Diseño y desarrollo de un modelo para estudiar el efecto del oxígeno suplementario en el microbioma de las vías respiratorias de la fibrosis quística

Resumen

El objetivo de este protocolo es desarrollar un sistema modelo para el efecto de la hiperoxia en las comunidades microbianas de las vías respiratorias de la fibrosis quística. El medio de esputo artificial emula la composición del esputo, y las condiciones de cultivo hiperóxico modelan los efectos del oxígeno suplementario en las comunidades microbianas pulmonares.

Resumen

Se cree que las comunidades microbianas de las vías respiratorias desempeñan un papel importante en la progresión de la fibrosis quística (FQ) y otras enfermedades pulmonares crónicas. Los microbios se han clasificado tradicionalmente en función de su capacidad para usar o tolerar el oxígeno. El oxígeno suplementario es una terapia médica común administrada a personas con fibrosis quística (pwCF); sin embargo, los estudios existentes sobre el oxígeno y el microbioma de las vías respiratorias se han centrado en cómo la hipoxia (bajo nivel de oxígeno) en lugar de la hiperoxia (alto contenido de oxígeno) afecta a las comunidades microbianas pulmonares anaeróbicas predominantemente aeróbicas y facultativas. Para abordar esta brecha crítica de conocimiento, este protocolo se desarrolló utilizando un medio de esputo artificial que imita la composición del esputo de pwCF. El uso de la esterilización por filtro, que produce un medio transparente, permite que los métodos ópticos sigan el crecimiento de microbios unicelulares en cultivos en suspensión. Para crear condiciones hiperóxicas, este sistema modelo aprovecha las técnicas de cultivo anaeróbico establecidas para estudiar las condiciones hiperóxicas; en lugar de eliminar el oxígeno, el oxígeno se agrega a los cultivos mediante el sparging diario de botellas de suero con una mezcla de oxígeno comprimido y aire. El esputo de 50 pwCF se sometió a un sparging diario durante un período de 72 horas para verificar la capacidad de este modelo para mantener condiciones diferenciales de oxígeno. La secuenciación metagenómica con escopeta se realizó en muestras de esputo cultivadas y no cultivadas de 11 pwCF para verificar la capacidad de este medio para apoyar el crecimiento de microbios comensales y patógenos que se encuentran comúnmente en el esputo de fibrosis quística. Se obtuvieron curvas de crecimiento a partir de 112 aislamientos obtenidos de pwCF para verificar la capacidad de este medio de esputo artificial para apoyar el crecimiento de patógenos comunes de fibrosis quística. Encontramos que este modelo puede cultivar una amplia variedad de patógenos y comensales en el esputo cf, recupera una comunidad muy similar al esputo no cultivado en condiciones normóxicas y crea diferentes fenotipos de cultivo en condiciones variables de oxígeno. Este nuevo enfoque podría conducir a una mejor comprensión de los efectos imprevistos inducidos por el uso de oxígeno en pwCF en las comunidades microbianas de las vías respiratorias y los patógenos respiratorios comunes.

Introducción

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética caracterizada por una incapacidad para eliminar el moco espeso de los pulmones, lo que lleva a infecciones repetidas y disminución progresiva de la función pulmonar que a menudo resulta en la necesidad de un trasplante de pulmón o la muerte. El microbioma de las vías respiratorias de los pacientes con fibrosis quística (PTCF) parece rastrear la actividad de la enfermedad^1,con una reducción de la diversidad microbiana asociada con resultados adversos a largo plazo^2,3. En estudios clínicos de pwCF, la oxigenoterapia suplementaria se ha asociado con una enfermedad más avanzada^4,5, aunque tradicionalmente, el uso de la oxigenoterapia se ha visto simplemente como un marcador de la gravedad de la enfermedad⁶. Estudios recientes de un ensayo clínico de pacientes con insuficiencia respiratoria han demostrado que los niveles más altos de oxígeno en los pacientes se asocian paradójicamente con un aumento de las infecciones bacterianas graves y una mayor mortalidad^7,lo que sugiere que el oxígeno suplementario puede contribuir a la patogénesis de la enfermedad. El efecto del oxígeno suplementario sobre el microbioma pulmonar de la fibrosis quística y las comunidades microbianas pulmonares y respiratorias asociadas no se ha estudiado bien.

