro y limpio para el animal. Junto con el sistema de control, se requiere un mantenimiento y limpieza de rutina especializados para mantener efectivamente la instalación en funcionamiento a largo plazo. Se recomienda proporcionar un entorno enriquecido a estos animales inteligentes cambiando el paisaje del tanque, incorporando una variedad de presas e introduciendo tareas desafiantes para que puedan trabajar. Nuestros resultados incluyen resonancia magnética y una imagen de autofluorescencia de todo el cuerpo, así como estudios de comportamiento para comprender mejor su sistema nervioso. Los pulpos poseen una fisiología única que puede afectar a muchas áreas de la investigación biomédica. Proporcionarles un ecosistema sostenible es el primer paso crucial para descubrir sus capacidades distintivas.

Introducción

Los nuevos conceptos en investigación biomédica e ingeniería biomédica a menudo se inspiran en la identificación de estrategias específicas que poseen las especies biológicas para abordar las condiciones y desafíos ambientales y fisiológicos. Por ejemplo, la comprensión de las propiedades de fluorescencia en las luciérnagas ha llevado al desarrollo de nuevos sensores fluorescentes que pueden reportar actividad celular en otros organismos ^modelo1; la identificación de los canales iónicos activados por la luz en las algas ha llevado al desarrollo de neuromodulación celular y temporal específica basada en la luz2,3,4,5; el descubrimiento de proteínas en el bagre de vidrio que navegan de acuerdo con el campo magnético de la Tierra ha llevado al desarrollo de la neuromodulación de base magnética6,7,8,9,10,11; La comprensión del reflejo sifón en Aplysia ha sido fundamental para comprender la base celular del comportamiento12,13,14.

Los investigadores continúan expandiendo la caja de herramientas actual de bioingeniería y filogenética aprovechando las fortalezas únicas y las nuevas perspectivas sobre las funciones fisiológicas que tienen las especies de laboratorio no convencionales. Las agencias federales están comenzando a apoyar estas líneas de estudio mediante la financiación de nuevos trabajos realizados en diversas especies.

Un género de animales con capacidades únicas de anatomía y regeneración, así como el control adaptativo de cada uno de sus brazos, biólogos e ingenieros fascinantes y audiencias cautivadoras de todas las partes de la sociedad es el ^Octopus17. De hecho, muchos aspectos de la fisiología y el comportamiento del pulpo se han estudiado en las últimas décadas15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Sin embargo, los desarrollos recientes en biología molecular y evolutiva, robótica, registro de movimiento, imágenes, aprendizaje automático y electrofisiología aceleran los descubrimientos relacionados con la fisiología y el comportamiento del pulpo y los traducen en estrategias innovadoras de bioingeniería27,28,29,30,31,32,33,34,35 ^,36,37,38,39.

Aquí describimos cómo establecer y mantener la cría de pulpos, que sería de interés y relevancia para científicos e ingenieros de diferentes orígenes, intereses científicos y objetivos. Sin embargo, nuestros resultados se centran en la aplicación de pulpos en la investigación en neurociencia y neuroingeniería. El pulpo tiene un sistema nervioso altamente desarrollado con 45 millones de neuronas en el cerebro central, 180 millones de neuronas en los lóbulos ópticos y 350 millones de neuronas adicionales en los ocho cordones axiales y ganglios periféricos; en comparación, un perro tiene un número similar de neuronas y un gato solo la mitad de ^ellas40. A diferencia del sistema nervioso de los vertebrados, solo hay fibras eferentes de 32K y 140K aferentes que conectan los millones de neuronas en el cerebro del pulpo con los millones de neuronas en cada uno de los cordones axiales de su brazo40,41,42. Estas relativamente pocas fibras de interconexión sugieren que la mayoría de los detalles para la ejecución de los programas motores se realizan en el propio cordón axial, enfatizando el control neuronal distribuido de forma única que poseen los pulpos. Los brazos del pulpo tienen un extraordinario control motor fino que les permite habilidades de manipulación, como abrir tapas de frascos, incluso cuando están dentro del contenedor. Esta capacidad motora prensil altamente desarrollada es exclusiva de la clase de cefalópodos (pulpo, sepia y calamar)⁴³.

De hecho, a través de cientos de millones de años de evolución, el pulpo ha desarrollado un genoma y un sistema fisiológico notables y ^{sofisticados43,44} que han inspirado nuevos desarrollos y avances en los campos científicos y de ingeniería. Por ejemplo, un parche adhesivo resistente al agua basado en la estructura anatómica de las ventosas del pulpo puede adherirse a superficies húmedas y ^secas45; un material de camuflaje sintético inspirado en la piel de camuflaje del pulpo puede transformar una superficie plana en 2D en una tridimensional con protuberancias y ^hoyos46. Robots blandos y autónomos en miniatura (es decir, Octobots) que en el futuro podrían servir como herramientas quirúrgicas dentro del ^cuerpo47; y también se ha desarrollado un brazo (es decir, OctoArm) unido a un robot similar a un ^tanque48. Muchas especies de pulpos se utilizan en la investigación biomédica, por ejemplo, Octopus vulgaris, Octopus sinensis, Octopus variabilis y Octopus bimaculoides (O. bimaculoides); siendo el O. vulgaris y el O. bimaculoides los más comunes34,49,50. La reciente secuenciación de diferentes genomas de pulpo hace que este género sea de particular interés y abre nuevas fronteras en la investigación del pulpo34,43,51,52.

O. bimaculoides utilizado en nuestra configuración es una especie de pulpo de tamaño mediano, descubierta por primera vez en 1949, que se puede encontrar en aguas poco profundas de la costa noreste del Pacífico desde el centro de California hasta el sur de la península de Baja ^California17. Se puede reconocer por las falsas manchas oculares en su manto debajo de sus ojos. En comparación con el pulpo gigante del Pacífico (Enteroctopus dofleini) y el pulpo común (O. vulgaris), el pulpo de dos puntos de California (O. bimaculoides) es relativamente pequeño en tamaño, comenzando más pequeño que unos pocos centímetros, creciendo rápidamente como juvenil. Cuando se cría dentro de un laboratorio, el tamaño del manto adulto puede crecer hasta un tamaño promedio de 100 cm y pesar hasta 800 ^g53,54. Los pulpos tienen un período de crecimiento rápido dentro de sus primeros 200 días; para entonces, son considerados adultos y continúan creciendo durante el resto de su vida55,56,57. Los pulpos pueden ser caníbales, especialmente cuando ambos sexos están alojados juntos dentro de un tanque; por lo tanto, deben alojarse individualmente en tanques ^separados58.

