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Resumen

Este protocolo detalla un método mejorado para sintetizar altos rendimientos de proteínas recombinantes a partir de un sistema de transcripción-traducción libre de células (TX-TL) de Streptomyces venezuelae .

Resumen

Streptomyces spp. son una fuente importante de antibióticos clínicos y productos químicos industriales. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 es una cepa de rápido crecimiento y un productor natural de cloranfenicol, jadomicina y pikromicina, lo que la convierte en un candidato atractivo como chasis de biología sintética de próxima generación. Por lo tanto, las herramientas genéticas que aceleran el desarrollo de S. venezuelae ATCC 10712, así como otros modelos de Streptomyces spp., son altamente deseables para la ingeniería y el descubrimiento de productos naturales. Con este fin, se proporciona un sistema dedicado S . venezuelae ATCC 10712 libre de células en este protocolo para permitir la expresión heteróloga de alto rendimiento de genes de alto G + C (%). Este protocolo es adecuado para reacciones por lotes a pequeña escala (10-100 μL) en formato de placa de 96 o 384 pocillos, mientras que las reacciones son potencialmente escalables. El sistema libre de células es robusto y puede lograr altos rendimientos (~ 5-10 μ M) para una gama de proteínas recombinantes en una configuración mínima. Este trabajo también incorpora un amplio conjunto de herramientas de plásmidos para la medición en tiempo real de la síntesis de ARNm y proteínas, así como la tinción de fluorescencia en gel de proteínas marcadas. Este protocolo también se puede integrar con flujos de trabajo de caracterización de expresión génica de alto rendimiento o el estudio de vías enzimáticas de genes de alto G + C (%) presentes en genomas de Actinomycetes.

Introducción

Los sistemas de transcripción-traducción sin células (TX-TL) proporcionan una plataforma de creación de prototipos ideal para la biología sintética para implementar ciclos rápidos de diseño-construcción-prueba-aprendizaje, el marco de ingeniería conceptual para la biología sintética1. Además, existe un creciente interés en los sistemas TX-TL para la producción de proteínas recombinantes de alto valor en un entorno de reacción abierta2, por ejemplo, para incorporar aminoácidos no estándar en conjugados anticuerpo-fármaco3. Específicamente, TX-TL requiere un extracto celular, plásmido o ADN lineal, y una solución energética para catalizar la síntesis de proteínas en reacciones por lotes o semicontinuas. Si bien Escherichia coli TX-TL es el sistema libre de células dominante, una serie de sistemas TX-TL no modelo emergentes han atraído la atención para diferentes aplicaciones4,5,6,7,8. Las ventajas clave de TX-TL incluyen escalabilidad flexible (escala de nanolitro a litro)9,10, una fuerte reproducibilidad y flujos de trabajo automatizados8,11,12. En particular, la automatización de TX-TL permite la caracterización acelerada de partes genéticas y elementos reguladores8,12,13.

En términos de configuración de reacción, TX-TL requiere fuentes de energía primarias y secundarias, así como aminoácidos, cofactores, aditivos y una secuencia de ADN plantilla. Los trifosfatos de nucleótidos (NTP) proporcionan la fuente de energía primaria para impulsar el ARNm inicial (ATP, GTP, CTP y UTP) y la síntesis de proteínas (solo ATP y GTP). Para aumentar los rendimientos de TX-TL, los NTP se regeneran a través del catabolismo de una fuente de energía secundaria, como maltosa14, maltodextrina15, glucosa14, 3-fosfoglicerato (3-PGA)16, fosfoenolpiruvato17 y L-glutamato18. Esta actividad metabólica inherente es sorprendentemente versátil, pero poco estudiada, especialmente en sistemas TX-TL emergentes. Cada fuente de energía tiene propiedades y ventajas distintas en términos de rendimiento de ATP, estabilidad química y costo, lo cual es una consideración importante para las reacciones TX-TL a escala. Hasta el momento, los protocolos actuales para E. coli TX-TL han alcanzado hasta 4,0 mg/mL (~157 μM) para el modelo de proteína verde fluorescente (GFP), utilizando una mezcla de 3-PGA (30 mM), maltodextrina (60 mM) y D-ribosa (30 mM) como fuente de energía secundaria19.

