Recursos bioinformáticos para el estudio de las interacciones de proteínas mediadas por glicanos

Resumen

Este protocolo ilustra cómo explorar, comparar e interpretar los glicomas de proteínas humanas con recursos en línea.

Resumen

La iniciativa Glyco@Expasy se lanzó como una colección de bases de datos y herramientas interdependientes que abarcan varios aspectos del conocimiento en glicobiología. En particular, tiene como objetivo resaltar las interacciones entre las glicoproteínas (como los receptores de la superficie celular) y las proteínas de unión a carbohidratos mediadas por glicanos. Aquí, los principales recursos de la colección se presentan a través de dos ejemplos ilustrativos centrados en el N-glicoma del antígeno prostático específico (PSA) humano y el O-glicoma de las proteínas séricas humanas. A través de diferentes consultas de bases de datos y con la ayuda de herramientas de visualización, este artículo muestra cómo explorar y comparar contenido en un continuo para recopilar y correlacionar piezas de información dispersas. Los datos recopilados están destinados a alimentar escenarios más elaborados de la función del glicano. La glicoinformática introducida aquí se propone, por lo tanto, como un medio para fortalecer, dar forma o refutar las suposiciones sobre la especificidad de un glicoma proteico en un contexto dado.

Introducción

Los glicanos, proteínas a las que están unidos (glicoproteínas) y proteínas a las que se unen (lectinas o proteínas de unión a carbohidratos) son los principales actores moleculares en la superficie ^celular1. A pesar de este papel central en la comunicación célula-célula, los estudios a gran escala, incluidos los datos de glicómica, glicoproteómica o glicano-interactómica, siguen siendo escasos en comparación con su contraparte en genómica y proteómica.

Hasta hace poco, no se habían desarrollado métodos para caracterizar las estructuras ramificadas de los carbohidratos complejos sin dejar de conjugarse con la proteína portadora. La biosíntesis de glicoproteínas es un proceso no basado en plantillas en el que los donantes de monosacáridos, los sustratos de glicoproteínas que aceptan y las glicosiltransferasas y glucosidasas desempeñan un papel interactivo. Las glicoproteínas resultantes pueden soportar estructuras complejas con múltiples puntos de ramificación donde cada componente monosacárido puede ser uno de los varios tipos presentes en la ^naturaleza1. El proceso no basado en plantillas impone el análisis bioquímico como la única opción para generar datos estructurales de oligosacáridos. El proceso analítico de las estructuras de glicanos unidas a una proteína nativa a menudo es un desafío, ya que requiere tecnologías sensibles, cuantitativas y robustas para determinar la composición de monosacáridos, enlaces y secuencias de ^{ramificación2}.

En este contexto, la espectrometría de masas (EM) es la técnica más utilizada en experimentos de glucómica y glicoproteómica. A medida que pasa el tiempo, estos se llevan a cabo en configuraciones de mayor rendimiento y los datos ahora se acumulan en las bases de datos. Estructuras de glicanos en varios ^formatos3, rellenen GlyTouCan4, el repositorio universal de datos de glicanos donde cada estructura está asociada con un identificador estable independientemente del nivel de precisión con el que se defina el glicano (por ejemplo, posiblemente falta el tipo de enlace o la composición ambigua). Se recogen estructuras muy similares, pero sus pequeñas diferencias se informan claramente. Las glicoproteínas se describen y curan en ^GlyConnect5 y GlyGen6, dos bases de datos que se cruzan entre sí. Los datos de EM que respaldan las piezas estructurales de evidencia se almacenan cada vez más en ^GlycoPOST7. Para una cobertura más amplia de los recursos en línea, el capítulo 52 del manual de referencia, Essentials of Glycobiology, está dedicado a la glicoinformática8. Curiosamente, el software de identificación de glicopéptidos ha proliferado en los últimos ^años9,10 aunque no en beneficio de la reproducibilidad. Esta última preocupación llevó a los líderes de la Iniciativa de Glicoproteómica (HGI) de HUPO a establecer un desafío de software en 2019. Los datos de EM obtenidos del procesamiento de mezclas complejas de proteínas séricas humanas N- y O-glicosiladas en los modos de fragmentación CID, ETD y EThcD, se pusieron a disposición de los competidores, ya sean usuarios de software o desarrolladores. El informe completo sobre los resultados de este ^desafío11 solo se describe aquí. Para empezar, se observó una propagación de identificaciones. Se interpretó principalmente como causado por la diversidad de métodos implementados en los motores de búsqueda, de sus configuraciones y cómo se filtraron las salidas y se "contaron" los péptidos. El diseño experimental también puede haber puesto algunos software y enfoques en una (des)ventaja. Es importante destacar que los participantes que usaron el mismo software informaron resultados inconsistentes, destacando así graves problemas de reproducibilidad. Se concluyó comparando diferentes presentaciones que algunas soluciones de software funcionan mejor que otras y algunas estrategias de búsqueda producen mejores resultados. Es probable que esta retroalimentación guíe la mejora de los métodos automatizados de análisis de datos de glicopéptidos y, a su vez, afecte el contenido de la base de datos.

