Cribado agrupado de la biblioteca de shRNA para identificar los factores que modulan un fenotipo de resistencia a los medicamentos

Resumen

El cribado de interferencia de ARN (ARNi) de alto rendimiento utilizando un grupo de shRNAs lentivirales puede ser una herramienta para detectar dianas letales sintéticas terapéuticamente relevantes en neoplasias malignas. Proporcionamos un enfoque de detección de ARNt agrupado para investigar los efectores epigenéticos en la leucemia mieloide aguda (LMA).

Resumen

Comprender los mecanismos impulsores clínicamente relevantes de la quimiorresistencia adquirida es crucial para dilucidar las formas de eludir la resistencia y mejorar la supervivencia en pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA). Una pequeña fracción de las células leucémicas que sobreviven a la quimioterapia tienen un estado epigenético preparado para tolerar el insulto quimioterapéutico. La exposición adicional a la quimioterapia permite que estas células persistentes de medicamentos alcancen un estado epigenético fijo, lo que conduce a una expresión génica alterada, lo que resulta en la proliferación de estas poblaciones resistentes a los medicamentos y, finalmente, en una recaída o enfermedad refractaria. Por lo tanto, es fundamental identificar las modulaciones epigenéticas que requieren la supervivencia de las células leucémicas resistentes a los medicamentos. Detallamos un protocolo para identificar moduladores epigenéticos que median la resistencia a la citarabina analógica de nucleósidos (AraC) utilizando el cribado de la biblioteca de SHRNA agrupado en una línea celular de LMA adquirida resistente a la citarabina. La biblioteca consta de 5.485 construcciones de shRNA dirigidas a 407 factores epigenéticos humanos, lo que permite la detección del factor epigenético de alto rendimiento.

Introducción

Las opciones terapéuticas en la leucemia mieloide aguda (LMA) se han mantenido sin cambios durante casi las últimas cinco décadas, con la citarabina (AraC) y las antraciclinas como la piedra angular para el tratamiento de la enfermedad. Uno de los desafíos para el éxito de la terapia con LMA es la resistencia de las células madre leucémicas a la quimioterapia, lo que lleva a la recaída de la enfermedad ^1,2. La regulación epigenética juega un papel vital en la patogénesis del cáncer y la resistencia a los medicamentos, y varios factores epigenéticos han surgido como objetivos terapéuticos prometedores

Protocolo

Siga las pautas del Comité Institucional de Bioseguridad (IBSC) y use la instalación adecuada para manejar el lentivirus (BSL-2). El personal debe estar debidamente capacitado en el manejo y eliminación de lentivirus. Este protocolo sigue las pautas de bioseguridad de Christian Medical College, Vellore.

1. Selección del promotor más potente para obtener una expresión persistente y prolongada de los shRNAs

NOTA: Es imprescindible realizar un experimento de transducción utilizando vectores lentivirales con diferentes promotores que expresan proteínas de fluorescencia para identificar el promotor que ....

Resultados

El flujo de trabajo de filtrado general se muestra en la Figura 1A. La citotoxicidad in vitro del MV4-11 AraC R (48 h) reveló que el IC50 a citarabina en el MV4-11 AraC R era mayor que el MV4-11 P (Figura 1B). Esta línea celular se utilizó en el estudio como modelo para el cribado de los factores epigenéticos responsables de la resistencia a la citarabina.

La Figura 2A muestr.......

Discusión

La interferencia de ARN (ARNi) se utiliza ampliamente para estudios de genómica funcional, que incluyen la detección de siRNA y shRNA. El beneficio de los shRNA es que pueden incorporarse a vectores plásmidos e integrarse en el ADN genómico, lo que resulta en una expresión estable y, por lo tanto, un derribo más prolongado del ARNm objetivo. Un cribado de biblioteca de shRNA agrupado es robusto y rentable en comparación con los cribados convencionales (siRNA). Identificar la esencialidad de una clase específica d.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
100 bp Ladder Hyper Ladder	BIOLINE	BIO-33025
1kb Ladder Hyper Ladder	BIOLINE	BIO-33056
Agarose	Lonza Seachekm	50004
Betaine (5mM)	Sigma	B03001VL
Boric Acid	Qualigens	12005
Cell culture plasticware	Corning	as appicable
Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride	Sigma	C1768-500MG
DMEM	MP BIO	91233354
DMSO	Wak Chemie GMBH	Cryosure DMSO 10ml
EDTA	Sigma	E5134
Ethidium Bromide	Sigma	E1510-10 mL
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044
Gel/PCR Purification Kit	MACHEREY-NAGEL	REF 740609.50
Gibco- RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	23400021
Glacial Acetic Acid	Thermo	Q11007
hCMV GFP Plasmid	Transomics	TransOmics Promoter selection KIT
hEF1a GFPlasmid	Transomics	TransOmics Promoter selection KIT
HEK 293T	ATCC	CRL-11268
HL60 cell line	ATCC	CCL-240
KOD Hot Start Polymerase	Merck	71086
Molm13 cell line	Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA	Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA
MV4-11 cell line	ATCC	CRL-9591
Penicillin streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
psPAX2 and pMD2.G	Addgene	Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	REF Q32854
SFFV  GFP Plasmid	Transomics	TransOmics Promoter selection KIT
shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics	Transomics	Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14
Trans-IT-LTI Mirus	Mirus	Mirus Catalog Number: MIR2300
Tris	MP Biomedicals	0219485591
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154-100ML
Ultra centrifuge Tubes	Beckman Coulter	103319
Equipments
5% CO2 incubator	Thermo Fisher
BD Aria III cell sorter	Becton Dickinson
Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation	Beckman coulter
Centrifuge	Thermo Multiguge 3SR+
ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system)	Fluro Chem
Leica AF600	Leica
Light Microscope	Zeiss Axiovert 40c
Nanodrop	Thermo Scientific
Qubit 3.0 Fluorometer	Invitrogen
Thermal Cycler	BioRad