Recientemente, ha habido un creciente interés en el estudio de las vías biosintéticas de metabolitos secundarios en sistemas TX-TL20,21,22. Específicamente, las Actinobacterias son una fuente importante de metabolitos secundarios, incluyendo antibióticos y productos químicos agrícolas23,24. Sus genomas están enriquecidos con los llamados grupos de genes biosintéticos (BGC), que codifican vías enzimáticas para la biosíntesis de metabolitos secundarios. Para el estudio de las partes genéticas de Actinobacterias y las vías biosintéticas, recientemente se ha desarrollado una gama de sistemas TX-TL basados en Streptomyces5,6,25,26. Estos sistemas especializados Streptomyces TX-TL son potencialmente beneficiosos por las siguientes razones: [1] provisión de un entorno de plegamiento de proteínas nativas para enzimas de Streptomyces spp.26; [2] acceso a un grupo óptimo de ARNt para la alta expresión génica de G+C (%) [3] metabolismo primario activo, que potencialmente puede ser secuestrado para el suministro de precursores biosintéticos; y [4] suministro de enzimas, precursores o cofactores del metabolismo secundario presentes en el extracto de células nativas. Por lo tanto, recientemente se ha establecido un kit de herramientas S.venezuelae TX-TL de alto rendimiento para aprovechar estas capacidades únicas5.

Streptomyces venezuelae es un huésped emergente para la biología sintética con una rica historia en biotecnología industrial5,27,28,29 y como sistema modelo para el estudio de la división celular y la regulación genética en Actinobacteria30,31,32. La cepa tipo principal, S. venezuelae ATCC 10712, tiene un genoma relativamente grande de 8,22 Mb con un contenido de G+C del 72,5% (%) (número de acceso: CP029197), que codifica 7377 secuencias codificantes, 21 ARNr, 67 ARNt y 30 grupos de genes biosintéticos27. En biología sintética, S. venezuelae ATCC 10712 es un chasis atractivo para la expresión heteróloga de vías biosintéticas. A diferencia de la mayoría de las otras tinciones de Streptomyces, proporciona varias ventajas clave, incluyendo un rápido tiempo de duplicación (~40 min), una amplia gama de herramientas genéticas y experimentales5,28, falta de aglomeración micelial y esporulación en medios líquidos28,33. Varios estudios también han demostrado el uso de S. venezuelae para la producción heteróloga de una amplia gama de metabolitos secundarios, incluyendo policétidos, péptidos ribosómicos y no ribibosomales34,35,36,37,38. Estas características combinadas hacen de esta cepa un huésped microbiano atractivo para aplicaciones de biología sintética e ingeniería metabólica. Si bien S. venezuelae no es el modelo dominante de Streptomyces para la expresión génica heteróloga, con nuevos desarrollos, está preparado para un uso más amplio dentro del descubrimiento de productos naturales.

Este manuscrito presenta un protocolo detallado (Figura 1) para un sistema S. venezuelae TX-TL de alto rendimiento, que ha sido actualizado a partir del protocolo original publicado anteriormente26. En este trabajo, la solución energética y las condiciones de reacción se han optimizado para aumentar el rendimiento proteico hasta 260 μg/mL para la proteína reportera mScarlet-I en una reacción por lotes de 4 h, 10 μL, utilizando un plásmido estándar, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Este plásmido ha sido diseñado específicamente para permitir varios métodos de detección de la expresión de proteínas. El protocolo también se simplifica, mientras que el sistema de energía se ha optimizado para reducir la complejidad y el costo de configurar reacciones sin células sin comprometer el rendimiento. Junto con el sistema TX-TL optimizado, se ha desarrollado una biblioteca de partes genéticas para ajustar la expresión génica y como herramientas fluorescentes para monitorear TX-TL en tiempo real, creando así una plataforma versátil para la creación de prototipos de expresión génica y vías biosintéticas de productos naturales de Streptomyces spp. y Actinobacterias relacionadas.

