Determinación del gasto de energía basal y la capacidad de los adipocitos termogénicos para gastar energía en ratones obesos

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo para medir la tasa metabólica basal y la capacidad oxidativa de los adipocitos termogénicos en ratones obesos.

Resumen

Las mediciones del gasto de energía son necesarias para comprender cómo los cambios en el metabolismo pueden conducir a la obesidad. El gasto de energía basal se puede determinar en ratones midiendo el consumo de oxígeno de todo el cuerpo, la producción de _CO2 y la actividad física utilizando jaulas metabólicas. Los adipocitos termogénicos de color marrón/beige (BA) contribuyen significativamente al gasto energético de los roedores, particularmente a bajas temperaturas ambientales. Aquí, las mediciones del gasto de energía basal y la capacidad total de BA para gastar energía en ratones obesos se describen en dos protocolos detallados: el primero explica cómo configurar el ensayo para medir el gasto de energía basal utilizando el análisis de covarianza (ANCOVA), un análisis necesario dado que el gasto de energía covaria con la masa corporal. El segundo protocolo describe cómo medir la capacidad de gasto de energía de BA in vivo en ratones. Este procedimiento implica anestesia, necesaria para limitar el gasto causado por la actividad física, seguido de la inyección del agonista beta3-adrenérgico, CL-316,243, que activa el gasto de energía en BA. Estos dos protocolos y sus limitaciones se describen con suficiente detalle para permitir un primer experimento exitoso.

Introducción

El metabolismo se puede definir como la integración de las reacciones bioquímicas responsables de la absorción, almacenamiento, transformación y descomposición de nutrientes que las células utilizan para crecer y realizar sus funciones. Las reacciones metabólicas transforman la energía contenida en los nutrientes en una forma que puede ser utilizada por las células para sintetizar nuevas moléculas y ejecutar el trabajo. Estas reacciones bioquímicas son inherentemente ineficientes para transformar esta energía en una forma utilizable para sostener la ^vida1. Tal ineficiencia resulta en la disipación de energía en forma de calor, y esta producción de calor se utiliza para cuantificar la tasa metabólica estándar (SMR) de un ^organismo1. La condición estándar se definió clásicamente como la producción de calor que ocurre en un adulto despierto pero en reposo, que no ingiere ni digiere alimentos, en termoneutralidad y sin ningún tipo de ^estrés1. La tasa metabólica basal (TMB) o el gasto de energía basal en ratones se conoce como SMR, pero en individuos que ingieren y digieren alimentos bajo estrés térmico leve (temperatura ambiente 21-22 ° C)¹. Los desafíos y dificultades de medir directamente la producción de calor hicieron que la calorimetría indirecta, es decir, el cálculo de la producción de calor a partir de las mediciones de consumo de oxígeno, se convirtiera en el enfoque más popular para determinar la TMB. Calcular la TMB a partir del consumo de oxígeno es posible porque la oxidación de nutrientes por parte de las mitocondrias para sintetizar ATP es responsable del 72% del oxígeno total consumido en un organismo, con un 8% del consumo total de oxígeno que también ocurre en las mitocondrias pero sin generar ATP (respiración desacoplada)¹. La mayoría del 20% restante del oxígeno consumido se puede atribuir a la oxidación de nutrientes en otras ubicaciones subcelulares (oxidación de ácidos grasos peroxisomales), procesos anabólicos y formación de especies reactivas de ^oxígeno1. Así, en 1907, Lusk estableció una ecuación, basada en mediciones empíricas, ampliamente utilizada para transformar el consumo de oxígeno y la producción de _CO2 en disipación de energía en forma de calor. En los seres humanos, el cerebro representa ~ 25% de la TMB, el sistema musculoesquelético para ~ 18.4%, el hígado para ~ 20%, el corazón para ~ 10% y el tejido adiposo para ~ 3-7%². En ratones, la contribución del tejido a la TMB es ligeramente diferente, con el cerebro representando ~ 6.5%, el músculo esquelético ~ 13%, el hígado ~ 52%, el corazón ~ 3.7% y el tejido adiposo ~ 5%³.

