肥満マウスのエネルギーを消費する熱原性アディポサイトの基礎エネルギー支出と能力の決定

要約

本稿は、肥満マウスにおける熱原性アディポサイトの基礎代謝率および酸化容量を測定するためのプロトコルを記述する。

要約

エネルギー支出の測定は、代謝の変化が肥満につながる方法を理解するために必要です。マウスの基礎エネルギー消費量は、代謝ケージを使用して全身酸素消費量、_CO2 産生、身体活動を測定することによって決定することができます。熱原性ブラウン/ベージュのアディポサイト(BA)は、特に低い周囲温度で、げっ歯類のエネルギー支出に大きく貢献しています。ここでは、肥満マウスのエネルギーを消費する基礎エネルギー支出と総BA容量の測定は、2つの詳細なプロトコルに記載されています:エネルギー支出が体重によって共変することを考えると、必要な分析である共分散(ANCOVA)の分析を用いて基礎エネルギー支出を測定するためのアッセイを設定する方法を最初に説明する。第2のプロトコルは、マウス における生体内における BAエネルギー支出能力を測定する方法を説明する。この手順は、身体活動によって引き起こされる支出を制限するために必要な麻酔を含み、続いてBAのエネルギー支出を活性化するβ3-アドレナリン作動薬CL-316,243の注入を伴う。これら 2 つのプロトコルとその制限事項は、最初の実験を成功させるために十分に詳細に説明されています。

概要

代謝は、細胞が成長し、その機能を実行するために使用する栄養素の取り込み、貯蔵、変換、および分解を担当する生化学的反応の統合として定義することができます。代謝反応は、栄養素に含まれるエネルギーを、細胞が新しい分子を合成して作業を実行するために使用できる形に変換します。これらの生化学的反応は、このエネルギーを生命を維持するために使用できる形に変換する上で本質的に非効率的^です1。このような非効率は熱の形でエネルギー消費をもたらし、この熱産生は生物の標準代謝率(SMR)を定量化するために使用^される。標準条件は、目を覚ますが、大人を休ませ、食品を摂取または消化せず、熱中性でストレスなしで、ストレスなしで起こる熱産生として古典的に定義された¹。マウスにおける基底代謝率(BMR)または基礎エネルギー支出はSMRと呼ばれるが、軽度の熱ストレス(周囲温度21〜22°C)¹の下で食物を摂取および消化する個体では。直接熱を測定する課題と困難は、間接的な熱量測定、すなわち酸素消費測定からの熱生産を計算し、BMRを決定するための最も一般的なアプローチとなる。酸素消費からBMRを計算することは、ATPを合成するためのミトコンドリアによる栄養素の酸化が生物で消費される全酸素の72%を占め、総酸素消費量の8%がミトコンドリアでも起こるがATP(結合されていない^呼吸)1を発生しないために可能である。消費される酸素の残りの20%の大部分は、他の細胞内の場所での栄養酸化(ペルキシソマル脂肪酸酸化)、同化プロセス、および活性酸素種形成¹に起因する可能性がある。そこで、1907年にLuskは、酸素消費量と_CO2 産生を熱としてエネルギー消費に変換するために広く使用される経験的測定に基づいて、方程式を確立しました。ヒトでは、脳がBMRの約25%を占め、筋骨格系は〜18.4%、肝臓は〜20%、心臓は約10%、脂肪組織は約3〜7%2を占^める。マウスでは、BMRに対する組織の寄与が若干異なり、脳が〜6.5%、骨格筋が13%、肝臓が52%、心臓が〜3.7%、脂肪組織が5%3を表^す。

驚くべきことに、BMRを定義する生化学反応は、外的な仕事(身体活動)、発達(組織成長)、内部ストレス(感染に対抗する、傷害、組織ターンオーバー)、および周囲温度の変化(コールドディフェンス)¹のような異なるニーズに応じて固定および変化しない。一部の生物は、冷たい暴露で熱を発生させるプロセスを積極的に募集し、代謝によって生成される熱は単なる偶発的な副産物ではないことを意味します。代わりに、進化は代謝反応の速度を変えることによって熱産生を特異的に高めることができる調節メカニズムを選択^した1。したがって、これらの同じ酸素消費量測定は、寒さに応答して熱を発生させる生物の容量を決定するために使用することができる。