La expansión de la glicoinformática llevó a la creación de portales web que proporcionan información y acceso a múltiples recursos similares o complementarios. Los más recientes y actualizados se describen en un capítulo de la serie de libros Comprehensive ^{Glycoscience12} y, a través de la cooperación, se ofrece una solución para el intercambio de datos y la información en un modo de acceso abierto. Se desarrolló uno de estos portales, que originalmente se llamó Glycomics@ExPASy ¹³ y pasó a llamarse Glyco@Expasy, tras la importante revisión de la plataforma ^Expasy14 que ha alojado una gran colección de herramientas y bases de datos utilizadas en varias ómicas durante décadas, siendo el elemento más popular ^UniProt15, la base de conocimiento universal de proteínas. Glyco@Expasy ofrece un descubrimiento didáctico del propósito y uso de bases de datos y herramientas, basado en una categorización visual y una visualización de sus interdependencias. El siguiente protocolo ilustra los procedimientos para explorar datos de glicómica y glicoproteómica con una selección de recursos de este portal que hace explícita la conexión entre la glicoproteómica y la glicano-interactómica a través de la glucómica. Tal como están las cosas, los experimentos glucómicos producen estructuras donde los monosacáridos están completamente definidos y los enlaces parcial o totalmente determinados, pero su unión al sitio de la proteína está mal caracterizada, si es que lo está. Por el contrario, los experimentos de glicoproteómica generan información precisa de unión al sitio, pero con una resolución deficiente de las estructuras de glicanos, a menudo limitadas a composiciones de monosacáridos. Esta información se reúne en la base de datos GlyConnect. Además, las herramientas de búsqueda en GlyConnect se pueden utilizar para detectar posibles ligandos de glicanos que se describen junto con las proteínas que los reconocen en ^UniLectin16, vinculados a GlyConnect a través de glicanos. El protocolo presentado aquí se divide en dos secciones para cubrir preguntas específicas de los glicanos y glicoproteínas ligados a N y O.

Protocolo

NOTA: Se requiere un dispositivo con conexión a Internet (se prefiere una pantalla más grande) y un navegador web actualizado como Chrome o Firefox. El uso de Safari o Edge puede no ser tan confiable.

1. De una proteína N-glicoma en GlyConnect a una lectina de UniLectin

1. Acceso a recursos desde Glyco@Expasy
   NOTA: El procedimiento descrito aquí es acceder a GlyConnect, pero se puede aplicar para acceder a cualquier recurso registrado en la plataforma.
   1. Vaya a https://glycoproteome.expasy.org/glycomics-expasy y considere el gráfico de burbujas a la derecha que muestra diferentes categorías, como glicoconjugados o unión de glicanos. En el menú de la izquierda que refleja las categorías de las burbujas, marque la casilla Glicoproteínas para que el gráfico de burbujas de la derecha se acerque inmediatamente a la burbuja que coincida con esa categoría.
      NOTA: Las burbujas verdes son herramientas y las burbujas amarillas son bases de datos. Al hacer clic en cualquiera de los dos, se vuelve a acercar para proporcionar detalles sobre el recurso. Antes de hacerlo, es posible que el usuario desee comprender las dependencias de ese recurso para otros.
   2. Para obtener la información sobre las dependencias, vaya de la ficha Clasificación temática de recursos a la ficha Rueda de dependencias de recursos . Coloque el ratón en GlyConnect en la rueda para comprobar su nivel de integración con otras fuentes (Figura 1).
   3. Vuelva a la pestaña Clasificación temática de recursos para llegar a la burbuja GlyConnect como en el paso 1.1.1 y haga clic en ella (Figura suplementaria 1) para mostrar la página de inicio de GlyConnect en una nueva pestaña que muestra las estadísticas del contenido en la última versión de la base de datos.
      Nota : un esquema de color detallado en la Tabla 1 coincide con los diferentes tipos de información almacenada en la base de datos. Este código de color es válido en todas las páginas de entidad en GlyConnect y es consistente en todo momento. La página de inicio también muestra cuatro secciones dedicadas a conjuntos de datos enfocados, como los que describen la glicosilación de la proteína espiga sars-Cov-2 (COVID-19) o detallan ampliamente los oligosacáridos de la leche humana (HMO). Estos no serán explorados en este protocolo.
2. Explorando la información contextual de una proteína N-glicoma
   NOTA: Todas las estructuras de glicanos en GlyConnect se muestran en tres formatos alternativos y de uso común: (1) Nomenclatura de símbolos para glicanos (SNFG)¹⁷ (2) IUPAC condensado¹⁸, y (3) Oxford¹⁹. En contraste, no existe una notación estándar para expresar la composición de glicanos. En GlyConnect, se utiliza el siguiente código: Hex para la hexosa, HexNAc para la N-acetilhexosamina, dHex para la fucosa y NeuAc para los ácidos siálicos. En aras de la simplicidad, las herramientas de visualización se basan en una notación condensada: H para la hexosa, N para la N-acetilhexosamina, F para la fucosa y S para los ácidos siálicos. Además, las letras pequeñas designan modificaciones como "a" para la acetilación, "p" para la fosforilación y "s" para la sulfatación, para el más frecuente de estos llamados sustituyentes.
   1. Para ver y explorar el N-glicoma del antígeno prostático específico (PSA) humano, desde la página de inicio de GlyConnect, proceda de la siguiente manera.
      NOTA: La glicosilación del PSA humano se ha estudiado a lo largo de los años, especialmente en el contexto del cáncer de próstata. La base de datos GlyConnect almacena tres referencias20,21,22, que combinan datos glucómicos y glicoproteómicos. Tenga en cuenta que los resultados proporcionados aquí se obtuvieron con la versión de septiembre de 2021 de GlyConnect. El uso ulterior de la base de datos puede producir estadísticas ligeramente diferentes debido a las frecuentes actualizaciones de datos.
   2. Seleccione el botón PROTEIN para abrir la vista de proteínas de la base de datos. En la página de vista de proteínas, escriba próstata en la ventana de búsqueda. Busque las dos entradas enumeradas en la salida que distinguen dos isoformas de PSA con valores de pI distintos. Haga clic en 790 (columna Id) correspondiente a la isoforma común de PSA.
      NOTA: Busque la barra multicolor superior que muestra la información resumida extraída del trabajo publicado en el esquema detallado anteriormente. Varias opciones de navegación son posibles como se describe a continuación.
   3. En la barra multicolor superior, haga clic en el botón FUENTE en verde para mostrar los tipos de muestra a partir de los cuales se procesaron los datos publicados: Orina y Líquido seminal. Para seguir examinando esta información, haga clic en cualquiera de estos tipos de ejemplo. Lo mismo se aplica a cualquier elemento que aparezca al hacer clic en un botón de color.
   4. Para verificar el contenido relacionado con la salud de la base de datos, haga clic en el botón ENFERMEDAD , que contiene dos elementos, uno de los cuales es Cáncer de próstata que se vincula a la página dedicada a la enfermedad correspondiente en GlyConnect. El resumen de esa página muestra que tres estudios a gran escala han reportado 319 composiciones en 1,087 sitios encontrados en 308 proteínas humanas.
   5. Haga clic en el botón ESTRUCTURA para ver la lista completa de 135 estructuras asociadas con PSA a partir de datos glucómicos. Haga clic en el botón COMPOSICIÓN para ver las 78 composiciones asociadas determinadas por experimentos de glicoproteómica. Haga clic en cualquier estructura o composición para obtener más detalles.
      NOTA: Se pueden obtener detalles como la lista de proteínas alternativas que llevan la estructura particular o la lista de estructuras que coinciden con la composición. Se sabe que el PSA tiene solo un sitio de glicosilación N en Asn-69 (solo un elemento contado para el botón MARRÓN SITE ).
   6. Para reducir la ambigüedad de las composiciones, haga clic en STRUCT SUGERIDO debajo de una composición seleccionada (por ejemplo, Hex:6 HexNAc:3 NeuAc:1). Se hace una sugerencia cada vez que el recuento de monosacáridos coincide con el de una estructura enumerada anteriormente (Figura 2).
      NOTA: La composición Hex:6 HexNAc:3 NeuAc:1 generada por un experimento de glicoproteómica se corresponde con cuatro estructuras de mayor resolución a partir de los datos glucómicos. En el caso del PSA, no hay ambigüedad del sitio para resolver, ya que solo Asn-69 es glicosilado.
   7. Para explorar completamente la página de proteínas, vea más detalles en el lado derecho de la página (Figura 3).
      1. Vea la entrada predeterminada 3QUM PDB (Protein Data ^Bank23) para PSA que se muestra con dos glicanos complejos unidos a cada monómero (Figura 3) o la entrada alternativa 2ZCK , que también está disponible debido a un carbohidrato adjunto. La segunda entrada muestra una sola cadena.
         NOTA: Ambas entradas se visualizan con el plugin 3D ^LiteMol24 que muestra glicanos en notación SNFG-3D adoptada en el PDB-RCSB.
      2. Haga clic en los enlaces correspondientes de otras referencias cruzadas para explorar información funcional relevante de las principales bases de datos de proteómica, como UniProt (Figura 3).
3. Visualización y correlación de la información contextual de una proteína N-glicoma
   NOTA: Como se vio en la sección anterior, las largas listas de estructuras o composiciones pueden ser difíciles de aprehender en su conjunto y GlyConnect se basa en dos herramientas diferentes para visualizar información clave, a saber, GlyConnect Octopus y GlyConnect Compozitor (el primero expande la información de resumen capturada en botones de colores y el segundo resalta las dependencias estructurales en términos de una estructura / composición contenida en otro). Como se ilustra a continuación, GlyConnect Octopus explora las asociaciones entre las diversas entidades almacenadas en la base de datos al resaltar conexiones múltiples o individuales como un reflejo del contenido de la base de datos.
   1. Realice una búsqueda de GlyConnect Octopus para confirmar la presencia de rasgos estructurales comunes, como estructuras de núcleo híbrido y estructuras que contienen ácido siálico altamente frecuentes en la diversidad de glicanos unidos al PSA, como se describe a continuación.