Sorprendentemente, las reacciones bioquímicas que definen la TMB no son fijas y cambian en respuesta a diferentes necesidades, como el trabajo externo (actividad física), el desarrollo (crecimiento de tejidos), las tensiones internas (contrarrestar infecciones, lesiones, renovación de tejidos) y los cambios en la temperatura ambiente (defensa contra el frío)¹. Algunos organismos reclutan activamente procesos para generar calor en la exposición al frío, lo que implica que el calor producido por el metabolismo no es solo un subproducto accidental. En cambio, la evolución seleccionó mecanismos reguladores que podrían regular específicamente la producción de calor al cambiar la tasa de reacciones ^{metabólicas1}. Por lo tanto, estas mismas mediciones de consumo de oxígeno se pueden utilizar para determinar la capacidad de un organismo para generar calor en respuesta al frío.

Dos procesos principales contribuyen a la generación de calor tras la exposición al frío. El primero es el escalofrío, que genera calor al aumentar la fosforilación oxidativa mitocondrial y la glucólisis en el músculo para cubrir el trabajo físico realizado por la contracción muscular involuntaria. Por lo tanto, la exposición al frío aumentará el consumo de oxígeno en los ^músculos1. El segundo es la termogénesis no temblorosa, que se produce a través de un aumento en el consumo de oxígeno en los adipocitos marrón y beige (BA). La disipación de energía en calor en BA está mediada por la proteína de desacoplamiento mitocondrial 1 (UCP1), que permite la reentrada de protones en la matriz mitocondrial, disminuyendo el gradiente de protones mitocondriales. La disipación del gradiente de protones mitocondrial por UCP1 aumenta la producción de calor por la elevación en la transferencia de electrones y el consumo de oxígeno y la energía liberada por disipación de protones per se sin generar ATP (desacoplado). Además, el BA termogénico puede reclutar mecanismos adicionales que elevan el consumo de oxígeno sin causar una gran disipación en el gradiente de protones, activando ciclos inútiles de síntesis y consumo de ATP oxidativo. Las jaulas metabólicas descritas aquí, a saber, el sistema CLAMS-Oxymax de Columbus Instruments, ofrecen la posibilidad de medir el gasto de energía a diferentes temperaturas ambientales. Sin embargo, para determinar la capacidad termogénica de BA utilizando mediciones de consumo de oxígeno de todo el cuerpo, se necesita: (1) eliminar la contribución de los escalofríos y otros procesos metabólicos no BA al gasto de energía, y (2) activar específicamente la actividad termogénica de BA in vivo. Por lo tanto, un segundo protocolo describe cómo activar selectivamente ba in vivo utilizando farmacología en ratones anestesiados a termoneutralidad (30 ° C), con anestesia y termoneutralidad limitando otros procesos termogénicos no BA (es decir, actividad física). La estrategia farmacológica para activar el BA es tratar ratones con el agonista del receptor β3-adrenérgico CL-316,246. La razón es que la exposición al frío promueve una respuesta simpática liberando norepinefrina para activar los receptores β-adrenérgicos en BA, que activa la UCP1 y la oxidación de grasas. Además, la expresión del receptor β3-adrenérgico está altamente enriquecida en el tejido adiposo en ratones.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA). A los ratones se les administró su dieta y agua ad libitum en la jaula metabólica, alojada en un ambiente de temperatura controlada (~ 21-22 o 30 ° C) con un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas. Para este estudio se utilizaron ratones hembra de 8 semanas de edad alimentados con una dieta alta en grasas o dieta chow durante 8 semanas.

1. Medición de la tasa metabólica basal (TMB)

1. Mida el peso corporal total del ratón utilizando una báscula de peso con una precisión en el rango de 0,1 g.
   NOTA: Esto debe hacerse antes de alojar a los ratones en jaulas metabólicas y después de los 2-3 días del período de aclimatación a las jaulas metabólicas.
2. Mida la composición corporal, incluida la grasa y la masa magra en ratones no anestesiados, utilizando un sistema de análisis de composición corporal apropiado (ver Tabla de materiales).
   NOTA: Estas mediciones son necesarias para determinar el gasto de energía y se ejecutan en paralelo a las mediciones del peso corporal total (paso 1.1).
3. Configure las jaulas metabólicas y comience el período de aclimatación.
   NOTA: El sistema de jaulas metabólicas incluye un recinto que permite al usuario controlar la temperatura y la luz de la carcasa de 12 jaulas (Figura 1A, B). Cada jaula tiene una botella de agua, un comedero y una rejilla (Figura 1C). La rejilla separa el ratón de la parte inferior de la jaula, lo que permite la recolección de heces. Una vez que la jaula está instalada en cada espacio predeterminado, una tapa que sella la jaula incluye la ranura de la botella de agua, el tubo de muestreo de aire, el sistema de flujo de aire y el sensor de actividad física (Figura 1D).
   1. Encienda la carcasa de temperatura, el sistema de flujo de aire y la computadora 2 h antes de comenzar el ensayo.
   2. Después de 2 h, abra el software que controla la carcasa (consulte la Tabla de materiales) y el flujo de aire y deje que el software pruebe la comunicación de la computadora con el equipo.
      NOTA: Para el presente trabajo se utilizó el software Oxymax.
   3. Una vez establecida la comunicación, haga clic en Archivo, luego en Abrir configuración del experimento (Figura 2A) y seleccione la configuración del experimento prediseñada por el proveedor (o configurada a partir de un ensayo anterior).
   4. Haga clic en Experimento, luego haga clic en Propiedades, que abrirá la ventana Propiedades del experimento (Figura 2B).
   5. En la ventana Propiedades, configure los parámetros del recinto ambiental, incluidos los ciclos de temperatura ambiente (21 °C) y 12 h.
      NOTA: Mantener el software abierto y en funcionamiento permite que el aire fluya hacia las jaulas y el recinto para mantener la temperatura y los ciclos de luz seleccionados. Por lo tanto, todo el sistema puede funcionar con ratones dentro de las jaulas durante varios días, incluso sin medir oxígeno y _CO2.
   6. Haga clic en Experimento, luego haga clic en Configuración y se abrirá la ventana Configuración del experimento , donde se definen los parámetros de cada jaula metabólica.
   7. Asigne cada ID de ratón a la jaula individual donde se aloja el ratón (Figura 2C).
   8. Incluya la masa magra o el peso corporal total de cada ratón solo si no se observan diferencias en el peso corporal entre los grupos.
      NOTA: La obtención de valores brutos de consumo de oxígeno y gasto energético facilita los análisis de ANCOVA.
   9. Ajuste la tasa de flujo de aire a la jaula metabólica en 0.5-0.6 L / min.
   10. En la ventana Configuración del experimento, seleccione la ruta de acceso y el nombre de guardado del archivo. Seleccione el directorio de copia de seguridad (Figura 2D).
   11. Agregue una cantidad preponderada de alimentos a los comederos que cubra al menos la ingesta de alimentos durante 1 día.