Protocolo

Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan.

1. Configuración del equipo del tanque Octopus

1. Primero, obtenga todos los materiales no biológicos para un acuario que se incorporarán al sistema ambiental marino, como se muestra en la Tabla de Materiales. Los tamaños se proporcionan en pulgadas.
2. Lave todas las piezas de tubos, tuberías y sistemas de filtro con etanol al 70% y agua desionizada (DI) antes de la instalación. No use jabón ni ningún otro producto químico al limpiar.
3. Coloque una mesa de fibra de vidrio de 13 pulgadas x 49 pulgadas x 1/2 pulgada (Parte # 71) con cuatro patas de mesa hechas de fibra de carbono y con las dimensiones de 2 pulgadas x 2 pulgadas x 23 pulgadas (Parte # 72). Coloque las patas directamente debajo de las esquinas de la mesa.
4. Debajo de la superficie superior, entre cada una de las patas de la mesa, coloque tirantes de estabilización de fibra de carbono de 2 pulgadas x 2 pulgadas de largo (Parte # 72) unidos a la parte inferior de la mesa y directamente contra el borde del estante superior. Coloque con tornillos otro estante con las mismas dimensiones directamente en el suelo debajo de la mesa. Deje que la bomba (consulte la Tabla de materiales) se asiente directamente sobre la superficie inferior del estante mientras el tanque se asienta sobre la superficie superior. Este sistema se muestra en la Figura 1.
   NOTA: La salida de agua del tanque se alimenta por gravedad y todos los tubos, excepto los que entran y salen del tanque, deben ser más bajos que el fondo del tanque para garantizar la máxima presión del cabezal de drenaje.