Los estudios mecanicistas a menudo no se pueden realizar directamente en sujetos humanos debido a dificultades logísticas y posibles problemas éticos asociados con intervenciones de beneficio o daño médico desconocido. Los enfoques traslacionales que integran bioespecímenes humanos en sistemas modelo pueden ofrecer importantes conocimientos biológicos en estos casos. Si bien la capacidad de usar o tolerar el oxígeno ha sido tradicionalmente un componente importante de la clasificación microbiana, se sabe poco sobre cómo la introducción terapéutica de oxígeno suplementario en el medio ambiente podría perturbar las comunidades microbianas de las vías respiratorias. Para arrojar luz sobre los efectos desconocidos del oxígeno suplementario en los microbiomas de las vías respiratorias de pwCF, necesitábamos abordar dos desafíos principales; primero, la creación de un medio de cultivo que se aproxime fisiológicamente a la composición del esputo cf; segundo, la creación de un sistema modelo que permita el mantenimiento de concentraciones elevadas de oxígeno en cultivo durante largos períodos de tiempo.

Los medios de esputo artificial (MAPE) se utilizan ampliamente para emular el esputo pulmonar ex vivo^8,9,10,pero no hay un consenso claro sobre una receta específica. Este protocolo describe una receta de medio de esputo artificial y una estrategia de preparación cuidadosamente diseñada para aproximarse fisiológicamente al esputo de pwCF. La Tabla 1 describe los valores de la receta elegida en función de la literatura publicada. Los componentes químicos básicos y el pH se compararon con los valores identificados por los estudios de esputo de FQ humana^11,12,13. Se añadieron nutrientes fisiológicos de baja concentración utilizando yema de huevo, que se incluyó como 0,25% del volumen final^10,así como mezclas de vitaminas y metales traza^14,15. La mucina, el componente clave del esputo^16,se incluyó al 1% p/v^14. Aunque requiere más mano de obra, se eligió la esterilización por filtro sobre la práctica más convencional de esterilización por calor para reducir los problemas potenciales de la desnaturalización inducida por el calor de los componentes esenciales de los medios¹⁰. Un beneficio adicional de la esterilización por filtro es que genera medios que son transparentes (la esterilización por calor puede crear medios turbios debido a la precipitación y coagulación de sales y proteínas), lo que permite que este medio de esputo artificial se utilice para seguir el crecimiento microbiano basado en aumentos en la turbidez.

Este sistema modelo para el cultivo hiperóxico se basa en técnicas de cultivo anaeróbico donde se agrega oxígeno en lugar de eliminarse, creando un modelo para el efecto del uso de oxígeno suplementario para pwCF. La Figura 1 y el protocolo de ahorro de oxígeno asociado describen los componentes de un sistema de ahorro de oxígeno, que se pueden obtener a bajo costo de proveedores generales de laboratorios y hospitales. Este sistema permite la mezcla de oxígeno comprimido y aire a concentraciones fijas que van desde el 21% hasta el 100% de oxígeno. La integración de un sensor de oxígeno permite verificar la concentración de la mezcla de gas de salida, así como verificar la composición del gas de salida de las botellas de suero previamente escasas para verificar que las condiciones de oxígeno se hayan mantenido dentro del rango deseado.

Este protocolo describe los procedimientos para crear un medio de esputo artificial, la construcción y el uso de un sistema de ahorro de oxígeno y la aplicación de ambos para cultivar esputo cf en condiciones diferenciales de oxígeno.

Protocolo

Este estudio recibió la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de Socios (Protocolo # 2018P002934). El criterio de inclusión incluyó pacientes adultos con fibrosis quística que dieron su consentimiento informado por escrito para el estudio. No había criterio de exclusión. De acuerdo con las pautas del protocolo, todas las muestras de esputo se recolectaron de pacientes con fibrosis quística durante una visita ambulatoria programada con su proveedor clínico.

1. Preparación del medio de esputo artificial

NOTA: Las cantidades enumeradas aquí son para la producción de 1 L de medio de esputo artificial final, y asumen los reactivos específicos enumerados en la Tabla de Materiales. Los números deben ajustarse para otros volúmenes o para el uso de diferentes reactivos para garantizar el mismo producto final. Véase el cuadro 1 para las concentraciones objetivo.

1. Mezcla química de esputo artificial (ASCM)
   NOTA: ASCM constituye el 25% del volumen medio final. Es estable en el estante y se puede preparar a granel o con anticipación. Si se está preparando para su uso posterior, autoclave la mezcla química y guárdela de forma segura a temperatura ambiente.
   1. Mezclar las soluciones de stock químico constituyente.
      1. Preparar 1 M de NaCl caldo: Añadir 58,44 g de NaCl por litro de agua estéril.
      2. Preparar 1 M KCl caldo: Añadir 74,55 g de KCl por litro de agua estéril.
      3. Preparar 1 M MgSO₄ caldo: Añadir 246,47 g de MgSO₄·7H₂O por litro de agua estéril, o 120,37 g de MgSO4 anhidro por litro de agua estéril.
      4. Preparar 1 M de caldo de glucosa: Añadir 180,16 g de glucosa por litro de agua estéril.
   2. Autoclave esteriliza las soluciones químicas de stock, así como una botella vacía de 250 ml. Realice los pasos de autoclave a valores mínimos estándar de 121 °C y 15 PSI durante 30 min.
   3. Agregue 80.59 ml de agua estéril a la botella vacía de 250 ml.
   4. Agregue 152.30 mL de 1 M de material de NaCl a la mezcla.
   5. Agregue 15.8 mL de 1 M de stock de KCl a la mezcla.
   6. Añadir 610 μL de 1 M MgSO₄ caldo a la mezcla.
   7. Añadir 700 μL de 1 M de caldo de glucosa a la mezcla.
2. Mezcla artificial de mucina de esputo (ASMM)
   NOTA: ASMM constituye el 50% del volumen medio final. Asegúrese de que se prepara el mismo día que el lote medio final.
   1. Agregue 450 ml de agua estéril a una botella vacía de 1 L.
   2. Agregue 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x a la botella.
   3. Agregue una barra de agitación magnética desechable a la botella.
   4. Autoclave la botella que contiene PBS y la barra de agitación.
   5. Mida 10 g de mucina en polvo y agréguelo al PBS.
   6. Agite la botella vigorosamente para una mezcla preliminar.
   7. Coloque la botella en una placa caliente con un agitador magnético. Ajuste el calor a medio-alto apuntando a 50 ° C y la velocidad de agitación a 1100 rpm. Aumente la velocidad gradualmente para que la barra no salga volando del imán.
      1. Dejar calentar y remover durante 15 min.
      2. Recoge la botella con guantes resistentes al calor. Observe para verificar si el polvo de mucina se asienta fuera de la solución.
      3. Si el polvo de mucina no está completamente disuelto, devuelva la botella al calor/agitador durante intervalos de 5 minutos hasta que se disuelva por completo.
   8. Deje que la mezcla de mucina se enfríe a temperatura ambiente.
3. Mezcla biológica de esputo artificial (ASBM)
   NOTA: ASBM es el 25% del volumen medio final. Prepárelo el mismo día que el lote medio final y, a diferencia de las otras mezclas, no exponga sus componentes a ningún calor.
   1. Descongele el caldo de vitaminas 100x en un refrigerador de 4 ° C o en hielo.
      NOTA: Pre-porcionar el stock de vitaminas en alícuotas de 10 ml para minimizar el número de ciclos de congelación / descongelación.
   2. Añadir 124,24 ml de agua estéril a la botella vacía de 250 ml en autoclave.
   3. Agregue 25.76 ml de 50x de contenido de aminoácidos esenciales a la mezcla.
   4. Agregue 80.14 ml de 100x de aminoácidos no esenciales a la mezcla.
   5. Agregue 10 ml de caldo de vitaminas 100x (descongelado) a la mezcla.
   6. Agregue 1 ml de material de metales traza 1000x a la mezcla.
   7. Agregue 8.33 ml de emulsión de yema de huevo al 30% a la mezcla.
   8. Añadir 400 μL de 10 g/L de cepa de ferritina a la mezcla.
   9. Mezcle bien la solución mediante agitación manual.
4. Medio de esputo artificial (ASM)
   1. Añadir 250 ml de ASCM al frasco de 1 L que contiene ASMM.
   2. Agregue 250 ml de ASBM a la botella mediana.
   3. Valore el medio con tampón MOPS básico (1 M) para alcanzar un pH de 6.3 en un papel de pH de rango estrecho. Antes de la titulación, la mezcla media será demasiado ácida.
   4. Refrigere el medio de esputo artificial resultante a 4 °C hasta que esté listo para la filtración.
   5. Para iniciar el proceso de filtración, transfiera 200 ml de medio de esputo artificial sin filtrar a un sistema de filtración al vacío con un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm.
   6. Conecte el sistema de filtración a la bomba de vacío, encienda la bomba de vacío, configúrela a 70 mbar y luego coloque la cámara en un agitador orbital que tiembla a 90 rpm en una cámara frigorífica a 4 ° C.
      1. Remata con 150 ml adicionales del medio a medida que se filtra una cantidad apreciable. Se necesitan 1-2 días para filtrar 1 L de medio por completo.
      2. Repetir con cámaras adicionales hasta filtrar todos los medios.
         NOTA: Trate de no filtrar más de 350 ml del medio a través del mismo filtro de 0,22 μm, ya que la mucina tapará el filtro con el tiempo.
   7. Refrigere el medio de esputo artificial filtrado a 4 °C hasta que esté listo para su uso. Use ASM dentro de un mes de la preparación para obtener los mejores resultados.

2. Ahorro de oxígeno

1. Configuración de la estación sparging
   NOTA: Este protocolo solo debe realizarse en su totalidad una vez, después de lo cual la configuración se puede mantener a través de un mantenimiento simple según sea necesario. Consulte la Figura 1 para obtener un esquema visual del sistema de ahorro de oxígeno.
   1. Obtener y asegurar adecuadamente los tanques de aire comprimido y oxígeno.
      PRECAUCIÓN: La alta presión hace que los tanques sean extremadamente peligrosos cuando se manejan mal. Asegúrese de que los tanques estén completamente sellados y asegurados, que no haya fugas cuando el tanque esté cerrado y que todo el personal de manejo esté completamente capacitado en su uso.
   2. Conecte un regulador de aire al tanque de aire comprimido con una llave inglesa. Para una lectura óptima del flujo en el regulador, coloque el regulador lo más cerca posible de una posición vertical.
   3. Conecte un regulador de oxígeno al tanque de oxígeno comprimido, uniéndose lo más cerca posible de una posición vertical. Dependiendo del tanque de oxígeno, es posible que deba invertir la dirección para apretar.
   4. Conecte el tubo de los reguladores a un conector en Y para combinar el flujo de gas de los dos tanques.
   5. Conecte la salida del conector Y a la válvula central de unión en T.
   6. Conecte un lado de la válvula central de unión en T a un manómetro de gas.
   7. Conecte el otro lado del manómetro de gas a un filtro de jeringa estéril de 25 mm de diámetro con un tamaño de poro de 0,22 μm.
   8. Conecte un segundo filtro de jeringa de 25 mm de diámetro a una jeringa sin émbolo para utilizarlo como liberación de gas durante el sparging.
   9. Conecte el lado final de la válvula central de unión en T a una segunda válvula de unión en T para el monitor de oxígeno.
   10. Conecte un filtro de jeringa de 25 mm de diámetro a un lado de esta segunda válvula de unión en T, junto con un tubo para conectar agujas de 18 G.
   11. Conecte el lado final de la segunda válvula de unión en T al aparato de monitoreo de oxígeno.
   12. Conecte un tubo de corte al otro lado del aparato de monitoreo de oxígeno para usarlo como liberación de gas durante el monitoreo.
       PRECAUCIÓN: Al probar / usar el sistema de ahorro de oxígeno, tome nota cuidadosamente de la posición de las uniones en T y asegúrese de que coincida con la trayectoria prevista a través del sistema. Si no lo hace, se acumulará presión dentro del sistema y hará que los componentes fallen y se separen.
   13. Para el mantenimiento del sistema y para mantenerlo funcionando a un rendimiento óptimo, las siguientes prácticas son beneficiosas.
       1. Refuerce las conexiones con cantidades liberales de cinta de teflón para mejorar en gran medida su sellado y reducir la posibilidad de que los componentes se separen de la presión interna.
       2. Mantenga el caudal combinado por debajo de 10 L/min para mitigar la presión máxima y evitar fallos.
       3. Si se sospecha una fuga, use una solución detergente como los detectores de fugas de líquidos disponibles en el mercado para identificar su ubicación fácilmente, ya que burbujeará por encima de cualquier fuga de gas. Parchee las fugas con una cinta de politetrafluoroetileno (por ejemplo, teflón).
       4. Reemplace los filtros de jeringa de 25 mm de diámetro en el sistema de ahorro de oxígeno dos veces por semana, pero esto varía con la frecuencia de uso. Con el tiempo, las partículas atrapadas en el filtro reducen el caudal de gas y causan acumulaciones de presión.
       5. Calibre el monitor de oxígeno al 21% de oxígeno comprimido antes de realizar las mediciones.
       6. Al finalizar el uso del sistema, apague los tanques y desangre el exceso de gas de los reguladores hasta que el flujo se detenga por completo.
2. Cultivo de botellas de suero
   1. Etiquete los frascos de suero en autoclave de 500 ml con identificadores de muestra, fecha/hora de inoculación y porcentaje de oxígeno objetivo.
   2. En una campana biológica, agregue 24 ml del medio de esputo artificial a cada frasco de suero que se esté configurando.
   3. Añadir 1 ml de esputo del paciente homogeneizado con una aguja de 18 G (diluido con solución salina estéril si es necesario para obtener un volumen suficiente de muestra para cada condición de cultivo) a cada frasco de suero.
   4. Usando pinzas estériles, coloque los tapones de goma en autoclave en la parte superior de cada frasco de suero.
   5. Presione los tapones de goma, tenga cuidado de no tocar la parte inferior del tapón con las manos.
   6. Retire las botellas de la campana, aplique y engarce los sellos de aluminio. Retire la pieza central de los sellos.
   7. Limpie la parte superior de las botellas con una toallita con alcohol y páselas a través de una llama de quemador Bunsen.
   8. Coloque una aguja estéril de 18 G en una jeringa sin émbolo con un filtro. Inserte primero esta liberación de gas en la botella.
   9. Coloque una aguja estéril de 18 G en la salida de gas del sistema e inserte también la aguja de salida de gas en la botella.
   10. Dirija las uniones en T desde los tanques a través del monitor de oxígeno. Verifique que la concentración de oxígeno objetivo fluya a través del sistema. Objetivo de aproximadamente 5 L/min de flujo de gas.
   11. Desvíe las uniones en T desde los tanques hasta la salida de gas. El gas comienza a fluir a través de la botella de suero.
       PRECAUCIÓN: Preste mucha atención al manómetro durante el ahorro de oxígeno. Si la presión aumenta inesperadamente, apague el sistema inmediatamente.
   12. Pase el sparge de oxígeno a través de la botella de suero durante 1 min. A 5 L/min, esto permite 10 intercambios de aire y asegura que la atmósfera interna alcance la presión parcial deseada.
   13. Retire la aguja de liberación de gas 18-G.
   14. Permita que la presión en la botella de suero se acumule a +1 atmósfera (2 atmósferas al nivel del mar) y luego retire inmediatamente la aguja de salida de gas.
       NOTA: Mantener la presión ayuda a la retención de condiciones hiperóxicas a lo largo del tiempo.
   15. Coloque el frasco de suero en un agitador de incubadora de 37 °C a 150 RPM. Incubar las muestras durante tres intervalos de 24 horas. En cada intervalo de 24 horas, tome una alícuota para el análisis aguas abajo, vuelva a sparge las muestras y devuélvalas a incubación durante un tiempo total de incubación de 72 h.
3. Medición de oxígeno de salida
   1. Calibre el medidor de oxígeno al 21% de aire comprimido y luego apague el tanque.
   2. Dirija la ingesta del frasco sérico a través del monitor de oxígeno y coloque una aguja estéril hasta el final.
   3. Inserte la aguja a través del tapón de goma en el frasco de suero.
   4. Espere a que la lectura del flujo de salida se estabilice. Un caudal bajo de las botellas de suero significa que esto puede tardar hasta 2 minutos. Informe la diferencia máxima del aire de la habitación (número más alejado del 21%).
   5. Si realiza varias lecturas, enjuague el sistema con aire comprimido entre lecturas.

Resultados

Estos protocolos se aplicaron a 50 muestras de esputo expectorado de pwCF que se presentaron para atención de rutina a una clínica ambulatoria de fibrosis quística en el Hospital General de Massachusetts en Boston, Massachusetts. El esputo de cada paciente se cultivó bajo condiciones de oxígeno al 21%, 50% y 100% utilizando el medio de esputo artificial, con 0,5 ml de alícuotas tomadas de cada cultivo a las 24 h, 48 h y 72 h de tiempo de cultivo para la prueba. Las culturas fueron fotografiadas cuando se hicieron e...

Discusión

En este estudio, se desarrolló un modelo in vitro para estudiar el efecto de la hiperoxia en las comunidades microbianas pulmonares. Este modelo, basado en medio de esputo artificial y sparging diario de botellas de suero, mantiene concentraciones elevadas de oxígeno y apoya el crecimiento de microbios identificados en esputo de pwCF.

Hay varios pasos críticos de este enfoque. La primera es la elección de usar la esterilización por filtro en lugar de la esterilización por calor ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BME Vitamins (100x) Solution	MilliporeSigma	B6891	Concentrated solution of supplemental vitamins.
Crimper, 30 mm	DWK Life Sciences	224307	Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G7021	Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).
Diaphragm Pump ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Vacuum pump for vacuum filtration.
Egg Yolk Emulsion	HiMedia	FD045	Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.
Ferritin, Cationized from Horse Spleen	MilliporeSigma	F7879	Ferritin (iron-storage protein) solution.
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner	Integra Biosciences	144000	Bunsen burner with user interface and safety features.
Hydrion pH Paper (1.0–14.0)	Micro Essential Laboratory	94	pH testing paper for the range of 1.0–14.0.
Hydrion pH Paper (4.0–9.0)	Micro Essential Laboratory	55	pH testing paper for the range of 4.0–9.0.
Hydrion pH Paper (6.0–8.0)	Micro Essential Laboratory	345	pH testing paper for the range of 6.0–8.0.
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G	Smiths Medical	401815	18 G needles with safety caps.
In-Line Pressure Gauge	MilliporeSigma	20469	Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.
Innova 42 Incubated Shaker	Eppendorf	2231000756	Combination incubator/orbital shaker.
Luer-Lok Syringe with Attached Needle	Becton Dickinson	309580	Combination 3 mL syringe and 18 G needle.
Luer Valve Assortment	World Precision Instruments	14011	Valves for gas flow tubing.
LSE Orbital Shaker	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Orbital shaker to agitate media during filtration.
Magnesium Sulfate Heptahydrate	MilliporeSigma	M2773	Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-346-15FM	Air flow rate regulator with 15 L/min meter.
MEM Amino Acids (50x) Solution	MilliporeSigma	M5550	Concentrated solution of essential amino acids.
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution	MilliporeSigma	M7145	Concentrated solution of non-essential amino acids.
Millex-GP Filter, 0.22 µm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter.
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q sterile water filtration system.
MiniOX 3000 Oxygen Monitor	MSA	814365	Gas flow oxygen percentage monitor.
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)	Boston BioProducts	BBM-90	MOPS buffer for adjusting media pH.
Mucin from Porcine Stomach	MilliporeSigma	M2378	Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit	Harvard Apparatus	72-1413	Connectors for gas flow tubing.
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096	Library preparation for identification during sequencing.
NovaSeq 6000 Sequencing System	Illumina	770-2016-025-N	Shotgun sequencing platform for generating sample reads.
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-540-15FM	Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors	SunMed	2001-01	Tubing for connecting gas system components.
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	Concentrated phosphate-buffered saline solution.
PC 420 Hot Plate/Stirrer	Marshall Scientific	CO-PC420	Combination hot plate/stirrer.
Potassium Chloride	MilliporeSigma	P9541	Solid potassium chloride salt.
PTFE Disposable Stir Bars	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Disposable magnetic stir bars.
PTFE Thread Seal Teflon Tape	VWR	470042-938	Teflon tape for reinforcing gas system connections.
Q-Gard 2 Purification Cartridge	MilliporeSigma	QGARD00D2	Purification cartridge for Milli-Q system.
Reusable Media Storage Bottles	ThermoFisher Scientific	06-423A	Bottles for mixing and storing culture media.
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl	DWK Life Sciences	224100-331	Rubber stoppers for serum bottles.
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL	DWK Life Sciences	223952	Glass serum bottles for sealed culturing.
Small Bore Extension Set	Braun Medical	471960	Tubing extension with luer lock connectors.
Sodium Chloride	MilliporeSigma	S3014	Solid sodium chloride salt.
Spike-in Control I (High Microbial Load)	ZymoBIOMICS	D6320	Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber.
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes	Professional Disposables International	H04082	Disposable germicidal wipes for sterilization.
Trace Metals Mixture, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Concentrated solution of physiological trace metals.
Unlined Aluminum Seal, 30 mm	DWK Life Sciences	224187-01	Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.
USP Medical Grade Air Tank	Airgas	AI USP200	Compressed air tank for input to sparging system.
USP Medical Grade Oxygen Tank	Airgas	OX USP200	Compressed oxygen tank for input to sparging system.