       NOTA: Si las jaulas tienen escamas integradas, la comida se puede agregar directamente y el software la registrará.
   12. Añadir las botellas de agua. Compruebe que el frasco esté sellado correctamente y no tenga fugas.
   13. 24 h después de agregar la comida, pesar la comida que queda en la jaula.
       NOTA: Los gramos de comida agregada menos los gramos de comida restantes medirán la ingesta de alimentos.
   14. Comience las mediciones de oxígeno, _CO2 y actividad (paso 1.4.10) una vez que los valores de ingesta de alimentos sean los mismos que los de los ratones alojados en jaulas regulares.
       NOTA: Aquí, se completa el período de aclimatación (generalmente 2-3 días) y pueden comenzar las mediciones de gasto de energía.
4. Calorimetría indirecta y mediciones de actividad para evaluar el gasto energético
   1. Mida el peso corporal, la grasa y la masa magra de todos los ratones antes de comenzar las mediciones.
      NOTA: Estos son los valores de peso corporal y masa magra utilizados para realizar los análisis de ANCOVA.
   2. Calibrar el detector basado en zirconia de _O2 y _CO2 del sistema CLAMS (ver Tabla de Materiales) con la concentración de oxígeno recomendada; siempre vuelva a calibrar el detector antes de comenzar un nuevo experimento.
   3. Utilizar un gas de calibración de composición conocida (20,50% de oxígeno y 0,50% de _CO2).
      NOTA: Los proveedores de gas a menudo se refieren a este gas como "Grado estándar primario".
   4. Encienda y asegúrese de que la presión de salida del tanque sea de 5-10 psi.
   5. Abra el software de la Utilidad de calibración para calibrar y probar los sensores de gas (Figura 2E). Haga clic en Experimentar y, a continuación, en Calibrar.
   6. Pulse Inicio. Luego, espere a que se prueben los sensores y a que el software le pida al usuario que gire las perillas del sensor de gas (Figura 2F) hasta que el valor de la identidad de _O2 sea 1 (Figura 2G-H). Haga clic en Siguiente cuando se complete el paso.
      NOTA: Si la Utilidad de calibración realiza todos los pasos actuales, la calibración pasará automáticamente al siguiente paso cuando se llene la barra de progreso.
   7. Verifique los resultados de la calibración cuando se hayan completado todos los pasos y se presenten los resultados.
   8. Apague el gas de calibración.
   9. Cambie los alimentos y agregue suficiente comida durante un período de 48-72 h.
      NOTA: Aunque las jaulas podrían abrirse durante las mediciones de gasto de energía para controlar el peso corporal y cambiar los alimentos diariamente, los ratones pueden estresarse por estas manipulaciones, y las mediciones se pierden cuando se abren las jaulas. Por lo tanto, se recomienda evitar cualquier manipulación durante el período de medición.
   10. En el software, haga clic en Experimento y luego en Ejecutar para iniciar las mediciones de oxígeno_{, CO2} y actividad (Figura 3A).
       NOTA: La ejecución de las mediciones se puede rastrear en tiempo real en un cuadro ubicado en la sección inferior izquierda del software (rectángulo rojo, Figura 3B). El rectángulo rojo de la Figura 3B muestra que el sistema mide la jaula #1 en el intervalo #3, es decir, la 3ª medición. Una medición en una jaula puede tomar aproximadamente 1 minuto. Así, con 12 jaulas conectadas, el consumo de oxígeno se puede medir aproximadamente cada 12 min. Se recomiendan mediciones continuas durante un mínimo de 48 h.
   11. Detenga el experimento haciendo clic en Experimento y, a continuación, en Detener (Figura 3C).