Figura 1: Configuración del tanque Octopus. Entrada y salida de agua (a). Tres tanques de pulpo cada uno con un área de 1,22 m x 0,3 m (b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Perfore un solo orificio de 13/4 pulgadas, a 2 pulgadas de uno de los lados del tanque, utilizando brocas de corte de vidrio. La parte inferior de la pantalla de succión de salida de agua determinará la elevación del orificio de salida como se muestra en el lado derecho de la Figura 2a. El nivel del agua estará determinado por la pantalla de succión y deberá estar al menos a 6 pulgadas de la parte superior del tanque, lo que permite una zona de salpicaduras de agua.
6. Utilice una imprimación de PVC y cemento para conectar permanentemente las secciones. Para hacerlo, primero, deslice el extremo de la tubería de PVC macho prevista en el extremo de la tubería hembra. Coloque una pieza de cinta de pintor en el exterior de la parte masculina que aún sea visible para evitar que la imprimación y el cemento se muestren en el exterior de la tubería. Separe las piezas después de la cinta adhesiva y coloque una capa ligera de imprimación en el exterior de la tubería macho después de la aplicación del cemento en la misma área.
7. Vuelva a colocar la tubería macho en la tubería hembra, tan pronto como sea posible, después de la aplicación de cemento y retire la cinta. 24 h después de la aplicación de la imprimación y el cemento, lave las piezas recién conectadas con agua DI. Para el tiempo de curado, mire el producto de cemento para obtener más instrucciones.
   NOTA: Asegúrese de que la configuración de todos los tubos y equipos se coloque correctamente antes de usar imprimación de PVC y cemento; los requisitos de longitud de tubería pueden variar.
8. A continuación, conecte permanentemente el extremo de 1 pulgada de diámetro exterior (OD) de la pantalla de succión al extremo de 1 pulgada de diámetro interior (ID) de la articulación del codo. Conecte el extremo de la articulación del codo a un tubo recto de PVC (1 pulgada OD). Conecte el otro lado del tubo recto y luego a la identificación de 1 pulgada de la conexión de enchufe hembra del adaptador recto de pared pasante.
   NOTA: ID se refiere a la distancia más amplia entre las paredes interiores de la tubería. OD se refiere al exterior del ancho del tubo.
9. Conecte permanentemente el adaptador recto de pared pasante a una tubería de PVC recta de 4 pulgadas de largo con un OD de 1 pulgada (del paso 1.8). Esta tubería saldrá del tanque.
10. Conecte permanentemente la tubería recta al centro del conector de PVC (1 pulgada en forma de ID Tee; desde el paso 1.9). A continuación, conecte permanentemente dos tuberías de 6 pulgadas de largo (Parte # 69) (1 pulgada OD) a ambos extremos opuestos del conector de salida: uno mirando directamente hacia arriba para la liberación de aire y el otro directamente hacia abajo para el flujo de agua.
11. Conecte permanentemente la tubería recta extendida hacia abajo (desde el paso 1.10) a un adaptador recto de púas de zócalo hembra (ID de 1 pulgada). Conecte un tubo de goma de 36 pulgadas de largo (ID de 3/4 de pulgada) al adaptador de tubería de púas.
12. Coloque el sistema de refrigeración entre el tubo de salida de agua y el sistema de sumidero.
13. Conecte los accesorios de púas de 3/4 de pulgada, que vienen con el sistema, a los puertos de entrada y salida de la unidad enfriadora. Coloque el tubo de goma (a partir del paso 1.11) en el accesorio de entrada del enfriador.
14. Conecte una nueva pieza de tubo ID de 3/4 de pulgada (del paso 1.13) desde la salida del enfriador (desde el paso 1.12) a la entrada del sistema de sumidero como se muestra en la Figura 2b.
15. A continuación, coloque el filtro de calcetín de 4 pulgadas x 12 pulgadas, con un tamaño de poro de 200 μm, en su área designada como se muestra en la Figura 2. Además, como se muestra en la Figura 2, coloque el skimmer de proteínas y la bomba de retorno en sus áreas apropiadas. Junto con la bomba de retorno, conecte la válvula de flotador superior automática a la pared interior del área de la bomba, 2 pulgadas por encima de la parte superior de la entrada de agua de la bomba; no bloquee la extracción de la bomba del tanque, si es necesario.
16. Conecte permanentemente un tubo recto de 12 pulgadas de largo (3/4 de pulgada OD) a la salida de la bomba (desde el paso 1.15). En el otro extremo del tubo recto OD de 3/4 de pulgada, conecte permanentemente el OD del tubo a una articulación de codo ID 45° de 3/4 de pulgada. Al otro extremo de la articulación, conecte permanentemente un tubo OD de 3/4 de pulgada.
17. Conecte el otro extremo del tubo recto (desde el paso 1.16) al ID de 3/4 de pulgada de un adaptador reductor recto. Conecte permanentemente el extremo del adaptador más grande (OD de 2 pulgadas) a la entrada de la luz UV.
    NOTA: Las longitudes de los tubos rectos pueden variar.
18. A continuación, haga coincidir la colocación de la entrada de luz UV con la tubería de salida de la bomba (a partir del paso 1.17) para que la tubería no se doble entre la luz y la bomba (desde el paso 1.15). Perfore agujeros en la abrazadera de estabilización para que coincida con los orificios de fijación de luz UV. Haga coincidir el tamaño de los tornillos con la broca y conecte la luz UV a la mesa utilizando los tornillos indicados.
19. Conecte permanentemente el lado de 2 pulgadas de otro adaptador reductor a la salida de la luz UV (a partir del paso 1.18). Conecte un OD de 1 pulgada de un tubo recto de 5 pulgadas de largo a la identificación de 1 pulgada del adaptador. A continuación, conecte una pieza de esquina de 90 ° con el ID de 1 pulgada al tubo OD de 1 pulgada; tener el extremo no conectado de la pieza de la esquina apuntando hacia el lado del tanque donde se pretende que vaya la entrada de agua (mismo lado que en el paso 1.5).
20. Conecte permanentemente el otro extremo de la esquina (desde el paso 1.19) a un tubo de 6 pulgadas de largo (Parte # 69) que tenga OD de 1 pulgada con la entrada de la unidad de control de flujo (Parte # 2). Conecte permanentemente otro tubo OD de 1 pulgada (Parte # 69) a la salida de la unidad de monitoreo de flujo; la longitud debe extenderse al menos 3 pulgadas más allá del costado del tanque.
21. Usando una broca de corte de vidrio de 13/4 de pulgada (Parte # 1), corte un nuevo orificio a 3 pulgadas por encima de la línea de flotación prevista y a 2 pulgadas del lado del tanque (Figura 1a) en el lado opuesto al que tiene un orificio de salida de agua. Coloque otro mamparo de pared pasante con un deslizamiento de 1 pulgada (Parte # 77) mirando hacia afuera del tanque.
22. Al deslizamiento del mamparo conecte un tubo recto con el OD de 1 pulgada y 4 pulgadas de longitud (Parte # 69) de forma permanente. Corte el tubo de la última parte del paso 1.21 para que coincida con la distancia que este tubo se extiende desde el tanque. Conecte permanentemente un tubo de 90 ° (Parte # 65) a cada uno de los tubos abiertos y corte un tubo recto OD final de 1 pulgada (Parte # 69) que conecte permanentemente ambas piezas de esquina.
    NOTA: La Figura 3 muestra una representación simple del sistema de acuarios.
23. Configure el resto del sistema de control (Parte # 34), primero monte la regleta de alimentación (Parte # 53) en la mesa o en una pared cercana. Junto a él, monte el módulo de monitoreo de fluidos (Parte # 2).
24. Conecte el sensor de flujo, la regleta de alimentación y los sensores de detección de fugas al módulo. Configure la luz de crecimiento (parte # 26) que está conectada al contenedor de algas (Figura 2).
25. Conecte el sensor de flujo, la luz UV, la luz de crecimiento, la bomba y el skimmer de proteínas a la barra de energía. Configure la programación del sistema de control de agua de acuerdo con el manual del fabricante.
26. Prepare agua salada mezclando media taza de mezcla de sal disponible comercialmente con 1 galón de agua de ósmosis inversa (RO) o desionizada (DI). Haga 45 galones para llenar completamente un tanque y un sistema de sumidero.
27. Encienda la bomba dentro del controlador de flujo del sistema de sumidero y siga agregando agua salada hasta que la válvula de salida superior automática esté en la posición de apagado, por lo que no se requiere agua dulce adicional.
28. Una vez que el agua esté llena, deje de llenar y encienda la unidad de enfriamiento de agua para establecer la temperatura entre 18 ° C y 22 ° C, ya que este es el rango de temperatura ^preferible53. Encienda el skimmer de proteínas.
29. Agregue 30 kg de coral triturado al fondo del tanque, así como una capa de coral triturado al fondo del contenedor de algas. Agregue múltiples rocas vivas y cualquier otra adición al entorno del pulpo. Coloque una parte superior para cubrir la abertura del tanque.
    NOTA: Las rocas vivas son corales muertos que están habitados por vida marina macroscópica como bacterias y algas.
30. Agregue las bacterias nitrificantes utilizadas en los acuarios de agua salada como se indica en el empaque. Siga agregando esto según las indicaciones, verificando la temperatura, la salinidad, el pH, el amoníaco, el nitrito y el nitrato diariamente con kits de prueba de agua, sensor de pH y sensor de temperatura. Los valores seguros para los niveles de amoníaco, nitrito y nitrato están por debajo de 0,5 ppm, 0,25 ppm y 10 ppm ^{respectivamente58}.
31. Asegúrese de que la luz UV se apague durante los días en que se agregan bacterias nitrificantes para permitir que crezcan los microorganismos del agua salada. Después de que los parámetros están dentro de los rangos seguros, la luz UV se puede reactivar.
32. Después de establecer el sistema, también verifique que el pH y la oxigenación estén en 8.0-8.4 y ⁵⁹, respectivamente. Antes de agregar cualquier animal al acuario, verifique la presencia de niveles de cobre y oxígeno dentro del sistema utilizando un kit de prueba de agua de cobre.
    NOTA: El cobre causa daños a los invertebrados e interfiere con la osmorregulación en las branquias de los ^peces60,61.
33. Si se encuentra cobre en el agua, pruebe la fuente de agua DI/RO. Después de determinar que la fuente de agua no contiene cobre, realice un cambio de agua del 30% y coloque el bloque de carbón activado (Parte # 46) dentro del agua. Si el problema persiste, realice un cambio completo de agua y limpie todas las partes.
34. Después de que se determine que todos los parámetros del agua están dentro de los niveles seguros, agregue 10 camarones fantasmas al sistema al menos una semana antes de agregar los pulpos. Esto ayudará a introducir biomasa para bacterias e indicará la calidad general del agua.
35. Agregue habitantes adicionales del ecosistema del acuario al contenedor de algas. Esto incluye Chaetomorpha spp. (algas espagueti), Trochus Sp. (caracol trochus con bandas), y Mercenaria mercenaria (almejas de piedra de cerezo).