2つの主要なプロセスは、低温暴露時の発熱に寄与する。最初のものは震え、これはミトコンドリア酸化リン酸化を増加させ、筋肉の解糖を増加させ、不随意の筋肉収縮によって行われた物理的な仕事をカバーすることによって熱を発生させる。したがって、冷たい暴露は筋肉の酸素消費量を増加^{させます1}。第二は、茶色とベージュの葉状の葉欠得細胞(BA)の酸素消費量の増加を通じて起こる非シブリング熱産生です。BAにおける熱へのエネルギーの放散は、ミトコンドリア非結合タンパク質1(UCP1)によって媒介され、ミトコンドリアマトリックスへのプロトン再突入を可能にし、ミトコンドリア陽子勾配を減少させる。UCP1によるミトコンドリア陽子勾配の放散は、電子移動と酸素消費量の上昇とATP(アンカチド)を発生させることなく陽子散逸 によって 放出されるエネルギーによって熱産生を増加させる。さらに、熱性BAは、無駄な酸化ATP合成および消費サイクルを活性化することによって、プロトン勾配で大きな散逸を引き起こすことなく酸素消費を高める追加のメカニズムを募集することができる。ここに記載されている代謝ケージ、すなわちコロンバス機器のCLAMS-Oxymaxシステムは、異なる周囲温度でエネルギー支出を測定する可能性を提供します。しかし、全身酸素消費測定を用いてBA熱原性能力を決定するには、(1)震えの寄与を排除し、他の非BA代謝プロセスをエネルギー支出に排除し、(2) 生体内でのBA熱新活性を特異的に活性化する必要がある。したがって、第2のプロトコルは、他の非BA熱原性プロセス(すなわち、身体活動)を制限する麻酔および熱中性を有する麻酔および熱中性を有する麻酔薬理学を使用して 、生体内で BAを選択的に活性化する方法を記述する。BAを活性化するための薬理学的戦略は、β3-アドレナリン受容体アゴニストCL-316,246でマウスを治療する。その理由は、冷たい暴露が、UCP1および脂肪酸化を活性化するBAでβアドレナリン受容体を活性化するノルエピネフリンを放出する交感神経応答を促進するからである。さらに、β3-アドレナリン受容体発現は、マウスの脂肪組織において高く富化される。

プロトコル

すべての実験は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)の制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。マウスは、代謝ケージ内で彼らの食事と水 の加性欲 を投与し、12hの光/暗いサイクルを有する温度制御された環境(〜21〜22または30°C)に収容した。8週齢の雌マウスは、8週間の高脂肪食またはチャウダイエットを与え、この研究に使用された。

1. 基礎代謝率(BMR)の測定

1. 0.1 gの範囲の精度で体重計を使用してマウスの総体重を測定します。
   注:これは、代謝ケージにマウスを収容する前に、代謝ケージへの順応期間の2〜3日後に行う必要があります。
2. 適切な体組成分析システムを使用して、非麻酔マウスの脂肪および無駄のない質量を含む体組成を測定する( 材料表を参照)。
   注:これらの測定は、エネルギー支出を決定するために必要であり、総体重測定と並行して実行されます(ステップ1.1)。
3. 代謝ケージを設定し、順応期間を開始します。
   メモ:代謝ケージシステムには、12ケージのハウジング温度と光を制御できるエンクロージャが含まれています(図1A、B)。各ケージには、水筒、フィーダー、グリッドがあります(図1C)。グリッドは、ケージの底からマウスを分離し、便の収集を可能にします。ケージが事前に決定された各スペースに取り付けられると、ケージを密封する蓋には、水筒スロット、チューブサンプリング空気、気流システム、および身体活動センサが含まれる(図1D)。
   1. 温度エンクロージャ、気流システム、コンピュータ2時間をオンにしてから、アッセイを開始します。
   2. 2時間後、エンクロージャを制御するソフトウェア( 材料表を参照)とエアフローを開き、ソフトウェアがコンピュータと機器との通信をテストします。
      注:Oxymaxソフトウェアは、現在の作業のために使用されました。
   3. 通信が確立されたら、[ファイル]、[実験構成を開く](図 2A)をクリックし、ベンダーが事前に設計した実験構成を選択します(または以前のアッセイから設定します)。
   4. [実験] をクリックし、[プロパティ] をクリックすると、[実験のプロパティ] ウィンドウが開きます (図 2B)。
   5. 「プロパティー」ウィンドウで、環境温度(21 °C)と 12 時間の光サイクルを含む環境エンクロージャのパラメータを設定します。
      メモ:ソフトウェアを開いて実行しておくと、ケージやエンクロージャに空気が流れ込み、選択した温度と光のサイクルを維持できます。したがって、システム全体は、酸素と_CO2を測定しなくても、数日間ケージ内のマウスで動作することができます。
   6. [実験] をクリックし、[設定] をクリックすると、[実験のセットアップ] ウィンドウが開き、各代謝ケージのパラメータが定義されます。
   7. 各マウス ID を、マウスが収容されている個々のケージに割り当てます(図 2C)。
   8. グループ間で体重の差が見られない場合にのみ、各マウスのリーン質量または総体重を含める。
      注: 酸素消費量とエネルギー消費の生の値を取得すると、ANCOVA分析が容易になります。
   9. エアーフローレートを代謝ケージに0.5~0.6 L/minに設定します。
   10. [実験のセットアップ] ウィンドウで、ファイルの保存パスと名前を選択します。バックアップ ディレクトリを選択します(図 2D)。
   11. 少なくとも1日間の食物摂取量をカバーするフィーダーに、あらかじめ加重量の食品を追加します。
       注:ケージにスケールが統合されている場合は、食品を直接追加することができ、ソフトウェアはそれを記録します。
   12. 水筒を追加します。ボトルが正しく密閉され、漏れていないことを確認してください。
   13. 食品を添加した後24時間、ケージに残っている食品を計量する。
       注:追加された食品のグラムから残された食品のグラムを差し引くと、食物摂取量が測定されます。
   14. 食物摂取量の値が通常のケージに収容されたマウスの値と同じになったら、酸素、_CO2、および活性測定(ステップ1.4.10)を開始します。
       注:順応期間(通常2-3日)が完了し、エネルギー支出の測定を開始することができます。
4. エネルギー消費を評価するための間接熱量測定と活動測定
   1. 測定を開始する前に、すべてのマウスの体重、脂肪、および無駄のない質量を測定します。
      注: これらは、ANCOVA 解析の実行に使用される体重と無駄のない質量値です。
   2. CLAMSシステムの_O2 および_CO2 ジルコニアベースの検出器( 材料表を参照)を推奨酸素濃度で較正します。新しい実験を開始する前に、検出器を常に再調整してください。
   3. 既知の組成物(20.50%酸素と0.50%_CO2)の校正ガスを使用してください。
      注:ガスサプライヤーは、多くの場合、このガスを「プライマリスタンダードグレード」と呼びます。
   4. 電源を入れ、タンク出力圧力が5-10 psiであることを確認します。
   5. ガスセンサーのキャリブレーションとテスト用のキャリブレーションユーティリティソフトウェアを開きます(図2E)。 [実験]をクリックし、[ キャリブレーション]をクリックします。
   6. [スタート] ボタンを押します。次に、センサーがテストされるのを待ち、ソフトウェアがユーザーにガスセンサーのノブ(図2F)を回すように依頼してから、_O2 IDの値が1になるまで待ちます(図2G-H)。ステップが完了したら、「次へ」をクリックします。
      注: キャリブレーションユーティリティが現在のすべてのステップを実行する場合、プログレスバーがいっぱいになると、キャリブレーションは自動的に次のステップに進みます。
   7. すべてのステップが完了し、結果が表示されたら、キャリブレーション結果を確認します。
   8. キャリブレーションガスをオフにします。
   9. 食品を変更し、48-72時間の期間のために十分な食品を追加します。
      注:エネルギー支出測定中にケージを開けて体重を監視し、毎日食べ物を変えることができますが、これらの操作によってマウスをストレスにすることができ、ケージを開くと測定値が失われます。したがって、測定期間中の操作を避けることをお勧めします。
   10. ソフトウェアで[ 実験 ]をクリックし、[ 実行] をクリックして酸素、_CO2、 および活動の測定値を開始します(図3A)。
       注: 測定の実行は、ソフトウェアの左下のセクションにあるボックスでリアルタイムで追跡できます(赤い長方形、 図3B)。 図3B の赤い長方形は、システムが3番目の測定間隔#3でケージ#1を測定することを示しています。1つのケージの1つの測定は約1分かかることができます。これにより、12ケージが接続されているため、酸素消費量は約12分ごとに測定できます。最低48時間の連続測定が推奨されます。
   11. [実験] をクリックして 実験 を中止し、[ 停止] をクリックします (図 3C)。
   12. ケージを開け、マウスと食べ物の重量を量る。48-72時間の測定期間にわたって排泄カロリーと脂質の数を計算するために、便を収集します。
       メモ:後で分析するために-20°Cで保存することができます。これらのケージは、尿を収集するために効果的に使用することはできません。
   13. [実験]をクリックし、[エクスポート]をクリックし、すべての被験者をCSVファイルとしてエクスポートします(図3D)。
       注: ANCOVA 分析を容易にするためには、重量によって正規化されることなく、生酸素消費量 (_VO2) と _CO2 生産 (_VCO2) 値をエクスポートすることが不可欠です。
5. データ分析と品質管理
   1. エクスポートされた CSV シート (図 3D) (ステップ 1.4.13 から) では、ソフトウェアによって自動的にリストされる 2~3 日間に 12 分ごとに測定された酸素消費量 (_VO2) と _CO2 生産 (VCO2) の生の値を使用し、タイムスタンプ、つまり測定された時間と日付を含めます。
      注: 体重またはリーン質量の値が追加されると、_VO2 および _VCO2 の値が自動的に修正されます。
   2. エクスポートされた CSV シートで、自動的に計算され、タイムスタンプに従ってソフトウェアによって一覧表示される呼吸交換比率 (RER: _VCO2/_VO2) の生の値を使用します。
      注:1に近い値は、マウスが主に炭水化物を酸化することを示し、0.7に近い値は、マウスが主に脂肪を酸化していることを表します。1以上のRERは、体が乳酸によって引き起こされるアシドーシスを補うためにより多くの_CO2 を排出するので、嫌気運動中に起こり得る。RER が 1 より高い場合は、応力を示すことができます。エクスポートされた CSV ファイルには、エネルギー支出 (EE) または 1 マウスあたりの 1 分間あたりのカロリーの熱生産からの生の値も含まれています。ここには、すべての値にタイムスタンプが含まれています。
   3. ANCOVAではマウス当たりの EE 値が 1 つ必要なため、ライト(日)フェーズの場合は 09:00~16:00、マウスおよび日ごとの暗い(夜間)フェーズの場合は 19:00-04:00 の間に記録された EE 値の平均値です。
      メモ:これはExcelまたはグラフパッドを使用して手動で行うことができます。これらの 2 つの時間枠を選択すると、明暗相遷移に関連付けられた中間、段階的、不安定な EE 値の平均化が回避されます。
   4. 48 時間の期間の場合、Excel または Graph Pad を使用して、2 つのデイライト値とマウス当たり 2 つの暗位相の平均を計算します。
   5. 総身体活動を定量化するには、Excel または Graph Pad を使用して、代謝ケージで測定され、各マウスの CSV ファイルにリストされている x、y、Z のビームブレーク数を合計します。
      注: X、Y、Z の合計アクティビティは、マウスとサイクルごとの各 X、Y、Z の平均値を最初に実行することによって計算されます。そして、各平均X、Y、Z値の合計をマウスおよびサイクル当たりにして 、図5Eのようにデータをプロットする(平均2日間であること)を決定する。
   6. あるいは、時間の経過に伴う各測定値を示すデータを表し、光から暗いサイクルへの移行中のEEの変化を示す曲線を生成する。
      注: ANCOVA 分析を実行する方法とタイミングに関する説明のセクションを参照してください、_VO2、_VCO2、および EE の計算に使用されるさまざまな式は 補足ファイル 1 に記載されています。

2. エネルギーを消費する熱原性アディポサイトの容量の測定

1. 測定とマウス処理を設定します。酸素消費量を監視する実験用の準備の詳細については、ステップ2.1.1-2.2.2に続く酸素消費量によって間接的に決定される。
   注:このプロトコルは、BAの熱原性能力の迅速な評価を与えるβ-3受容体アゴニストCL-316,243( 材料表を参照)を用いたマウス麻酔および急性治療を必要とする。
   1. 体組成分析を行い、マウスの重量を量る。CLAMSをオンにし、温度を30°C(サーモニュートラル)に設定し、システム全体がウォームアップするまで2時間待ちます。
   2. ライトを含む他のアッセイ条件を設定し、各ケージにマウスIDを割り当て、グループ間で体重差が見られない場合は、対応するケージ内の各マウスの体重値を追加します。
   3. ステップ1.4.2-1.4.7のように酸素/_CO2 検出器を較正します。
   4. ソフトウェアで実験を開始します。
   5. ペントバルビタール(60-120 mg/kg)で各マウスを注入し、割り当てられた代謝ケージに各マウスを置きます(ステップ2.1.2)。
      注:マウスを熱中性(30°C)で眠るために必要なペントバルビタールの用量は、マウス株および遺伝子型によって異なります。50〜120mg/kgの異なるペントバルビタール用量をテストすることを推奨し、30°Cで2-3時間の間にマウスを麻酔し続けるものを選びました。 効率的な麻酔は、エネルギー支出への身体活動の貢献を取り除くために不可欠です。
   6. 麻酔を確実にするために、ペントバルビタール注射後のマウスが完全に眠り、酸素消費率が低下するまで観察する。
   7. CL-316,243を注入する前に、少なくとも3つの安定した連続した酸素消費率を得るのを待ちます。
      注:酸素消費量の安定化を待っている間に、各マウス(1 mg / kg)のCL-316,243で注射器を準備してください。
   8. ケージ#1を開き、_VO2 と_VCO2 の測定が1回発生した直後にCL-316,243を皮下に注入します。注射直後にマウスをケージ #1 に戻します。
      メモ:測定は、ソフトウェアの左下のセクションでリアルタイムで示されています(図3B、赤い長方形)。
   9. ケージ #2 が測定されるのを待ち (図 3B、赤い長方形) し、手順 2.1.8 の手順 2.1.8 でケージ #2 に進みます。
      注: 測定直後にCL-316,243を注入すると、射出の間の時間定数を維持できます。たとえば、12 個のマウス/ケージが実行されており、測定値が個々のケージで順番に収集され、収集がケージあたり 55 秒続く場合は、1 つのマウスを毎分注入する必要があります。これらの注入率によって、最初の測定はすべての12のケージで注入の後12分後に起こる。
   10. エネルギー支出の値が5-6連続測定のための高原まで、エネルギー支出の測定を続ける、通常注入後90-180分。
       注:マウスは実験中に麻酔から目を覚ます可能性があります。これらのマウスは分析から除去する必要があります。したがって、ペントバルビタール用量を事前にテストすることは、研究の効率を高める。
   11. エネルギー支出の測定を停止しますが、目が覚めるまで、30°Cでケージにマウスを置きます。
   12. マウスが完全に目を覚ました後、マウスの健康状態を検査し、最初のケージに戻します。
   13. セクション 1.4.13 で説明されているように、機器ソフトウェアを使用して、各マウスのデータを CSV ファイルとしてエクスポートします。
2. データ分析
   注: データ分析は Excel またはグラフパッドで実行されました
   1. マウスが完全に麻酔をしたときの代謝速度を表す値であるため、_VO2、_VCO2、および EE の 3 ~ 5 個の連続値を時間の経過とともに安定して一定にプロットします。
   2. 次に、射出後に得られた第1および以下の連続した_VO2、_VCO2、およびEE測定値をプロットする。
      注:EEの絶対値と注入によって誘導されるEEの折り目の増加はBAの熱原関数⁷を示す。

結果

図4は、_VO2、_VCO2、熱生産/エネルギー支出(EE)、呼吸交換比(RER)、およびCLAMSシステムの代謝ケージを使用して得られたX、Y、Zの身体活動値を示す。CLAMS システムが提供する _VO2 および _VCO2 は、1 分間のガスの体積 (mL) であり、測定を開始する前に CLAMS ソフトウェアにこれらの重量値を入力することで、すでに体重または無駄のない質量値で?...

ディスカッション

間接カロリー測定は、全身エネルギー支出を評価するために何年も使用されてきました ⁴.本明細書に記載されるこのプロトコルは、代謝ケージを使用して、基礎代謝率を測定し、 生体内の BA熱新生能力を決定する簡単な方法を提供する。

ここで説明する間接熱量測定法は、エネルギー支出値を体重値で割ることに誤解を与える可能性があること?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CLAMS-Oxymax System	Columbus Instruments	CLAMS-center feeder-ENC	Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software	HP/Columbus	N/A	PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator)	Fisher Scientific	23-116681	Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition	Echo-MRI	Echo-MRI 100	Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243	Sigma	C5976	Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet	Research Diets	D12266B	Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal	Pharmacy at DLAM	N/A	Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator)	Praxair	NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590	20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration