Design und Entwicklung eines Modells zur Untersuchung der Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mukoviszidose-Atemwegsmikrobiom

Zusammenfassung

Ziel dieses Protokolls ist es, ein Modellsystem für die Wirkung von Hyperoxie auf mikrobielle Gemeinschaften der Mukoviszidose der Atemwege zu entwickeln. Künstliches Sputummedium emuliert die Zusammensetzung von Sputum, und hyperoxische Kulturbedingungen modellieren die Auswirkungen von zusätzlichem Sauerstoff auf mikrobielle Lungengemeinschaften.

Zusammenfassung

Es wird angenommen, dass mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Mukoviszidose (CF) und anderer chronischer Lungenerkrankungen spielen. Mikroben wurden traditionell aufgrund ihrer Fähigkeit, Sauerstoff zu verwenden oder zu tolerieren, klassifiziert. Zusätzlicher Sauerstoff ist eine gängige medizinische Therapie, die Menschen mit Mukoviszidose (pwCF) verabreicht wird. Bestehende Studien zu Sauerstoff und dem Mikrobiom der Atemwege haben sich jedoch darauf konzentriert, wie hypoxie (sauerstoffarm) und nicht Hyperoxie (hoher Sauerstoffgehalt) die überwiegend aeroben und fakultativen anaeroben mikrobiellen Lungengemeinschaften beeinflusst. Um diese kritische Wissenslücke zu schließen, wurde dieses Protokoll unter Verwendung eines künstlichen Sputummediums entwickelt, das die Zusammensetzung von Sputum aus pwCF nachahmt. Die Verwendung der Filtersterilisation, die ein transparentes Medium ergibt, ermöglicht optische Methoden, um das Wachstum von einzelligen Mikroben in Suspensionskulturen zu verfolgen. Um hyperoxische Bedingungen zu erzeugen, nutzt dieses Modellsystem etablierte anaerobe Kultivierungstechniken, um hyperoxische Bedingungen zu untersuchen; Anstatt Sauerstoff zu entfernen, wird den Kulturen Sauerstoff zugesetzt, indem täglich Serumflaschen mit einer Mischung aus komprimiertem Sauerstoff und Luft geschont werden. Sputum von 50 pwCF wurde über einen Zeitraum von 72 Stunden täglich gespart, um die Fähigkeit dieses Modells zur Aufrechterhaltung unterschiedlicher Sauerstoffbedingungen zu überprüfen. Die metagenomische Shotgun-Sequenzierung wurde an kultivierten und unkultivierten Sputumproben von 11 pwCF durchgeführt, um die Fähigkeit dieses Mediums zu überprüfen, das Wachstum von kommensalen und pathogenen Mikroben zu unterstützen, die häufig in Mukoviszidose-Sputum vorkommen. Wachstumskurven wurden aus 112 Isolaten von pwCF erhalten, um die Fähigkeit dieses künstlichen Sputummediums zur Unterstützung des Wachstums häufiger Mukoviszidose-Erreger zu überprüfen. Wir stellen fest, dass dieses Modell eine Vielzahl von Krankheitserregern und Kommensalen im CF-Sputum kultivieren kann, eine Gemeinschaft wiederherstellt, die dem unkultivierten Sputum unter normoxischen Bedingungen sehr ähnlich ist, und verschiedene Kulturphänotypen unter unterschiedlichen Sauerstoffbedingungen erzeugt. Dieser neue Ansatz könnte zu einem besseren Verständnis der unvorhergesehenen Wirkungen führen, die durch die Verwendung von Sauerstoff in pwCF auf mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege und häufige Atemwegspathogene induziert werden.

Einleitung

Mukoviszidose (CF) ist eine genetische Erkrankung, die durch die Unfähigkeit gekennzeichnet ist, dicken Schleim aus der Lunge zu entfernen, was zu wiederholten Infektionen und fortschreitendem Rückgang der Lungenfunktion führt, was oft zu einer Lungentransplantation oder zum Tod führt. Das Atemwegsmikrobiom von Menschen mit Mukoviszidose (pwCF) scheint die Krankheitsaktivität¹zu verfolgen, wobei eine Verringerung der mikrobiellen Vielfalt mit unerwünschten Langzeitergebnissen verbunden ist^2,3. In klinischen Studien mit pwCF wurde die ergänzende Sauerstofftherapie mit fortgeschritteneren....

Protokoll

Diese Studie wurde vom Partners Institutional Review Board genehmigt (Protokoll Nr. 2018P002934). Einschlusskriterium umfasste erwachsene Patienten mit Mukoviszidose, die eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung für die Studie erteilten. Es gab kein Ausschlusskriterium. Gemäß den Protokollrichtlinien wurden alle Sputumproben von Patienten mit Mukoviszidose während eines geplanten ambulanten Besuchs bei ihrem klinischen Anbieter gesammelt.

1. Künstliche Sputum Medium Vorbereitung

HINWEIS: Die hier aufgeführten Mengen beziehen sich auf die Herstellung von 1 l des endgültigen künstlichen Sputummediums und setzen....

Ergebnisse

Diese Protokolle wurden auf 50 expektorierte Sputumproben von pwCF angewendet, die einer ambulanten Mukoviszidose-Klinik am Massachusetts General Hospital in Boston, Massachusetts, zur Routineversorgung vorgelegt wurden. Das Sputum jedes Patienten wurde unter 21%, 50% und 100% Sauerstoffbedingungen unter Verwendung des künstlichen Sputummediums kultiviert, wobei 0,5 ml Aliquots aus jeder Kultur nach 24 h, 48 h und 72 h Kulturzeit zum Testen entnommen wurden. Kulturen wurden fotografiert, als Extraktionen vorgenommen wur.......

Diskussion

In dieser Studie wurde ein In-vitro-Modell entwickelt, um die Wirkung von Hyperoxie auf mikrobielle Lungengemeinschaften zu untersuchen. Dieses Modell, das auf künstlichem Sputummedium und täglichem Sparging von Serumflaschen basiert, hält erhöhte Sauerstoffkonzentrationen aufrecht und unterstützt das Wachstum von Mikroben, die im Sputum von pwCF identifiziert wurden.

Es gibt mehrere kritische Schritte dieses Ansatzes. Erstens ist die Wahl, Filter-Sterilisation anstelle von Hitze.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BME Vitamins (100x) Solution	MilliporeSigma	B6891	Concentrated solution of supplemental vitamins.
Crimper, 30 mm	DWK Life Sciences	224307	Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G7021	Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).
Diaphragm Pump ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Vacuum pump for vacuum filtration.
Egg Yolk Emulsion	HiMedia	FD045	Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.
Ferritin, Cationized from Horse Spleen	MilliporeSigma	F7879	Ferritin (iron-storage protein) solution.
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner	Integra Biosciences	144000	Bunsen burner with user interface and safety features.
Hydrion pH Paper (1.0–14.0)	Micro Essential Laboratory	94	pH testing paper for the range of 1.0–14.0.
Hydrion pH Paper (4.0–9.0)	Micro Essential Laboratory	55	pH testing paper for the range of 4.0–9.0.
Hydrion pH Paper (6.0–8.0)	Micro Essential Laboratory	345	pH testing paper for the range of 6.0–8.0.
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G	Smiths Medical	401815	18 G needles with safety caps.
In-Line Pressure Gauge	MilliporeSigma	20469	Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.
Innova 42 Incubated Shaker	Eppendorf	2231000756	Combination incubator/orbital shaker.
Luer-Lok Syringe with Attached Needle	Becton Dickinson	309580	Combination 3 mL syringe and 18 G needle.
Luer Valve Assortment	World Precision Instruments	14011	Valves for gas flow tubing.
LSE Orbital Shaker	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Orbital shaker to agitate media during filtration.
Magnesium Sulfate Heptahydrate	MilliporeSigma	M2773	Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-346-15FM	Air flow rate regulator with 15 L/min meter.
MEM Amino Acids (50x) Solution	MilliporeSigma	M5550	Concentrated solution of essential amino acids.
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution	MilliporeSigma	M7145	Concentrated solution of non-essential amino acids.
Millex-GP Filter, 0.22 µm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 µm polyethersulfone membrane sterile syringe filter.
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q sterile water filtration system.
MiniOX 3000 Oxygen Monitor	MSA	814365	Gas flow oxygen percentage monitor.
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)	Boston BioProducts	BBM-90	MOPS buffer for adjusting media pH.
Mucin from Porcine Stomach	MilliporeSigma	M2378	Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit	Harvard Apparatus	72-1413	Connectors for gas flow tubing.
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096	Library preparation for identification during sequencing.
NovaSeq 6000 Sequencing System	Illumina	770-2016-025-N	Shotgun sequencing platform for generating sample reads.
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-540-15FM	Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors	SunMed	2001-01	Tubing for connecting gas system components.
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	Concentrated phosphate-buffered saline solution.
PC 420 Hot Plate/Stirrer	Marshall Scientific	CO-PC420	Combination hot plate/stirrer.
Potassium Chloride	MilliporeSigma	P9541	Solid potassium chloride salt.
PTFE Disposable Stir Bars	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Disposable magnetic stir bars.
PTFE Thread Seal Teflon Tape	VWR	470042-938	Teflon tape for reinforcing gas system connections.
Q-Gard 2 Purification Cartridge	MilliporeSigma	QGARD00D2	Purification cartridge for Milli-Q system.
Reusable Media Storage Bottles	ThermoFisher Scientific	06-423A	Bottles for mixing and storing culture media.
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl	DWK Life Sciences	224100-331	Rubber stoppers for serum bottles.
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL	DWK Life Sciences	223952	Glass serum bottles for sealed culturing.
Small Bore Extension Set	Braun Medical	471960	Tubing extension with luer lock connectors.
Sodium Chloride	MilliporeSigma	S3014	Solid sodium chloride salt.
Spike-in Control I (High Microbial Load)	ZymoBIOMICS	D6320	Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0.22 µm vacuum filtration chamber.
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes	Professional Disposables International	H04082	Disposable germicidal wipes for sterilization.
Trace Metals Mixture, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Concentrated solution of physiological trace metals.
Unlined Aluminum Seal, 30 mm	DWK Life Sciences	224187-01	Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.
USP Medical Grade Air Tank	Airgas	AI USP200	Compressed air tank for input to sparging system.
USP Medical Grade Oxygen Tank	Airgas	OX USP200	Compressed oxygen tank for input to sparging system.