En este trabajo, el plásmido estándar recomendado (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) se puede utilizar para establecer el flujo de trabajo de S. venezuelae TX-TL en un nuevo laboratorio y está disponible en AddGene (ver Tabla suplementaria S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I proporciona al usuario la flexibilidad de estudiar otros marcos de lectura abierta (ORF). El ORF mScarlet-I está optimizado para la expresión génica de S. venezuelae. El promotor SP44 es un fuerte promotor constitutivo que es altamente activo tanto en E. coli como en Streptomyces spp.39. El plásmido tiene dos sitios únicos de enzimas de restricción (NdeI, BamHI) para permitir la subclonación de nuevos ORF en el marco con un sistema conjunto de etiqueta FLAG-terminal C y horquilla arsenical de fluoresceína (FlAsH). Alternativamente, ambas etiquetas se pueden eliminar con la inclusión de un codón de parada después de la subclonación de un nuevo gen. Con este vector base, se ha demostrado la expresión de alto rendimiento de una gama de proteínas, a saber, proteínas de la vía de biosíntesis de oxitetraciclina y una péptido sintetasa no ribossomal no caracterizada (NRPS) de Streptomyces rimosus (Figura 2). En términos de detección de ARNm, el plásmido estándar pTU1-A-SP44-mScarlet-I contiene un aptámero dBroccoli (en la región 3'-no traducida) para la detección con la sonda 3,5-difluoro-4-hidroxibencilideno imidazolinona (DFHBI). Para una mayor flexibilidad, también se ha puesto a disposición en AddGene un conjunto de herramientas de piezas MoClo compatibles con EcoFlex40, incluido un vector lanzadera Streptomyces compatible con EcoFlex (pSF1C-A-RFP /pSF2C-A-RFP) y una gama de plásmidos variantes de pTU1-A-SP44 que expresan proteína de fluorescencia verde supercarpeta (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I y β-glucuronidasa (GUS). En particular, el plásmido pSF1C-A se deriva de pAV-gapdh28 y se cura de los sitios BsaI / BsmBI para el ensamblaje de MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP es equivalente a pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP de EcoFlex40, pero contiene funcionalidad adicional para la conjugación y la integración cromosómica en Streptomyces spp. utilizando el sistema de integrasa phiC3128.

La primera etapa del protocolo implica el crecimiento de la S. venezuelae ATCC 10712 o una cepa estrechamente relacionada, la cosecha celular en la fase exponencial media, los pasos de lavado celular y el equilibrio en los tampones S30A y S30B. Esta etapa requiere tres días, y el tiempo para el crecimiento celular se puede utilizar para preparar los componentes restantes como se describe a continuación. Las células cosechadas se lisan por sonicación, se clarifican y se someten a una reacción de escorrentía. En esta etapa final de preparación, los extractos celulares se pueden preparar para el almacenamiento a largo plazo a -80 ° C para minimizar la pérdida de actividad. Para el ensamblaje de reacciones TX-TL utilizando este protocolo, se presenta un Streptomyces Master Mix (SMM), con la opción de un formato de Solución de Energía Mínima (MES) que da rendimientos comparables. Además, se recomienda rayar un cultivo fresco de S. venezuelae ATCC 10712 a partir de un caldo de glicerol de -80 °C en un plato de agar GYM e incubar a 28 °C durante al menos 48-72 h hasta que se vean colonias individuales. Solo se deben usar cultivos frescos para los siguientes pasos.

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla 1 y la Tabla 2 para obtener recetas para el plato medio y agar GYM y los tampones de lavado S30A y S30B.

1. Preparación de soluciones y orientación general

  1. Mantenga todas las soluciones, células (post-crecimiento) y extractos de células en hielo después de la preparación, a menos que se indique una excepción.
  2. Almacene existencias para 1 M mg-glutamato, 4 M K-glutamato, 40% (p/v) PEG 6000, 1 g/ml de ácido polivinilsulfónico a temperatura ambiente y todas las demás existencias a -80 °C. Minimice el número de ciclos de congelación-descongelación para evitar la degradación química.
  3. Para la preparación de existencias de soluciones energéticas (ver Tabla 3) como 3-PGA (requiere ajuste de pH), siga las instrucciones proporcionadas en el protocolo E. coli TX-TL41.
    NOTA: Todos los componentes son totalmente solubles en ddH2O y se almacenan como alícuotas en el congelador de -80 °C.
  4. Descongelar acciones individuales o soluciones energéticas (descritas más adelante) en hielo. Calentar la culata de aminoácidos a 42 °C con vórtice durante ~15-30 min para solubilizar todos los aminoácidos.
  5. Como algunos aminoácidos (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) precipitan en hielo, mientras minimizan el tiempo de descanso, deje esta solución a temperatura ambiente y use un vórtice para disolverse.
  6. Agregue los volúmenes calculados (Tabla 3) de soluciones madre y agua y mezcle bien usando un vórtice.
  7. Alícuota la solución energética como alícuotas de 20-100 μL por tubo, o según se desee, en hielo y guárdela a -80 °C hasta su uso posterior.

2. Preparación de células S. venezuelae ATCC 10712

  1. Día 1-Preparación de medios/tampón y pre-cultivo nocturno
    1. Preparar 1 L de medio líquido estéril GYM en un matraz desconcertado de 2 L, como se describe en la Tabla 1. Consulte la Tabla de materiales para fuentes de equipos/químicos/reactivos.
    2. Preparar 1 x 50 ml de medio líquido estéril GYM en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, como se describe en la Tabla 1.
    3. Preparar 100 mL de 1 M HEPES-KOH pH 7.5, 100 mL de 1 M MgCl2, y 500 mL de 4 M NH4Cl soluciones para hacer 1 L de tampones de lavado S30A y 1 L de S30B. Ver Tabla 2 para las recetas.
    4. Preparar la pre-cultura de la noche. Precaliente los 50 ml estériles de medio líquido GYM en un matraz Erlenmeyer de 250 ml a 28 °C durante 30 min.
    5. Inocular una sola colonia de S. venezuelae ATCC 10712 (o cepa relacionada) de una placa de agar GYM en 50 ml precalentados de medio líquido GYM e incubar a 28 °C, 200 rpm durante 16 h (precultivo durante la noche).
  2. Día 2-Preparar la pre-cultura diurna y la cultura de crecimiento principal.
    1. Precaliente 50 ml de medio líquido estéril GYM en un matraz Erlenmeyer de 250 ml a 28 °C durante 30 min.
    2. Transfiera 1 ml de precultivo durante la noche a 50 ml precalentados de medio líquido GYM e incube a 28 °C, 200 rpm durante 8 h (precultivo diurno).
    3. Después de este período de crecimiento, verifique el OD600 en un espectrofotómetro utilizando una dilución 1:10 con medio GYM estéril en una cubeta de plástico de 1 ml (1 cm de longitud de la trayectoria).
      NOTA: El OD600 debería haber alcanzado al menos 3-4. Si hay un crecimiento deficiente, es aconsejable repetir los pasos 2.2.1-2.2.2.
    4. Subcultivo 0,25 mL de precultivo diurno en 1 L de medio líquido GYM en matraces desconcertados de 2 L.
    5. Agitar durante la noche a 28 °C, 200 rpm durante 14 h.
  3. Día 3-Cosecha de células
    1. Después del período de incubación anterior (14 h), registre el OD600 del cultivo principal. Diluya el cultivo nocturno 1:10 con medio GYM fresco para la medición de OD600 .
      NOTA: El OD600 debería haber alcanzado 3.0-4.0 en esta etapa.
    2. Si OD600<3.0, aumente la velocidad de agitación a 250-300 rpm y crezca hasta que se alcance un OD600 de 3.0. Crecer por no más de 2 h adicionales (16 h en total).
    3. Si OD600>3.0, transfiera los cultivos a recipientes de centrifugación y enfríe rápidamente en hielo húmedo durante 30 minutos.
    4. Mientras espera que el cultivo celular se enfríe en hielo, prepare 4 ml de ditiotreitol fresco (TDT), S30A y S30B, como se describe en la Tabla 1, y manténgalos en hielo. Consulte la Tabla de materiales para la fuente química / reactivo.
    5. Pesar previamente un tubo de centrífuga vacío de 50 ml y preenfriar a -20 °C.
    6. Añadir 2 mL de 1 M de TDT a 1 L de tampón S30A sobre hielo y mezclar bien.
      NOTA: Agregue TDT a los búferes de lavado S30A y S30B solo antes de usarlos.
    7. Centrifugar las células a 6.000 × g, 4 °C, 10 min, y desechar cuidadosamente el sobrenadante en un movimiento rápido y único.
      NOTA: Si el pellet está perturbado, maximice la retención celular con medio GYM residual y continúe con el protocolo.
    8. Agregue 500 ml de tampón S30A y resuspenda las células agitando las botellas de centrifugación vigorosamente hasta que los grupos celulares se dispersen homogéneamente.
    9. Centrifugar las células a 6.000 × g, 4 °C, 6 min, y desechar cuidadosamente el sobrenadante.
      NOTA: Aunque el pellet celular será más firme en este punto, algunas células permanecerán en suspensión (ver Figura 1). Tratar como se describe en 2.3.7 y retener tantas células como sea posible.
    10. Repita los pasos 2.3.8-2.3.9.
    11. Añadir 2 mL de 1 M de TDT a 1 L de tampón S30B sobre hielo y mezclar bien. Agregue 500 ml de búfer S30B a las celdas. Repita el paso 2.3.9.
    12. Resuspender el pellet celular en 10 ml de tampón S30B y transferirlo al tubo de centrífuga de 50 ml prepesado y preenfriado. Si es necesario, transfiera las células residuales con un búfer adicional de 5-10 ml de S30B. Llene hasta 50 ml con S30B.
    13. Centrifugar las células a 6.000 × g, 4 °C, 10 min, y desechar cuidadosamente el sobrenadante.
    14. Repita el paso 2.3.13.
    15. Aspire cuidadosamente el sobrenadante S30B restante con una pipeta de 100-200 μL.
    16. Pesar el pellet de célula húmeda.
      NOTA: El peso típico del pellet de célula húmeda para 1 L de cultivo GYM durante la noche (OD600 = 3.0) es de ~ 4.5 g.
    17. Por cada 1 g de células húmedas, agregue 0,9 ml de tampón S30B. Resuspend las células usando una pipeta Pasteur o un vórtice.
    18. Centrifugar brevemente (~10 s) hasta 500 × g para sedimentar las células.
      NOTA: El protocolo se puede pausar en este punto, y las células se pueden congelar en nitrógeno líquido o hielo seco y almacenarse a -80 ° C. Por seguridad, use el equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando manipule nitrógeno líquido, incluidos protectores faciales y guantes.

3. Lisis celular por sonicación para obtener el extracto celular crudo

NOTA: En esta etapa, el usuario puede optar por interrumpir las células por sonicación, ya sea en fracciones de 1 ml (opción 1) o como una suspensión de celda más grande (5 ml) en un tubo de 50 ml (opción 2). Ambas opciones se han detallado a continuación para garantizar la reproducibilidad, ya que el volumen final de la suspensión celular puede cambiar debido a la pérdida de células durante los pasos previos de recolección y lavado. Un nuevo usuario debe intentar primero la opción 2.1 para establecer el protocolo.

  1. Lisis celular por sonicación en fracciones de 1 mL
    1. Usando una punta de pipeta de 1 ml (corte el extremo de la punta para aumentar el tamaño del orificio), transfiera 1 ml de la suspensión celular a tubos de microcentrífuga de 2 ml.
      NOTA: Si las células están congeladas, descongele rápidamente el tubo de 50 ml que contiene el pellet en agua tibia antes de la lisis celular. Transfiera el tubo al hielo húmedo tan pronto como el pellet haya comenzado a descongelarse y enfríe durante 10 minutos.
    2. Coloque cada tubo de microcentrífuga en un vaso de precipitados de agua helada, utilizando un estante de tubo de plástico para sujetar el tubo para la sonicación.
      NOTA: Debido a la sensibilidad del extracto celular al sobrecalentamiento, es fundamental asegurarse de que los tubos no se calienten para evitar la precipitación de proteínas y la reducción de la actividad enzimática.
    3. Utilice una sonda sonicadora con una punta de 3 mm de diámetro y límpiela con etanol al 70% (v/v) y agua de doble destilación (ddH2O). Baje la punta del sonicador en la suspensión celular hasta que esté ~ 1 cm por debajo de la superficie líquida.
    4. Introduzca los siguientes ajustes en el sonicador: frecuencia de 20 kHz, amplitud del 65%, tiempo de encendido del pulso de 10 s, tiempo de apagado de los pulsos de 10 s, tiempo de sonicación total de 1 minuto.
    5. Ejecute el protocolo de sonicación. Mueva el tubo hacia arriba / abajo y hacia los lados durante los dos primeros ciclos de reposo para asegurarse de que las células estén sonicadas uniformemente. Registre la entrada de energía.
      NOTA: Por seguridad, use protección auditiva adecuada durante la sonicación. La viscosidad disminuirá a medida que se interrumpan las células, y el pellet de células húmedas de crema pálida debe convertirse en un fluido marrón homogéneo. La entrada de energía recomendada es de 240 J por ml de células húmedas. Si las células están solo parcialmente lisadas, la suspensión seguirá apareciendo de color crema con grupos viscosos de células, particularmente en los lados del tubo.
    6. Invierta el tubo 2-3 veces y repita la sonicación durante uno o dos ciclos adicionales de 10 s, mezclando con frecuencia hasta que las células se interrumpan por completo.
  2. Lisis celular sonicando una suspensión celular de 5 ml
    1. Si las células están congeladas, descongele rápidamente el tubo de 50 ml que contiene el pellet en agua tibia con agitación antes de la lisis celular. Transfiera el tubo al hielo húmedo tan pronto como el pellet haya comenzado a descongelarse y enfríe durante 10 minutos.
    2. Gire brevemente el tubo a 500 x g para sedimentar las células.
    3. Coloque el tubo de 50 ml en un vaso de agua helada para la sonicación.
      NOTA: Debido a la sensibilidad del extracto celular al sobrecalentamiento, es fundamental asegurarse de que los tubos no se calienten para evitar la precipitación de proteínas y la reducción de la actividad enzimática.
    4. Utilice una sonda sonicadora con una punta de 6 mm de diámetro y límpiela con etanol al 70% (v/v) y ddH2O (consulte el esquema visual de la sonda de 6 mm en la Figura 1). Baje la punta del sonicador en la suspensión celular (~ 5 ml) hasta que esté ~ 1 cm por debajo de la superficie líquida.
    5. Introduzca los siguientes ajustes en el sonicador: frecuencia de 20 kHz, amplitud del 65%, tiempo de encendido del pulso de 10 s, tiempo de apagado de los pulsos de 10 s, tiempo de sonicación total de 1 minuto por ml de celdas húmedas (5 minutos en total).
    6. Ejecute el protocolo de sonicación. Mueva el tubo hacia arriba / abajo y hacia los lados durante los dos primeros ciclos de reposo para asegurarse de que las células estén sonicadas uniformemente.
      NOTA: Por seguridad, use protección auditiva adecuada durante la sonicación. La viscosidad disminuirá a medida que las células se interrumpan, y el pellet de células húmedas de crema pálida debe convertirse en un fluido marrón homogéneo. Registre la entrada de energía. Se recomienda una entrada de energía óptima de 240 J por ml de células húmedas (~ 1200 J en total a partir de 5 minutos de sonicación).
    7. Si algunas células permanecen intactas, siga las instrucciones del paso 3.1.5.
    8. Transfiera los extractos celulares a tubos de microcentrífuga de 2 ml.

4. Clarificación del extracto celular y reacción de escorrentía

  1. Centrifugar las células lisadas a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C para eliminar los restos celulares. Transfiera el sobrenadante a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml como alícuotas de 1 ml.
  2. Realizar la reacción de escorrentía para los extractos celulares. Incubar los tubos de 1,5 ml que contienen los extractos celulares a 30 °C durante 60 min en un bloque de calor o incubadora sin agitar.
  3. Centrifugar los extractos celulares a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C. Agrupe los sobrenadantes en un tubo de centrífuga de 15 ml. Mezcle el sobrenadante invirtiendo el tubo cinco veces hasta que sea homogéneo, luego manténgalo en hielo. Invierta suavemente para evitar la formación de burbujas de aire.
  4. Diluya 10 μL del extracto celular 100 veces con tampón S30B y mida la concentración total de proteína utilizando un ensayo de Bradford con tres repeticiones técnicas (consulte material suplementario S2 para la guía del ensayo de Bradford).
  5. Si la concentración de proteína es de 20-25 mg/ml, transfiera los extractos celulares como alícuotas de 100 μL a nuevos tubos de 1,5 ml, congele en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C.
    NOTA: Por seguridad, use el EPP apropiado cuando manipule nitrógeno líquido, incluidos protectores faciales y guantes.
  6. Si la concentración de proteína es de <20 mg/ml, repita los pasos de preparación del extracto crudo para garantizar que el extracto celular de alta calidad y los rendimientos tx-TL sean comparables al trabajo publicado anteriormente5.

5. Preparación de la plantilla de ADN plásmido

  1. Purificar el plásmido pTU1-A-SP44-mScarlet-I (origen pUC19) de una cepa de plásmido de E. coli recién transformada (DH10β, JM109) cultivada en 50 mL de cultivo LB (con 100 mg/mL de carbenicilina) utilizando un kit de purificación de ADN de plásmido apropiado según las instrucciones del fabricante.
  2. Eluya el plásmido en 2 x 300 μL de agua libre de nucleasa y combine las fracciones.
  3. Añadir 0,1 volúmenes (66 μL) de acetato de sodio 3 M (pH 5,2).
  4. Añadir 0,7 volúmenes (462 μL) de isopropanol.
  5. Incubar el ADN a -20 °C durante 30 min.
  6. Centrifugar a 16.000 × g durante 30 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
  7. Agregue 2 ml de etanol al 70% (v / v) al pellet de ADN.
  8. Invierta el tubo 3-4 veces para resuspendir el gránulo de ADN plásmido.
  9. Centrifugar a 16.000 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
  10. Repita los pasos 5.7-5.9 y retire todo el líquido visible.
  11. Seque al aire el pellet de ADN durante 10-30 minutos o séquelo durante 5 minutos con una centrífuga al vacío.
  12. Resuspend el pellet seco con 600 μL de ddH2O libre de nucleasas.
  13. Mida la concentración y pureza del ADN utilizando un espectrofotómetro.
  14. Preparar alícuotas de 50-100 μL y conservar a -20 °C.
    NOTA: Se recomienda una alta concentración de ADN en el rango de 500-1000 ng / μL debido a las estrechas restricciones de volumen de las reacciones libres de células. Diluir el stock de ADN plásmido a 80 nM; El plásmido pTU1-A-SP44-mScarlet-I de 168 ng/μL equivale a 80 nM.

6. Preparación de la solución Streptomyces Master Mix (SMM)

  1. Solución de aminoácidos
    1. Utilice el kit de muestreo de aminoácidos para evitar errores manuales y reducir el tiempo de preparación, siguiendo las instrucciones del fabricante proporcionadas en línea.
    2. Diluya la solución madre de aminoácidos 20x usando ddH2O a una concentración final de 6 mM (5 mM L-Leu).
    3. Diluir aún más a 2,4 mM (2 mM L-Leu) dentro de la solución 2,4x SMM (ver Tabla 3).
      NOTA: La concentración final en la reacción TX-TL es de 1 mM 19x aminoácidos y 0.83 mM L-Leu.
  2. Solución energética y aditivos
    1. Prepare los demás componentes de la solución SMM 2.4x siguiendo la receta descrita en la Tabla 3.
    2. Alternativamente, prepare una solución de energía mínima (MES) 2.4x, siguiendo la receta descrita en la Tabla 3.

7. Configuración de una reacción estándar S. venezuelae TX-TL

  1. Descongele el extracto celular, la solución SMM (o MES) y el ADN plásmido en hielo. Pre-enfriar una placa de 384 pocillos a -20 °C.
  2. Establecer reacciones TX-TL donde el 25% del volumen es ADN plásmido, el 33.33% es extracto celular y el 41.67% es solución SMM ; manténgalos en hielo para evitar el sesgo de la hora de inicio.
    NOTA: Se ha proporcionado una plantilla TX-TL estándar (Tabla 4) para calcular el volumen de reactivos necesarios en función del número de reacciones. El volumen estándar para una reacción de 33 μL es el siguiente: 11 μL de extracto celular, 13,75 μL de SMM y 8,25 μL de ADN plásmido.
  3. Vórtice suavemente la mezcla durante ~ 5 s a una configuración de baja velocidad para garantizar que la solución sea homogénea. Evite la formación de espuma/burbujas.
  4. Transfiera alícuotas de 10 μL a tres pocillos de una placa de 384 pocillos como triplicado técnico sin introducir burbujas de aire. Selle la placa con una cubierta transparente y gire a 400 × g durante 5 s.
  5. Incubar la reacción a 28 °C, ya sea en una incubadora (para lecturas de punto final) o en un lector de placas sin agitar.
    NOTA: Las reacciones generalmente requieren de 3 a 4 h para completarse. Consulte Material suplementario S2 para obtener orientación sobre un lector de placas y las mediciones estándar de mScarlet-I.

Resultados

Este protocolo detallado se proporciona como ejemplo para ayudar al usuario a establecer un sistema Streptomyces TX-TL basado en la cepa modelo S. venezuelae ATCC 10712 (Figura 1). El usuario puede tratar de estudiar otras cepas de Streptomyces; sin embargo, las etapas de crecimiento / cosecha de otras cepas con tiempos de duplicación más largos o preferencias de crecimiento distintas deberán optimizarse a medida para lograr resultados máximos. Para el resultad...

Discusión

En este manuscrito, se ha descrito un protocolo S. venezuelae TX-TL de alto rendimiento con pasos detallados que son fáciles de llevar a cabo tanto para usuarios experimentados como nuevos de sistemas TX-TL. Se han eliminado varias características de los protocolos streptomyces45 y E. coli TX-TL41 existentes para establecer un protocolo mínimo, pero de alto rendimiento para S. venezuelae TX-TL5,26.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer el siguiente apoyo a la investigación: EPSRC [EP/K038648/1] para SJM como PDRA con PSF; Wellcome Trust patrocinó la beca ISSF para SJM con PSF en el Imperial College de Londres; Beca de investigación de la Royal Society [RGS\R1\191186]; Premio Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] para SJM en la Universidad de Kent; y la beca de doctorado del Fondo de Investigación de Desafíos Globales (GCRF) para KC en la Universidad de Kent.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2.5 L UltraYield FlaskThomson931136-B
3-PGA (>93%)SigmaP8877
384 Well Black/Clear Bottom PlateThermoFisher10692202
Ammonium chloride (98%)Fluorochem44722
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%)ThermoFisherR0481
Carbenicillin (contact supplier for purity)MelfordC46000-25.0
D-(+)-glucose (contact supplier for purity)MelfordG32040
DFHBI (≥98% - HPLC)SigmaSML1627
DTT (contact supplier for purity)MelfordMB1015
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity)Santa Cruz Biotechsc-363644
Glucose-6-phosphate (>98%)SigmaG7879
HEPES Free Acid (contact supplier for purity)MelfordB2001
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%)Sigma49605
Magnesium chloride (98%)Fluorochem494356
Malt extractSigma70167-500G
PEG-6000Sigma807491
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCOThermoFisher88260
Poly(vinyl sulfate) potassium saltSigma271969
Potassium glutamate (>99%)SigmaG1149
RTS amino acid sampler5 Prime2401530
Sodium chloride (99%)Fluorochem94554
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g)Sigma505471
Yeast ExtractMelfordY1333
Equipment
PlatereaderBMGOmega

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