   12. Abra las jaulas, pese a los ratones y la comida. Recolecte las heces para calcular el número de calorías y lípidos excretados durante el período de medición de 48-72 h.
       NOTA: Las heces se pueden almacenar a -20 °C para análisis posteriores. Estas jaulas no se pueden usar de manera efectiva para recolectar orina.
   13. Haga clic en Experimentos, luego en Exportar y Exportar todos los temas como un archivo CSV (Figura 3D).
       NOTA: Para facilitar los análisis de ANCOVA, es esencial exportar los valores de consumo de oxígeno bruto (_VO2) _{y producción} de _{CO2 (VCO2}) sin ser normalizados por el peso corporal.
5. Análisis de datos y control de calidad
   1. En la hoja CSV exportada (Figura 3D) (del paso 1.4.13), utilice los valores brutos del consumo de oxígeno (_VO2) y la producción de _CO2 (VCO2) medidos cada 12 minutos en el período de 2-3 días que el software enumera automáticamente e incluya una marca de tiempo, es decir, la hora y la fecha en que se midieron.
      NOTA: Los valores de _VO2 y _VCO2 se corregirán automáticamente si se agregan valores de peso corporal o masa magra.
   2. En la hoja CSV exportada, utilice los valores brutos de la relación de intercambio respiratorio (RER: _VCO2/_VO2) que el software calcula y enumera automáticamente de acuerdo con su marca de tiempo.
      NOTA: Los valores cercanos a 1 muestran que el ratón oxida principalmente los carbohidratos, mientras que los valores más cercanos a 0,7 representan que el ratón está oxidando principalmente la grasa. EL RER por encima de 1 puede ocurrir durante el ejercicio anaeróbico, ya que el cuerpo expulsa más _CO2 para compensar la acidosis causada por el lactato. RER superior a 1 puede indicar estrés. El archivo CSV exportado también contiene los valores brutos del gasto de energía (EE) o la producción de calor en calorías por minuto por ratón, medidos cada 12 minutos en los 2-3 días. Aquí, todos los valores enumerados incluyen una marca de tiempo.
   3. Como se necesitan valores únicos de EE por ratón para un ANCOVA, promedie los valores de EE registrados entre las 09:00-16:00 para la fase de luz (día) y las 19:00-04:00 para la fase oscura (nocturna) por ratón y día.
      NOTA: Esto se puede hacer manualmente usando Excel o Graph Pad. La selección de estas ventanas de dos tiempos evita promediar los valores de EE intermedios, graduales e inestables asociados con la transición de fase claro-oscuro.
   4. Durante un período de 48 horas, calcule el promedio de los dos valores de luz diurna y los dos valores de fase oscura por mouse usando Excel o Graph Pad.
   5. Para cuantificar la actividad física total, use Excel o Graph Pad para sumar los recuentos de rotura de haz x, y y z medidos en las jaulas metabólicas y enumerados en el archivo CSV para cada mouse.
      NOTA: La actividad total x, y, z se calcula haciendo primero el valor promedio de cada X, Y, Z por mouse y ciclo. Luego, se determina la suma de cada valor promedio X, Y, Z por ratón y ciclo para trazar los datos como en la Figura 5E (siendo el promedio de 2 días).
   6. Alternativamente, represente los datos que muestran cada valor de medición a lo largo del tiempo, lo que genera curvas que ilustran los cambios en EE durante la transición de los ciclos de luz a oscuridad.
      NOTA: Consulte la sección de discusión sobre cómo y cuándo realizar los análisis de ANCOVA, y las diferentes fórmulas utilizadas para calcular el _VO2, _VCO2 y EE se proporcionan en el Archivo Complementario 1.