Figura 2: Sistema de sumidero. Vista lateral del sistema de sumidero (a). Vista superior del sistema de sumidero (b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Acuario con sistema de filtrado de sumidero debajo del tanque y unidades de control ambiental. Las flechas verdes indican la dirección del flujo de agua a través del sistema. Agua que fluye de la sección uno a dos para enfriamiento y a la tercera para separar la materia biológica pesada de la materia más ligera. Los desechos pesados flotan hacia el fondo y hacia la sección cinco, mientras que la materia biológica más pequeña fluye hacia el filtro de calcetines dentro de la sección cuatro. El agua fluye de cuatro debajo de la sección cinco que ingresa al desnatador de proteínas en seis para eliminar los desechos restantes dentro del agua. El contenedor de algas contiene microorganismos para descomponer los desechos, el amoníaco y los nitratos, así como para oxigenar el agua. En la última parte del sistema, se agrega más agua para tener en cuenta la evaporación antes de ser bombeada de nuevo al tanque. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Tanques de almacenamiento

1. Instale dos tanques altos de almacenamiento de agua de 60 galones, uno para el agua salada y el otro para el agua rova. Asegúrese de que la línea de llenado máximo del tanque de agua dulce sea más alta que la mesa. Conecte un tubo de 1/4 de pulgada a la parte superior automática de la válvula de flotador en el sistema de sumidero y conecte el otro extremo del tubo al fondo del tanque de agua dulce.
   NOTA: Esto es para rellenar si el agua se evapora. La sal permanecerá en el agua.
2. Llene el tanque de agua salada con agua y agregue la cantidad proporcional de sal al tanque. Airear continuamente el tanque de almacenamiento de agua salada para la mezcla y la oxigenación adecuada. Espere una hora antes de usar para asegurar la mezcla completa de la sal.
   NOTA: El tanque de agua salada es útil para rellenar los tanques después de la limpieza.

3. Configuración del tanque de alimentos

1. Para mantener vivos los camarones durante más de una semana, guárdelos en un tanque separado del pulpo con la salinidad por debajo de 30 ppt y la temperatura cercana a 25 ° C.
2. Para hacerlo, una semana después de que los tanques de pulpo hayan madurado, transfiera 8 galones de agua salada madurada al tanque de camarones. Agregue 15 kg de coral triturado al fondo del tanque. Agregue algunas rocas vivas al tanque para ocultar lugares para mudar (Figura 4).
   NOTA: El agua de mar madurada se refiere al proceso de permitir que las bacterias marinas crezcan dentro del agua salada como se muestra en el paso 1.30.
3. Conecte un filtro de bote al borde del tanque. Configure el filtro de cannister según las indicaciones del fabricante. Agregue una bomba de aire al lado del tanque conectada a un tubo con una piedra de aire adjunta colocada en el tanque.
4. Limpie el filtro y cambie las almohadillas del filtro cada semana. Además, el 25% del agua deberá cambiarse al mismo tiempo. Verifique diariamente los parámetros de nitrógeno, pH y temperatura en los tanques de alimentos con kits de prueba de agua como se describe en el paso 1.30. Si los parámetros de nitrógeno del agua siguen siendo altos, realice cambios adicionales de agua y agregue una bolsa absorbente de nitrógeno al agua; o si los problemas persisten más de un mes, los camarones deberán trasladarse a un tanque más grande.
5. Agregue los camarones tan pronto como se disipe el sedimento de coral triturado. Para agregar camarones primero, a su llegada, mueva los camarones sin enviar agua al pequeño tanque de agua salada durante 5 minutos para eliminar los biorresiduos. Luego, los camarones se pueden agregar directamente al tanque. Los peces mosquito, a su llegada, se pueden agregar directamente al tanque de camarones.
   NOTA: Los camarones y los mosquitos se pueden comprar a cualquier proveedor comercial de animales vivos que figure en la hoja de materiales u otros proveedores de alimentos. También es posible ofrecer pulpos de camarones descongelados.
6. Alimente a los camarones y peces con escamas de pescado, vegetación muerta o ^algas62, según las instrucciones de los alimentos.
7. Para el tanque de cangrejo, agregue 1 galón de agua salada y 10 kg de guijarros. Apilar los guijarros en un lado dejando tierra firme en un lado y 2 cm de agua salada en el otro lado (como se señala en la Figura 4). Los parámetros óptimos del agua ambiental para estos invertebrados deben ser 30-35 ppt y 22-25 °C para la salinidad y la ^{temperatura11,63}, respectivamente.
8. Agregue cangrejos violinistas directamente al tanque (Figura 4). Los cangrejos pasarán la mayor parte de sus vidas en tierra, pero pueden estar bajo el agua durante unos días a la vez, lo que hace que el tanque que está parcialmente bajo el agua sea crucial para su supervivencia a largo plazo.
9. Alimente a los cangrejos violinistas una vez al día agregando copos de pescado al plato en el área seca del tanque. Limpie semanalmente eliminando los cangrejos y cambiando el 100% del agua salada. Limpia los guijarros.
10. Almacene los moluscos bivalvos marinos (almejas y mejillones) dentro de los tanques de agua salada para que los pulpos se abran y proporcionen otro mecanismo de filtrado de ^agua64.
11. Coloque los mejillones dentro de un tanque desocupado separado durante la primera semana para evitar colocar una carga de desechos innecesaria en el sistema de filtrado del tanque de pulpo.
    NOTA: Si bien los mejillones han sido el alimento preferido del pulpo, es más probable que mueran poco después de la llegada y aumentarán sustancialmente los desechos biológicos dentro del tanque si están presentes en grandes cantidades.

4. Introducción del pulpo en el tanque

1. Asegúrese de que los niveles de amoníaco, nitrito y nitrato estén por debajo de 0.5 ppm, 0.25 ppm y 10 ppm respectivamente. Tenga una bomba manual de agua disponible para eliminar la tinta de pulpo del tanque. También se recomienda tener dos personas para este procedimiento.
2. A su llegada, coloque la bolsa en la báscula y reste el peso de la bolsa después de retirar el pulpo. Agregue una piedra de aire a la bolsa para aumentar la oxigenación del agua mientras transfiere al animal a su tanque. Mida la temperatura y la salinidad del agua de envío. Registre los casos de enfermedad prolongada después del envío.
   1. Sin transferir agua de la bolsa al tanque, cuelgue la bolsa de transporte sobre la esquina del tanque con la bolsa parcialmente sumergida en el agua del tanque para comenzar a cambiar la temperatura de la bolsa de transporte. Retire el 10% del agua de la bolsa y vuelca por el fregadero. Agregue la misma cantidad de agua del tanque a la bolsa. Repita cada 10 minutos hasta que la temperatura del agua en la bolsa no sea más de 1 ° diferente a la temperatura del agua en el tanque.
   2. Una vez que la diferencia de temperatura de la bolsa y el tanque estén dentro de 1 °, asegúrese de que se usen guantes para mover los pulpos a su tanque individual. Para moverse, coloque ambas manos debajo del pulpo para proporcionar apoyo durante la transferencia; la segunda persona tendrá que tirar suavemente de los brazos succionados del costado de la bolsa.
   3. Una vez que el pulpo esté fuera de la bolsa, muévalo rápidamente al agua de su nuevo hábitat transfiriendo la menor cantidad de agua posible de la bolsa de envío. Use la bomba manual para eliminar cualquier tinta que el pulpo libere cuando esté en el tanque. Ahora pesa la bolsa con agua para obtener el peso aproximado del animal.
3. Durante las primeras 2 semanas después de la llegada, controle el consumo diario del pulpo que debe ser de alrededor del 4% al 8% de su peso58,65,66. El pulpo debe ser revisado cuatro veces al día; esto se puede disminuir a dos veces al día después de 2 semanas. Pesar cada dos semanas para ajustar su consumo de alimentos según sea necesario.
   NOTA: Se sabe que algunas especies de pulpos escapan de su tanque, por lo que es recomendable colocar un peso de 2,5 kg en la tapa de su tanque.

5. Cuidado diario

1. Utilizando un kit de prueba de agua salada disponible comercialmente para pH, amoníaco, nitrito y nitrato, agregue la cantidad de agua del tanque dirigida por el kit a los cuatro tubos de ensayo provistos con el kit. Como se especifica en el kit de prueba, agregue la cantidad de reactivo colorimétrico al tubo correspondiente.
2. Si los niveles de amoníaco, nitrito y nitrato están por encima de 0.5 ppm, 0.25 ppm y 10 ppm respectivamente, lave la biomasa del filtro de calcetines o cambie a un nuevo filtro de calcetines. Además, limpie la biomasa de la parte superior del skimmer con un cepillo y agregue bacterias desnitrificantes adicionales al tanque. Si los problemas persisten, reemplace el 25% del agua salada dulce.
   NOTA: Los pasos anteriores reducen los compuestos de nitrógeno dentro del ecosistema.
3. Retire todas las canales muertas de cangrejo y camarón del tanque, así como cualquier materia fecal de pulpo con una bomba manual. Retire todos los cangrejos vivos restantes del tanque y muévalos de regreso al tanque de almacenamiento. A continuación, reorganice los objetos grandes dentro del tanque.
4. Introduzca la mitad del número de cangrejos que el pulpo comería diariamente en el tanque que pesa 1.25 +/- 0.25 g. Alimente camarones descongelados o pequeños cangrejos violinistas machos a pulpos juveniles. Dependiendo del experimento, los cangrejos y camarones se pueden introducir en cualquier lugar del tanque o directamente al pulpo.
   NOTA: El consumo diario de alimentos de los pulpos es del 4%-8% de su ^peso67. Los camarones congelados también se pueden proporcionar como fuente de alimento en función del peso del pulpo.
5. Ofrezca cinco camarones fantasmas al día. En promedio, tres fueron consumidos en este experimento. Para proporcionar una variedad de alimentos al pulpo, dé una almeja o mejillón vivo una vez a la semana y siempre mantenga tres peces mosquito dentro del tanque.
   NOTA: No se requiere dar a los animales una variedad de alimentos y puede evitar que los animales sean atraídos por la comida durante los experimentos. El horario de alimentación utilizado aquí para monitorear mejor la alimentación y el comportamiento del pulpo es introducir la mitad del número de cangrejos en función del peso y aumentar el número de camarones a cinco por la mañana. Por la noche, introduzca la segunda mitad de los cangrejos en el tanque.

6. Saneamiento semanal

1. Apague las luces del skimmer, la bomba y el contenedor de algas antes de limpiar el sistema de sumidero. Luego, apague la válvula automática del sistema antes de eliminar el agua. Finalmente, retire el skimmer y toda el agua solo del sistema de sumidero.
2. Frote ligeramente el contenedor de algas para eliminar la mayor parte de la biomasa de sus paredes. Limpie el resto del área del sumidero con un cepillo. Retire el filtro del calcetín, limpie con vinagre y déjelo secar; rotar con otro filtro de calcetines cada semana reemplazándolo por otros nuevos cada tres meses. Retire y limpie la biomasa de la parte superior del skimmer semanalmente.
   NOTA: Evite usar metal para limpiar el plástico, ya que creará arañazos que podrían ser propensos al crecimiento microbiano.
3. Vuelva a colocar el skimmer en el sistema y comience a rellenarlo con agua salada. Cuando el área de la bomba comienza a llenarse, todos los sistemas se pueden volver a encender. Deje de agregar agua cuando la parte superior automática de la válvula de flotador esté en la posición de apagado.

Figura 4: Tanque para cangrejos violinistas (Minuca pugnax). El fondo del tanque está medio designado para lecho seco y la otra mitad para 2 cm de agua salada poco profunda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Tanque para camarón fantasma (Palaemonetes paludosus). Las rocas en el tanque de camarones proporcionan lugares para que los camarones se escondan y muden, así como para el crecimiento de microorganismos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Cuidado de animales enfermos

1. Siga la guía ^reference66 para evaluar el bienestar del pulpo.
   NOTA: Para los pulpos hembra, el final del ciclo de vida normalmente comienza después de poner huevos. El animal comenzará a disminuir el consumo de alimentos y dejará de comer por completo y se volverá más letárgico. La vida útil después del proceso de fin de vida varía. No se puede tomar ninguna otra medida excepto la alimentación y el monitoreo del animal. Los machos senescentes disminuirán el consumo de alimentos y se volverán ^{letárgicos68}.

8. Anestesia de pulpo

1. Realizar anestesia de pulpo como se detalla en Butler-Struben et ^al.69.
2. Obtenga un recipiente de 6 L con tapa que tenga al menos 15 cm de altura. Coloque 4 L de agua directamente del tanque del pulpo en el recipiente y proporcione aireación para 4 L de agua salada utilizando una pequeña bomba de aire con piedra de aire para diseminar oxígeno al ambiente ^acuático58.
3. Antes de la introducción del pulpo, agregue un 1% de EtOH al recipiente. Antes de manipular el pulpo, registre el número de respiraciones por minuto contando la exhalación de agua del sifón.
   NOTA: Para los pulpos dentro del laboratorio del investigador, las respiraciones basales son de 16 a 24 respiraciones por minuto.
4. Antes de mover el pulpo, registre la pigmentación de la piel del pulpo y la frecuencia respiratoria de referencia. Retire el pulpo del tanque usando un recipiente limpio de boca abierta de 4 L recogiéndolo con el agua circundante.
   NOTA: Durante la anestesia, las frecuencias respiratorias no necesariamente indican anestesia completa.
5. Pesa el pulpo mientras estás en el recipiente y luego muévelo colocando ambas manos alrededor del cuerpo del pulpo y levantándolo. Es posible que se necesite una segunda persona para extraer las extremidades succionadas de las paredes del contenedor.
6. Mueva rápidamente el pulpo al recipiente preparado con 1% de EtOH. Cierre la tapa para evitar un posible escape.
7. Registre la respiración del pulpo por minuto contando la exhalación de agua del sifón al final de los primeros 5 minutos. Si la respiración permanece por encima de la línea de base y el animal continúa respondiendo a un ligero pellizco, agregue un 0.25% adicional de EtOH al agua. La adición de etanol al agua puede continuar hasta un máximo de 3% EtOH.
   NOTA: Una indicación de que el pulpo está inconsciente es su pérdida de control de sus cromatóforos. En este caso la piel parece más pálida de lo normal. Otra indicación es pellizcar ligeramente los brazos y probar si hay una respuesta motora. Si todavía no hay respuesta en este punto, el pulpo está inconsciente y se pueden realizar experimentos.
8. Mientras esté bajo anestesia, controle la respiración y el color del pulpo para asegurarse de que permanezca inconsciente durante la duración del procedimiento. Si el pulpo comienza a despertarse durante el procedimiento, agregue un 0.25% adicional de EtOH.
9. Para revertir los efectos de la anestesia con etanol, transfiera el pulpo a un nuevo tanque de agua oxigenada de 4 L o más desde su tanque de retención permanente. Una vez que las respiraciones vuelven a la normalidad, el pulpo se activa y su piel vuelve a los pigmentos normales; se puede mover de vuelta a su tanque.

9. Eutanasia de pulpo

1. Siga los estándares internacionales para la eutanasia del pulpo como se detalla en Fiorito et al., Moltschaniwskyj et al., y Butler-Struben et al57,58,69.
2. Prepare un nuevo recipiente de 6 L con 4 L de agua del tanque de retención del pulpo. Mezclar en _MgCl2 a una concentración de 4% al tanque de eutanasia. Realiza pasos de 8.1 a 8.9 para anestesiar al pulpo.
3. Mueva el pulpo después del paso 8.8 al tanque de eutanasia. Después de que la respiración se detenga, espere 5 minutos y realice una descerebración del pulpo o manténgalo en el tanque de eutanasia durante 5 minutos adicionales.

10. Comportamiento de O. bimaculoides

1. No alimente al pulpo por las mañanas cuando será entrenado para usar un recipiente de tapón de rosca. Configure un dispositivo de grabación de cámara que apunte al área destinada a la alimentación.
2. Obtenga un tubo de tapón de rosca de 50 ml con orificios de 1 mm de diámetro en toda la superficie y la tapa para el flujo de agua en todo el recipiente. Coloque un cangrejo violinista dentro del recipiente. Coloque un peso dentro del recipiente o unido al exterior para que permanezca en el fondo del tanque.
3. Coloque el recipiente en el fondo del tanque dentro del área abierta y a la vista del pulpo y la cámara. Si el cangrejo no se ha comido después de 4 h, retírelo de la sonda y reanude el horario de alimentación del día. Sigue realizando este ejercicio diariamente.
   NOTA: Esto se muestra en la Figura 6 y se analiza en la sección de resultados representativos.

11. Resonancia magnética del pulpo

NOTA: Anteriormente, las respuestas de resonancia magnética funcional evocadas en la retina del pulpo se medían en animales ^{anestesiados70}. Aquí, obtuvimos una resonancia magnética de resolución espacial ultra alta del sistema nervioso del pulpo que requirió horas de escaneo. Por lo tanto, esto se realizó en una eutanasia O. bimaculoides.

1. Obtenga imágenes de resonancia magnética utilizando un sistema 7T. Envuelva el pulpo en una envoltura de plástico de cloruro de polivinilo de grado de cocina para mantener la hidratación del tejido. Coloque el pulpo en la envoltura, meta en los extremos y luego ruede para sellar.
2. Utilice una bobina de transmisión/recepción de volumen con un diámetro de 4 cm para adquirir imágenes del cerebro y de múltiples brazos. Utilice la secuencia RARE ponderada T1 con los siguientes parámetros: Tiempo de repetición (TR) de 1500 ms, tiempo de eco (TE) de 20 ms, resolución de 117 x 117 x 500 μm, 100 promedios, factor RARE 8. Estos son los parámetros típicos de resonancia magnética para obtener imágenes de cerebros de roedores. El uso de un factor RARE hace que las imágenes sean más rápidas, mientras que 100 imágenes se promedian juntas para aumentar la relación ^{señal-ruido71}.
3. Imagine el brazo del pulpo utilizando una bobina de transmisión de volumen de 86 mm y una bobina de recepción de matriz de 4 canales de 4 x 4 cm. Corte un brazo con tijeras quirúrgicas y colóquelo en un tubo cónico de 15 ml lleno de solución salina tamponada con fosfato.
   NOTA: La secuencia fue una secuencia de recuperación de inversión T1_weighted (MP-RAGE) con parámetros: TR/TE = 4000/2.17 ms, retardo de inversión 1050 ms, resolución de 100 x 100 x 500 μm, 9 promedios, tiempo de escaneo 1.5 h (Figura 7). Una secuencia de inversión-recuperación anula la señal del agua y aumenta el contraste dentro de la imagen; esta secuencia fue elegida porque permite visualizar la anatomía interna del ^brazo72.

12. Tomografía criofluoresciosa (CFT) por imágenes

1. Congelar el pulpo: Trabajar en una campana extractora. Cubra el fondo de un Dewar con hielo seco y luego llénelo con hexanos. Baje lentamente el pulpo en los hexanos durante aproximadamente 10 minutos, agregando hexanos frescos y hielo seco según sea necesario para cubrir completamente el pulpo con hexanos fríos. Mantenga el pulpo congelado a -20 °C hasta que esté incrustado.
2. Incrustar y seccionar el pulpo: Crear un molde rectangular del tamaño adecuado para sujetar el pulpo utilizando las herramientas proporcionadas por el fabricante CFT. Cubra la parte inferior del molde con medios OCT (temperatura de corte óptima) (material estándar utilizado en los laboratorios de histología) y deje que se congele en un gel semisólido.
3. Coloque el pulpo congelado en la capa de gel de la OCT y luego cubra lentamente con OCT en 2-3 capas. Entre los pasos de vertido, congele los pasos de bloque hasta que la OCT esté en la etapa de gel. Después de que el pulpo esté completamente cubierto, congele el bloque durante al menos 12 h a -20 ° C.
4. Cargue la muestra en el sistema de tomografía criofluorescencia73.
5. Secciona e imagina toda la eutanasia de O. bimaculoides a resolución mesoscópica utilizando 3 filtros de emisión/excitación, produciendo así varios conjuntos de datos isotrópicos 3D.
6. Cuando la sección llegue al brazo y al sistema digestivo, transfiera las secciones a las diapositivas para una histología adicional.
7. Cargue el conjunto de datos sin procesar en el software de reconstrucción del proveedor de CFT diseñado específicamente para permitir un procesamiento rápido.
8. Reconstruir una pila tridimensional utilizando la alineación de puntos de referencia, el equilibrio del histograma y las correcciones y normalización de fluorescencia, incluida la eliminación de los efectos de fluorescencia subsuperficial para cada longitud de onda.
9. Una vez que la herramienta de reconstrucción produce la pila 3D final, visualice los datos con la herramienta de software de imágenes y cree fly-throughs con superposiciones de luz blanca y fluorescencia junto con proyecciones de máxima intensidad 3D (3D-MIPS), por ejemplo, Figura ⁸⁷³.

Resultados

Todos los animales en nuestros estudios se obtuvieron de la naturaleza, por lo que no se pudo determinar su edad exacta y su estancia en el laboratorio fue variable. La condición de pulpo se observó diariamente. No vimos parásitos, bacterias, daños en la piel o comportamiento anormal. El peso promedio de los animales fue de 170,38 +/- 77,25 g. Cada animal habitaba su propio tanque de 40 galones. La desviación media ± estándar para los parámetros registrados para un tanque durante una semana fueron: pH 8.4 ± 0.0,...

Discusión

Configuración del sistema:
El ecosistema del acuario se ha desarrollado de manera que se emplean métodos mecánicos y biológicos de filtrado y oxigenación del agua. Los elementos filtrantes del sistema utilizan filtros de calcetines, skimmers de proteínas y limpieza regular para mantener los niveles de nitrógeno y oxígeno. Más importante aún, también dependemos de microorganismos marinos para consumir los compuestos nitrogenados peligrosos y otros desechos biológicos, así como para airear ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-3/4 in. Drill Bit	Home Depot	204074205	Glass cutting tool Part number:1
1" flow sensors	Neptune Systems	Local Dealer	Pipe with sensor to measure water flow Part number:2
1" Slip Bulkhead Strainer	Bulk Reef Supply	207113	Strainer for water leaving tank Part number:3
10 gallon tank	Preuss Pets	Local Dealer	Fiddler crab holding tank Part number:4
4 inch X 12 inch 200 Micron Nylon Monofiliment Mesh Filter Sock w/ Plastic Ring	AQUAMAXX	UJ41171	Filter for large organic matter in sump Part number:5
40 gallon aquarium	Preuss Pets	Local Dealer	4 Food aquarium tanks Part number:6
60g poly tanks - rectangle	Preuss Pets	Local Dealer	2 Water Storage (salt and freshwater) Part number:7
Active Aqua 1/10th HP Hydroponic or Aquarium Chiller 2018 Model	WayWe	719574198463	For cooling water continuously Part number:8
ALAZCO 2 Soft-Grip Handle Heavy-Duty Tile Grout Brush	ALAZCO	B06W2FT5V5	Tank Cleaning Part number:9
Ammonia Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	33D	For water testing Part number:10
Apex system WiFi	Neptune Systems	Local Dealer	System connection for off site monitoring Part number:11
API Aquarium Test Kit	Amazon	B001EUE808	For water testing Part number:12
API Copper Test Kit	Amazon	B0006JDWH8	For water testing Part number:13
Aqua Ultraviolet Classic UV 25 Watt Series Units	Aqua Ultraviolet	A00028	For removing bacteria leaving sump system Part number:14
AquaClear 50 Foam Filter Inserts, 3 pack	Aquaclear	A1394	Food Tank Carbon Filter Inserts Part number:15
Aqueon QuietFlow LED PRO Aquarium Power Filter 30	Aqueon	100106082	Food tank filtering units Part number:16
Auto Top Off Kit (ATK) (Each includes 1 FMM module, 2 optical sensors and 1 float)	Neptune Systems	Local Dealer	For freshwater tank Part number:17
Automatic top off from RODI (LLC)	Neptune Systems	Local Dealer	From water storage to octopus tanks Part number:18
Banded Trochus Snail	LiveAquaria	CN-112080	For algae bin Part number:19
Chaetomorpha Algae, Aquacultured	LiveAquaria	BVJ-76354	For algae bin Part number:20
Clams - Live, Hard Shell, Cherrystone, Wild, USA Dozen	Fulton Fish Market	N/A	Live food Part number:21
Classic Sea Salt Mix - Tropic Marin	Bulk Reef Supply	211813	Salt for tank water Part number:22
Clear Masterkleer Soft PVC Plastic Tubing, for Air and Water, 3/4" ID, 1" OD	McMaster	5233K71	Cleaning tool Part number:23
Continuum Aquablade-P Acrylic Safe Algae Scraper W/ Plastic Blade - 15 Inch	Marine Depot	4C31001	Cleaning tool Part number:24
Copper Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	65L	For water testing Part number:25
Curve Refugium CREE LED Aquarium Light	Eshopps	6500K	Algae bin light Part number:26
Eheim 1262 return pumps	EHEIM	1250219	Pump for storage tanks Part number:27
Eshopps R-100 Refugium Sump GEN 3	Eshopps	15000	Sump system Part number:28
Ethyl Alcohol, 200 Proof	Sigma-Aldrich	64-17-5	Anesthesia Part number:29
Extech DO600 ExStik II Dissolved Oxygen Meter	Extech	DO600	Oxygen measurement Part number:30
Fiddler Crabs; live; dozen	NORTHEAST BRINE SHRIMP	N/A	Live food Part number:31
Filter Cartridges	Aqueon	100106087	Food tank filters Part number:32
Florida Crushed Coral Dry Sand - CaribSea	Bulk Reef Supply	212959	Sediment for bottom of tank Part number:33
FMM module	Neptune Systems	Local Dealer	Controller for apex system Part number:34
Fritz-Zyme TurboStart 900 - Fritz	Bulk Reef Supply	213036	Bacteria start Part number:35
Hand Operated Drum Pump, Siphon, Basic Pump with Spout, For Container Type Bucket, Pail	Grainger	38Y789	Water Hand Pump Part number:36
High pH Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	27	For water testing Part number:37
Imagitarium Fine Mesh Net for Shrimp	Petco	2580993	Shrimp and fish transfer net Part number:38
Leak Detection Kit (LDK) - Includes FMM module plus 2 ALD sensors	Neptune Systems	Local Dealer	Placed on floor to detect water Part number:39
Lee`S Algae Scrubber Pad Jumbo - Glass	Marine Depot	LE12007	Cleaning tool Part number:40
Live rocks	Preuss Pets	Local Dealer	Habitat for octopus Part number:41
Long Bottle Cleaning Brush 17" Extra Long	Haomaomao	B07FS7J7PN	Tank Cleaning Part number:42
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M1028-100ML	Euthanasia Part number:43
Magnetic Probe Rack	Neptune Systems	Local Dealer	For holding apex sensor probes Part number:44
Marine Ghost Shrimp	NORTHEAST BRINE SHRIMP	N/A	Live food Part number:45
Marineland C-Series Canister Carbon Bags Filter Media, 2 count	Chewy	98331	For elevated copper levels Part number:46
Nitra-Zorb Bag	Aquarium Pharmaceuticals	AP2213	Absorbs nitrogen compounds Part number:47
Nitrate Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	LR1800	For water testing Part number:48
Nitrite Testing Kit	Aquarium Pharmaceuticals	26	For water testing Part number:49
Pawfly 2 Inch Air Stones Cylinder 6 PCS Bubble Diffuser Airstones for Aquarium Fish Tank Pump Blue	Amazon	B076S56XWX	Aerate water Part number:50
Penn Plax Airline Tubing for Aquariums –Clear and Flexible Resists Kinking, 8 Feet Standard	Amazon	B0002563MM	Tubing for connecting air pump to air stone Part number:51
Plumbing with unions/valves plus 3/4" flex hose	Preuss Pets	Local Dealer	Water transport Part number:52
PM1 module	Neptune Systems	Local Dealer	Power control module for apex Part number:53
Protein skimmer	Reef Octopus	AC20284	Removes biowaste from system Part number:54
PVC Apex Mounting board, grommets, wire mounts	Neptune Systems	Local Dealer	Helps ensure organization for wires and tubing within system Part number:55
PVC Regular Cement and 4-Ounce NSF Purple Primer	Amazon	Oatey - 30246	For connecting PVC pipes Part number:56
RODI unit	Neptune Systems	Local Dealer	RO Water Part number:57
Salinity Probes	HANNA probes	HI98319	Measures salinity of water Part number:58
Seachem Pristine Aquarium Treatment	Seachem	1438	Provides bacteria that break down excess food, waste and detritus Part number:59
Seachem Stability Fish Tank Stabilizer	Seachem	116012607	Seachem Stability will rapidly and safely establish the aquarium biofilter in freshwater and marine systems Part number:60
Set of lexan tops	Preuss Pets	Local Dealer	Aquarium tank lids Part number:61
Set of Various extended length aquabus cables	Neptune Systems	Local Dealer	Cables for Apex system Part number:62
SLSON Aquarium Algae Scraper Double Sided Sponge Brush Cleaner Long Handle Fish Tank Scrubber for Glass Aquariums	Amazon	B07DC2TZCJ	Cleaning tool Part number:63
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 45 Degree Elbow Adapter, 3/4 Socket Female x 3/4 Socket Male	McMaster	4880K189	PVC pipe Part number:64
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 90 Degree Elbow Adapter, 1 Socket Female x 1 Socket Male	McMaster	4880K773	PVC pipe Part number:65
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Adapter, 1 Socket-Connect Female x 1 Barbed Male	McMaster	4880K415	PVC pipe Part number:66
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Straight Reducer, 2 Socket Female x 3/4 Socket Female	McMaster	4880K008	PVC pipe Part number:67
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Tee Connector, White, 1 Size Socket-Connect Female	McMaster	4880K43	PVC pipe Part number:68
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 1 Pipe Size, 10 Feet Long	McMaster	48925K13	PVC pipe Part number:69
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 3/4 Pipe Size, 5 Feet Long	McMaster	48925K92	PVC pipe Part number:70
Structural FRP Fiberglass Sheet, 48" Wide x 96" Long, 1/2" Thick	McMaster	8537K15	Table top material Part number:71
Structural FRP Fiberglass Square Tube, 10 Feet Long, 2" Wide x 2" High Outside, 1/8" Wall Thickness	McMaster	8548K33	Structural table material Part number:72
Tank Sediment	TopDawg Pet Supply	8479001207	Sediment for bottom of fiddler crab tank Part number:73
Temperature probe	Neptune Systems	Local Dealer	Temperature probe for tanks Part number:74
Tetra TetraMarine Large Saltwater Flakes for all Marine Fish	Amazon	B00025K0US	Fish, shrimp, and crab food Part number:75
Tetra Whisper Aquarium Air Pump for 10 gallon Aquariums	Petco	2335234	Air pump for smaller tanks Part number:76
Thick-Wall Through-Wall Pipe Fitting, for Water, PVC Connector, 1 Socket-Connect Female	McMaster	36895K843	PVC pipe Part number:77
Vectra s2 pump	Bulk Reef Supply	212141	Aquarium Pump Part number:78
Water Pump	TACKLIFE	GHWP1A	Pump for cleaning tanks Part number:79
Wyze Cam v2 1080p HD Indoor WiFi Smart Home Camera with Night Vision	Amazon	B076H3SRXG	DeepLabCut Recording Part number:80