   2. Vaya a la página de inicio de Octopus https://glyconnect.expasy.org/octopus/. Mantenga la pestaña vinculada a N seleccionada de forma predeterminada. Vaya a la subpestaña Núcleos y haga clic en el icono Híbrido . Vaya a la subpestaña Propiedades y haga clic en el icono Sialylated . Haga clic en el botón verde Buscar a continuación.
      NOTA: Los resultados de la búsqueda se muestran gráficamente como relaciones entre tres categorías de elementos. De forma predeterminada, la lista central coincide con la consulta de composiciones, la colección izquierda abarca proteínas relacionadas y la derecha abarca glicanos relacionados.
   3. En el gráfico de relaciones mostrado, coloque el cursor sobre H6N4F1S1 para resaltar los enlaces a seis proteínas y tres estructuras. Contrasta esto flotando sobre H6N4F2S1 que destaca las dos isoformas de PSA (ambas conocidas como UniProt ID: KLK3_HUMAN) y una estructura (ID: 10996). Coloque el cursor sobre el ID de estructura para mostrar su representación SNFG y haga clic en él para abrir la página correspondiente (Figura suplementaria 2).
   4. Cambie los nodos del pulpo a cualquier otro tema que describa el contexto de la glicosilación. El código de color sigue siendo el mismo que el descrito anteriormente (ver Tabla 1).
      1. Cambie los nodos centrales a tejidos para mostrar 15 opciones en el centro del gráfico, muchas de las cuales son fluidos corporales. Busque todas las asociaciones entre proteínas y glicanos que coincidan con la consulta dependiendo de la información del tejido. Coloque el cursor en Orina o Líquido seminal en el centro del gráfico para ver diferentes asociaciones (Figura 4A, B).
      2. Cambie los ganglios del centro a Enfermedad para mostrar 13 opciones, una de las cuales es el cáncer de próstata. La única proteína asociada es el PSA (KLK3_HUMAN) (Figura suplementaria 3).
         NOTA: Una mirada más cercana al N-glicoma PSA que se muestra en la página de proteínas destaca la frecuencia muy alta de un NeuAc terminal (a?-?) Gal(b?-?) Subestructura GlcNAc en muchos casos en estructuras con dos o tres antenas. Otro pulpo se puede generar sobre esa base como se describe a continuación.
   5. Haga clic en el botón Borrar para actualizar la búsqueda. Vaya a la subpestaña Propiedades y haga clic en el icono Bi-antennary . Vaya a la subpestaña Determinantes y haga clic en el icono 3-Sialyl-LN (tipo 2 ). Haga clic en el botón verde Buscar a continuación.
   6. Compruebe las asociaciones recuperadas por Octopus con glicanos biantelares que contienen un motivo terminal 3-Sialyl-LN (tipo 2), es decir, NeuAc(a1-3)Gal(b1-4)GlcNAc. Cambie los nodos centrales a tejidos para facilitar la lectura y pase el cursor sobre KLK3_HUMAN para conectar directamente el líquido seminal con la isoforma común de PSA y siete estructuras (Figura suplementaria 4).
      NOTA: La segunda herramienta de visualización, GlyConnect Compozitor, realiza el escaneo de las relaciones potenciales entre todas y cada una de las composiciones en una lista de las mismas (ver más abajo). Una relación se define como diferente de un solo monosacárido entre dos composiciones. Estas relaciones identificadas trazadas en un gráfico exponen la (des)continuidad de un glicoma.
   7. Utilice GlyConnect Compozitor para realizar el escaneo de las relaciones potenciales entre todas y cada una de las composiciones en una lista de las mismas, como se ilustra a continuación para el caso de PSA.
      NOTA: GlyConnect Compozitor procesa composiciones en asociación con un contexto. Ofrece distintas pestañas para consultar GlyConnect, por ejemplo, Proteínas, Fuentes, Líneas celulares, Enfermedades que se explican por sí mismas para calificar un contexto. Esto se ilustra aquí con PSA de la siguiente manera.
   8. Vuelva a la página de proteínas de PSA: https://glyconnect.expasy.org/browser/proteins/790. En el lado derecho de la página de entrada de PSA, haga clic en el enlace Compozitor. Asegúrese de que los campos de búsqueda de Compozitor estén rellenados previamente con los detalles de la entrada Id 790 en la pestaña Proteína (Proteína: Antígeno prostático específico, Especie: Homo sapiens y Tipo de glicano: N-vinculado).
   9. Haga clic en el botón Agregar a la selección para recuperar datos de la base de datos y mostrar el gráfico de composiciones conectadas. Anule la selección de la opción Incluir nodos virtuales . Haga clic en el botón Compute Graph para mostrar un gráfico que muestra un conjunto bien conectado de 78 composiciones que representan el PSA N-glicoma, y un gráfico de barras que muestra las principales características de los glicanos.
   10. Pase el cursor sobre la barra púrpura en el gráfico de barras, que localiza todas las estructuras sialilladas en el gráfico para revelar un sesgo observable hacia las estructuras sialiladas.
   11. Permanezca en la pestaña principal Proteína y seleccione Antígeno prostático específico - isoforma pi alta (psah) en el campo Proteína (nombre).
       NOTA: Los campos Tipo de glicano y Sitio de glicano se rellenan automáticamente.
   12. Haga clic en el botón Agregar a selección para recuperar datos de la base de datos que ascienden a 57 composiciones. Haga clic en el botón Compute Graph para generar los gráficos superpuestos de ambas isoformas y evaluar las diferencias en los glicomas de las dos isoformas de PSA. Coloque el cursor sobre las etiquetas de nodo para solicitar la visualización del número de estructuras correspondientes a las composiciones/etiquetas (Figura 5).
4. Información de enlace a glicanos en UniLectin
   NOTA: Recordemos el determinante probado en el pulpo, descrito como NeuAc(a2-3)Gal(b1-4). Por definición, es una parte vinculante establecida de una estructura de glicanos y, como tal, se puede buscar en la base de datos UniLectin3D25.
   1. Vaya a https://www.unilectin.eu/ y haga clic en el botón UniLectin3D . Alternativamente, vaya directamente a la página: https://www.unilectin.eu/unilectin3D/.Click en el botón de búsqueda de glicanos para abrir esta página: https://www.unilectin.eu/unilectin3D/glycan_search (Figura suplementaria 6).
   2. Haga clic en el diamante púrpura que representa un ácido siálico, lo que provoca la visualización de todos los motivos de unión a glicanos que terminan con un ácido siálico almacenado en la base de datos. La parte superior de esa colección de motivos contiene el motivo NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc investigado anteriormente (Figura suplementaria 7).
   3. Haga clic en el motivo NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc para solicitar la visualización de todas las lectinas para las que se conoce una estructura 3D que confirma la interacción con NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc. El resultado por defecto muestra lectinas en todas las especies. Utilice la opción Buscar por campo para limitar la vista a la información centrada en el ser humano.
   4. Haga clic en la opción Buscar por campo . En el campo de las especies , tipo Homo sapiens. Haga clic en el botón Explorar estructuras de rayos X para filtrar la lista original. Solo queda una entrada, es decir, la galectina-8 humana. Haga clic en el botón Ver la estructura e información 3D en la esquina superior derecha del elemento enumerado para mostrar información detallada de la galectina-8 humana que interactúa con NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc.
   5. Acceda a la información estructural sobre la galectina-8 humana que se muestra en la página con dos visores diferentes.
      1. Sostenga el ratón para darle la vuelta a la molécula y ponga el ligando en primer plano con el software ^Litemol26 integrado para mostrar la estructura 3D de la lectina. Pase el ratón sobre una de las interacciones enumeradas a la izquierda para actualizar la vista de la derecha y localizar dónde actúa esa interacción en particular en la estructura con el software ^PLIP27 integrado para detallar las interacciones atómicas entre la lectina y el ligando (Figura 6).
   6. Haga clic en cualquier botón verde que enlace a las entradas correspondientes en UniProt, PDB (sitios europeos o americanos) y GlyConnect para explorar estas referencias cruzadas.

2. Exploración y comparación de O-glicomas en GlyConnect

1. Exploración del conjunto de datos de alta confianza del desafío HGI
   NOTA: El conjunto de datos HGI mencionado en la introducción se almacena en la base de datos GlyConnect. Contiene 163 N- y 23 O-glicopéptidos que se encuentran en 37 glicoproteínas consideradas como una lista de alta confianza. GlyConnect ^Compozitor28 es clave para evaluar la consistencia de los datos de glicoma. Es importante destacar que Compozitor permite nodos virtuales (que se muestran en gris) cuando solo se necesita un paso intermedio para conectar los nodos aislados. De esa manera, los nodos virtuales aprietan el gráfico y pueden interpretarse como estructuras potencialmente perdidas en los resultados experimentales.
   1. Explore el conjunto de datos de HGI desde la página de inicio de GlyConnect yendo directamente a la página de referencia del artículo: https://glyconnect.expasy.org/browser/references/2943.
      NOTA: El resumen en los botones de colores refleja parcialmente las cifras proporcionadas en el artículo. Sin embargo, si solo se enumeran 69 péptidos únicos, esto refleja múltiples asociaciones entre péptidos y sitios o estructuras. En el artículo, un glicopéptido se define como una combinación única de un péptido y una composición. En GlyConnect, los glicositios se consideran primero, y se describen como una combinación de un péptido con estructuras. Esto explica la discrepancia en las cifras entre GlyConnect y la cita anterior.
   2. Compruebe la alta frecuencia de aparición de composiciones ligadas a N, como Hex:5 HexNAc:4 NeuAc:2, identificadas en 42 sitios en 43 péptidos en comparación con la singularidad frecuente de la mayoría de las composiciones ligadas a O identificadas en 1 sitio en 1 péptido.
   3. Haga clic en el enlace Compozitor en el lado derecho de la página de entrada de referencia para evaluar la consistencia del conjunto de datos. Asegúrese de que la herramienta Compozitor procesa directamente el DOI de la referencia y rellena el campo de búsqueda con reference=10.1101/2021.03.14.435332 en la pestaña Avanzado de la herramienta. Escriba &glycan_type=O-linked después del número DOI para reducir la búsqueda a los glicanos enlazados a O, de modo que la consulta se convierta: referencia=10.1101/2021.03.14.435332&glycan_
      type=O-linked
   4. Haga clic en el botón Agregar a la selección para recuperar datos de la base de datos (hay 20 composiciones vinculadas a O). Mantenga seleccionada la opción Incluir nodos virtuales . Haga clic en el botón Compute Graph para mostrar el gráfico de composiciones conectadas. Este resultado pone de relieve varias brechas en la continuidad esperada de la biosíntesis de glicanos con nueve nodos virtuales necesarios para completar el gráfico (Figura 7).
2. Comparación con el O-glicoma de una proteína sérica seleccionada en GlyConnect
   NOTA: Para evaluar si los vacíos pueden ser llenados por los datos almacenados en GlyConnect, se seleccionó una proteína O-glicosilada de las 37 enumeradas con la referencia. En el conjunto de datos, se informa que la cadena pesada H4 (Q14624) del inhibidor de la interal alfa-tripsina es un O-glicosilado en Thr-725.
   1. Vaya a la pestaña Proteína de GlyConnect Compozitor (consulte el paso 2.1.3). En la lista Proteína , seleccione Inter-alfa-trypsin inhibitor heavy chain H4. Asegúrese de que la selección de especies sea Homo sapiens de forma predeterminada. Anule la selección de N-linked en el tipo de glicano. Seleccione solo Thr-725 en la lista Sitio haciendo clic primero en el signo menos a la izquierda del Sitio para anular la selección de todos los sitios y, a continuación, seleccionando solo Thr-725 de la lista.
   2. Haga clic en el botón Agregar a la selección (tenga en cuenta que seis composiciones están asociadas con Thr-725). Haga clic en el botón Compute Graph para mostrar el gráfico de composiciones conectadas (Figura suplementaria 8).
   3. Observe el gráfico mostrado, que muestra las 17 composiciones únicas de las 20 composiciones vinculadas a O del conjunto de datos del artículo en azul y las tres únicas de seis en la base de datos en rojo. En otras palabras, la superposición entre las dos fuentes está presente en tres composiciones que se representan en magenta. Tenga en cuenta que una rotación de 45 ° del gráfico se genera automáticamente.
      NOTA: El número de nodos virtuales se reduce en uno. Como resultado, H2N2S1 que falta en las 20 composiciones vinculadas a O del conjunto de datos del artículo y se representa como un nodo virtual ahora se llena con una composición adicional asociada con Thr-725 de la cadena pesada H4 del inhibidor de la inter-alfa-tripsina en la base de datos. Esto simplifica la topología del gráfico porque otros dos nodos virtuales se vuelven inútiles, ya que eran opciones alternativas para llenar el espacio entre H1N2S1 y H2N2S2. Sin embargo, una segunda composición importada de la base de datos se aislaría si no fuera por la creación de dos nuevos nodos virtuales alternativos H2N2F1S1 y H1N2F2S1.
   4. Para dar sentido a los nodos virtuales, compruebe si las composiciones correspondientes están presentes en GlyConnect. Para hacer esto, haga clic en el botón Exportar debajo del gráfico. Seleccione Solo virtual anulando la selección de todas las demás opciones. Haga clic en el icono del portapapeles para copiar la selección de 8 composiciones.
   5. Pegue la selección en la ventana de consulta de la pestaña Personalizado de Compozitor. Seleccione O-linked en el campo Glycan Type . Establezca la etiqueta de selección en el campo Composiciones en, por ejemplo, VN para nombrar la lista de 8 composiciones. Haga clic en el botón Agregar a la selección y, a continuación, en el botón Compute Graph . Todos los nodos virtuales ahora se muestran como nodos verdes (Figura 8).

Resultados

La primera parte del protocolo (sección 1) mostró cómo investigar la especificidad o la similitud de los N-glicanos unidos en Asn-69 del antígeno prostático específico (PSA) humano utilizando la plataforma GlyConnect. Las variaciones dependientes de tejidos (orina y líquido seminal), así como las variaciones dependientes de isoformas (pI normal y alta) en la expresión de glicanos, se enfatizaron utilizando dos herramientas de visualización (Figura 4 y

Discusión

GlyConnect Octopus como herramienta para revelar correlaciones inesperadas
GlyConnect Octopus fue diseñado originalmente para consultar la base de datos con una definición suelta de glicanos. De hecho, la literatura a menudo informa de las principales características de los glicanos en un glicoma, como ser fucosilado o sialilado, estar hecho de dos o más antenas, etc. Además, los glicanos, ya sean N u O, enlazados se clasifican en núcleos, como se detalla en el manual de referencia Essentials

Materiales

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