2. Medición de la capacidad de los adipocitos termogénicos para gastar energía

1. Configure las mediciones y los tratamientos con ratones. Consulte el paso 1 para obtener detalles sobre las preparaciones experimentales para controlar el consumo de oxígeno, ya que la capacidad termogénica en los adipocitos se determina indirectamente por el consumo de oxígeno siguiendo los pasos 2.1.1-2.2.2.
   NOTA: Este protocolo requiere anestesia en ratones y tratamiento agudo con el agonista del receptor beta-3 CL-316,243 (ver Tabla de Materiales), dando una evaluación rápida de la capacidad termogénica ba.
   1. Realizar análisis de composición corporal y pesar los ratones. Encienda las ALMEJAS, configure la temperatura a 30 °C (termoneutralidad) y espere 2 h a que todo el sistema se caliente.
   2. Configure el resto de las condiciones del ensayo, incluida la luz, asigne id de ratón a cada jaula y agregue el valor de peso corporal de cada ratón en la jaula correspondiente si no se observa ninguna diferencia en el peso corporal entre los grupos.
   3. Calibre el detector de oxígeno/_CO2 como en los pasos 1.4.2-1.4.7.
   4. Inicie el experimento en el software.
   5. Inyecte a cada ratón pentobarbital (60-120 mg/kg) y coloque a cada ratón en su jaula metabólica asignada (paso 2.1.2).
      NOTA: La dosis de pentobarbital requerida para mantener a los ratones dormidos a la termoneutralidad (30 °C) varía con la cepa y el genotipo del ratón. Se recomienda probar diferentes dosis de pentobarbital de 50 a 120 mg/kg y elegir la que mantenga al ratón anestesiado durante 2-3 h a 30 °C. La anestesia eficiente es esencial para eliminar la contribución de la actividad física al gasto energético.
   6. Para asegurar la anestesia, observe a los ratones después de la inyección de pentobarbital hasta que estén completamente dormidos y sus tasas de consumo de oxígeno disminuidas se vuelvan constantes.
   7. Espere a obtener al menos 3 tasas de consumo de oxígeno consecutivas estables antes de inyectar CL-316,243.
      NOTA: Mientras espera la estabilización del consumo de oxígeno, prepare las jeringas con CL-316,243 para cada ratón (1 mg/kg).
   8. Abra la jaula # 1 e inyecte CL-316,243 por vía subcutánea inmediatamente después de que se produjo una medición _{de VO2 y VCO2} en la jaula # 1. Devuelva el ratón a la jaula #1 inmediatamente después de la inyección.
      NOTA: Las mediciones se indican en tiempo real en la sección inferior izquierda del software (Figura 3B, rectángulo rojo).
   9. Espere a que se mida la jaula # 2 (Figura 3B, rectángulo rojo) y luego continúe como en el paso 2.1.8 para la jaula # 2.
      NOTA: La inyección de CL-316,243 inmediatamente después de una medición permite mantener el tiempo constante entre inyecciones. Por ejemplo, si hay 12 ratones / jaulas en funcionamiento, con mediciones recopiladas en jaulas individuales secuencialmente y la colección que dura 55 s por jaula, entonces debe inyectar un ratón cada minuto. Con estas tasas de inyección, la primera medición ocurrirá después de 12 minutos después de la inyección en las 12 jaulas.
   10. Continúe las mediciones de gasto de energía hasta que los valores de gasto de energía se estabilicen durante 5-6 mediciones consecutivas, generalmente 90-180 minutos después de la inyección.
       NOTA: Los ratones podrían despertarse de la anestesia durante los experimentos. Estos ratones deben ser retirados del análisis. Por lo tanto, probar las dosis de pentobarbital de antemano aumentará la eficiencia de los estudios.
   11. Detenga las mediciones de gasto de energía, pero mantenga a los ratones en sus jaulas a 30 ° C, hasta que se despierten.
   12. Después de que los ratones estén completamente despiertos, inspeccione la salud de los ratones y devuélvalos a sus jaulas iniciales.
   13. Exporte los datos de cada ratón como un archivo CSV utilizando el software del equipo, tal como se describe en la sección 1.4.13.
2. Análisis de datos
   NOTA: El análisis de los datos fue realizado por Excel o Graphpad
   1. Trazar los 3-5 valores consecutivos de _VO2, _VCO2 y EE que son estables y constantes en el tiempo, ya que estos son los valores que representan la tasa metabólica cuando los ratones están completamente anestesiados.
   2. A continuación, trace la primera y las siguientes mediciones consecutivas de _VO2, _VCO2 y EE obtenidas después de la inyección.
      NOTA: Los valores absolutos de EE y el aumento de pliegue en EE inducido por inyección indican la función termogénica ^ba7.

Resultados

La Figura 4 _{muestra los valores} de ACTIVIDAD física _{VO2, VCO2}, Producción de calor/Gasto de energía (EE), Relación de Intercambio Respiratorio (RER) y X, Y, Z obtenidos utilizando las jaulas metabólicas del sistema CLAMS. El _VO2 y _VCO2 proporcionados por el sistema CLAMS es el volumen de gas (ml) por minuto y ya se puede dividir por el peso corporal o los valores de masa magra ingresando estos valores de peso en el software CLAMS antes de come...

Discusión

La calorimetría indirecta se ha utilizado durante años para evaluar el gasto energético de todo el ^cuerpo4. Este protocolo descrito aquí proporciona un método sencillo para medir la tasa metabólica basal y determinar la capacidad termogénica de BA in vivo utilizando jaulas metabólicas.

El método de calorimetría indirecta descrito aquí confirma que dividir los valores de gasto de energía por los valores de peso corporal puede ser engañoso. Por ejemp...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CLAMS-Oxymax System	Columbus Instruments	CLAMS-center feeder-ENC	Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software	HP/Columbus	N/A	PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator)	Fisher Scientific	23-116681	Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition	Echo-MRI	Echo-MRI 100	Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243	Sigma	C5976	Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet	Research Diets	D12266B	Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal	Pharmacy at DLAM	N/A	Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator)	Praxair	NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590	20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration