Cribado agrupado de la biblioteca de shRNA para identificar los factores que modulan un fenotipo de resistencia a los medicamentos

Resumen

El cribado de interferencia de ARN (ARNi) de alto rendimiento utilizando un grupo de shRNAs lentivirales puede ser una herramienta para detectar dianas letales sintéticas terapéuticamente relevantes en neoplasias malignas. Proporcionamos un enfoque de detección de ARNt agrupado para investigar los efectores epigenéticos en la leucemia mieloide aguda (LMA).

Resumen

Comprender los mecanismos impulsores clínicamente relevantes de la quimiorresistencia adquirida es crucial para dilucidar las formas de eludir la resistencia y mejorar la supervivencia en pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA). Una pequeña fracción de las células leucémicas que sobreviven a la quimioterapia tienen un estado epigenético preparado para tolerar el insulto quimioterapéutico. La exposición adicional a la quimioterapia permite que estas células persistentes de medicamentos alcancen un estado epigenético fijo, lo que conduce a una expresión génica alterada, lo que resulta en la proliferación de estas poblaciones resistentes a los medicamentos y, finalmente, en una recaída o enfermedad refractaria. Por lo tanto, es fundamental identificar las modulaciones epigenéticas que requieren la supervivencia de las células leucémicas resistentes a los medicamentos. Detallamos un protocolo para identificar moduladores epigenéticos que median la resistencia a la citarabina analógica de nucleósidos (AraC) utilizando el cribado de la biblioteca de SHRNA agrupado en una línea celular de LMA adquirida resistente a la citarabina. La biblioteca consta de 5.485 construcciones de shRNA dirigidas a 407 factores epigenéticos humanos, lo que permite la detección del factor epigenético de alto rendimiento.

Introducción

Las opciones terapéuticas en la leucemia mieloide aguda (LMA) se han mantenido sin cambios durante casi las últimas cinco décadas, con la citarabina (AraC) y las antraciclinas como la piedra angular para el tratamiento de la enfermedad. Uno de los desafíos para el éxito de la terapia con LMA es la resistencia de las células madre leucémicas a la quimioterapia, lo que lleva a la recaída de la enfermedad ^1,2. La regulación epigenética juega un papel vital en la patogénesis del cáncer y la resistencia a los medicamentos, y varios factores epigenéticos han surgido como objetivos terapéuticos prometedores ^3,4,5. Los mecanismos reguladores epigenéticos afectan la proliferación y la supervivencia bajo la exposición continua a fármacos quimioterapéuticos. Los estudios en neoplasias malignas no hematológicas han informado que una pequeña fracción de células que superan el efecto del fármaco sufren diversas modificaciones epigenéticas, lo que resulta en la supervivencia de esas células ^6,7. Sin embargo, no se ha explorado el papel de los factores epigenéticos en la mediación de la resistencia adquirida a la citarabina en la LMA.

El cribado de alto rendimiento es un enfoque para el descubrimiento de fármacos que ha ganado importancia global con el tiempo y se ha convertido en un método estándar en diferentes aspectos para identificar objetivos potenciales en mecanismos celulares, para el perfil de vías y a nivel molecular ^8,9. El concepto de letalidad sintética implica la interacción entre dos genes donde la perturbación de cualquiera de los genes por sí sola es viable, pero de ambos genes simultáneamente resulta en la pérdida de viabilidad¹⁰. Explotar la letalidad sintética en el tratamiento del cáncer podría ayudar a identificar y caracterizar mecánicamente interacciones genéticas letales sintéticas robustas¹¹. Hemos adoptado un enfoque combinatorio de cribado de shRNA de alto rendimiento con letalidad sintética para identificar los factores epigenéticos responsables de la resistencia adquirida a la citarabina en la LMA.

Se sabe que las leucemias agudas impulsadas por la translocación cromosómica del gen de la leucemia de linaje mixto (MLL o KMT2A) se asocian con una supervivencia deficiente en los pacientes. Los productos quiméricos resultantes de los reordenamientos del gen MLL , es decir, las proteínas de fusión MLL (MLL-FPs), pueden transformar las células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en blastos leucémicos con la participación de múltiples factores epigenéticos. Estos reguladores epigenéticos constituyen una red complicada que dicta el mantenimiento del programa de leucemia y, por lo tanto, podrían formar potenciales dianas terapéuticas. En este contexto, utilizamos la línea celular MV4-11 (que alberga el gen de fusión MLL MLL-AF4 con la mutación FLT3-ITD; denominada MV4-11 P) para desarrollar la línea celular resistente a la citarabina adquirida, denominada MV4-11 AraC R. La línea celular fue expuesta a dosis crecientes de citarabina con recuperación intermitente del tratamiento farmacológico, conocido como vacaciones de drogas. La concentración inhibitoria medio máxima (IC50) se evaluó mediante ensayo de citotoxicidad in vitro .

Se utilizó la biblioteca de shRNA epigenética agrupada (ver Tabla de Materiales) impulsada por el promotor hEF1a con una columna vertebral lentiviral pZIP. Esta biblioteca comprende shRNAs dirigidos a 407 factores epigenéticos. Cada factor tiene de 5 a 24 shRNAs, con un total de 5.485 shRNAs, incluyendo cinco shRNAs de control no objetivo. El andamio miR-30 "UltrmiR" modificado ha sido optimizado para una biogénesis y expresión eficientes de shRNA primario^12,13.

El esquema de este experimento se ilustra en la Figura 1A. El protocolo actual se centra en el cribado de ARNi utilizando la biblioteca de ARNt shRNA del factor epigenético en la línea celular MV4-11 AraC R (Figura 1B), una línea celular en suspensión. Este protocolo se puede utilizar para examinar cualquier biblioteca dirigida en cualquier línea celular resistente a los medicamentos de su elección. Cabe señalar que el protocolo de transducción será diferente para las células adherentes.

Protocolo

Siga las pautas del Comité Institucional de Bioseguridad (IBSC) y use la instalación adecuada para manejar el lentivirus (BSL-2). El personal debe estar debidamente capacitado en el manejo y eliminación de lentivirus. Este protocolo sigue las pautas de bioseguridad de Christian Medical College, Vellore.

1. Selección del promotor más potente para obtener una expresión persistente y prolongada de los shRNAs

NOTA: Es imprescindible realizar un experimento de transducción utilizando vectores lentivirales con diferentes promotores que expresan proteínas de fluorescencia para identificar el promotor que proporciona una expresión estable y a largo plazo de shRNAs en la línea celular seleccionada para el experimento. Los promotores más utilizados para este propósito son los promotores hEF1α (factor de elongación humana 1α), hCMV (citomegalovirus humano) y SSFV (virus formador de foco del bazo) que expresan la proteína de fluorescencia verde (GFP) (Figura 2A).

1. Realice el recuento de celdas mediante el método de exclusión de azul tripano. Suspender las células MV4-11 AraC R en medio RPMI al 10% (RPMI con FBS al 10% suplementado con penicilina 100 U/mL y estreptomicina 100 U/mL) que contengan 8 μg/mL de polibreno. Sembrar 1 x 10⁶ células en 1.5 mL de medio/pocillo de una placa de seis pocillos en triplicados.
2. Agregue diferentes volúmenes de lentivirus concentrados (por ejemplo, 10 μL, 20 μL y 40 μL dependiendo del título de los lentivirus) a cada pozo. Agite suavemente la placa para mezclar el contenido.
3. Realizar la espinfección por centrifugación a 920 x g a 37 °C durante 90 min.
4. Incubar inmediatamente las placas en una incubadora de CO₂ (5% CO₂ a 37 °C).
5. Observe la expresión de GFP después de 48 h bajo un microscopio de fluorescencia para garantizar una transducción exitosa.
6. Cuantificar la expresión de GFP por citometría de flujo después de 72 h para evaluar la eficiencia de transducción.
7. Cultive las células durante un total de 2 semanas y controle la expresión de GFP periódicamente mediante citometría de flujo. La reducción en la expresión de GFP medida por la intensidad media de fluorescencia y el porcentaje de células GFP+ indican silenciamiento promotor.
8. Clasifique las células GFP + en el día 10 y cultive las células durante 1 semana después de la clasificación. Compruebe la expresión GFP periódicamente durante la referencia cultural.
9. Utilice las celdas no transducidas para establecer la puerta. Una población más allá de la escala 1 x^{10 1} hacia la derecha en el eje x se considera una población positiva para GFP.
10. Elija el promotor que muestre una expresión persistente de GFP en el cultivo prolongado de las células.

2. Preparación de la biblioteca de shRNA del factor epigenético humano lentiviral agrupado

1. Cultivo de células 293T (a un número de paso bajo con una buena tasa de proliferación) en tres placas de cultivo celular de 10 cm con 8 mL de medio DMEM al 10% (DMEM con FBS al 10% que contiene 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina) en cada placa.
2. Una vez que las células alcancen el 60% de confluencia, reemplace el medio con un medio completo.
3. Prepare la mezcla de transfección (como se describe en la Tabla 1) que contenga medio libre de suero, empaque de lentiviral (psPAX2) y plásmido de envoltura (pMD2.G), plásmidos de biblioteca agrupados y, finalmente, el reactivo de transfección.
4. Toca la mezcla para mezclarla bien e incuba a temperatura ambiente durante 15 min.
5. Agregue la mezcla de transfección a las células 293T y mezcle suavemente girando las placas. Incubar las placas en una incubadora de CO₂ (5% CO₂ a 37 °C). Cambiar el medio después de 24 h.
6. Después de 48 h, verifique la expresión de GFP bajo un microscopio de fluorescencia para garantizar una alta eficiencia de transfección en las células 293T.
7. Recoja los sobrenadantes del virus después de 48 h, 60 h y 72 h y guárdelos a 4 °C. Agregue un medio fresco (8 ml) en cada punto de tiempo después de recolectar el virus.
8. Agrupar los sobrenadantes del virus. El volumen total de los virus agrupados será: ~8 mL/placa x 3 colecciones= ~24 mL/placa; ~24 mL/placa x 3 placas = ~72 mL de 3 placas.
9. Filtre los virus agrupados con el filtro de 0,4 μm.
10. Para obtener un título alto de virus, concentre los virus agrupados por ultracentrifugación. Transfiera el sobrenadante del virus filtrado a dos tubos de 70 Ti (32 ml/tubo) y centrífuga a 18.000x g durante 2 h con aceleración y desaceleración lentas. Utilice un rotor y una centrífuga preenfriados a 4 °C.
11. Saque los tubos de la centrífuga suavemente y retire el sobrenadante por completo.
12. Usando una micropipeta, resusped suavemente el pellet en 400 μL de DMEM (sin FBS y antibióticos). Incubar en el hielo durante 1 h y mezclar los pellets de ambos tubos.
13. Alícuota los virus y congela a -80 °C.
    NOTA: Los tubos y los virus deben mantenerse en hielo durante los pasos 2.10.-2.13. Evite la espuma mientras resuspende el virus con el medio simple. El medio debe mantenerse a 4 °C.
14. Calcule la concentración (x) de virus de la siguiente manera:
    Volumen total antes de la concentración = 72 ml (72.000 μL)
    Volumen después de la concentración = 400 μL
    La concentración = 72.000/400= 180x

3. Estimación de la eficiencia de transducción de lentivirus

1. Transducir células 293T con el virus concentrado en diferentes volúmenes (2 μL, 4 μL, 8 μL) para confirmar la preparación exitosa de lentivirus.
   NOTA: Si los virus concentrados muestran altas eficiencias de transducción (>50%) en pequeños volúmenes (1-2 μL), es aconsejable diluir el virus concentrado en las cantidades deseadas (100x a 75x).
2. Diluir el virus concentrado a 100x con DMEM (sin FBS y antibióticos) para realizar experimentos de titulación en la línea celular MV4-11 AraC R.
3. Sembrar 1 x 10⁶ celdas (línea celular MV4-11 AraC R en 1.5 mL de medio RPMI al 10% que contiene polibreno 8 μg/mL) en un pocillo de una placa de seis pocillos. Prepare cuatro pocillos para la transducción con diferentes volúmenes de virus.
4. Agregue cuatro volúmenes diferentes (por ejemplo, 1 μL, 1.5 μL, 2 μL y 2.5 μL) de virus 100x.
5. Realizar la espinfección por centrifugación de la placa a 920 x g durante 90 min a 37 °C.
6. Después de 72 h, mida el porcentaje de células GFP+ por citometría de flujo.
7. Determinar el volumen de los virus para obtener una eficiencia de transducción del 30%. Esta baja eficiencia de transducción es para garantizar la integración de shRNA único por célula.

4. Transducción de la biblioteca epigenética agrupada de SHRNA en la línea celular resistente a los medicamentos

1. Mantener la línea celular objetivo MV4-11 AraC R a una densidad de 0,5 x 10⁶ celdas/ml. Asegúrese de que las células estén en la fase de crecimiento exponencial en cultivo.
2. Calcule el número de células que se tomarán para el experimento como se indica a continuación en función del número de integrantes virales.
   Número de células requeridas para la transducción = 5,485 (número de shRNAs) × 500 (representación de shRNA doble) / 0.25 (MOI) = 10,982,000 ~ 11 x 10⁶ células
3. Resuspend 1.1 x 10⁷ celdas en 16 mL de medio RPMI al 10%.
4. Añadir polibreno (8 μg/mL) y mezclar bien. Luego, agregue el volumen requerido de virus para obtener una eficiencia de transducción del 30% como se calculó en la sección anterior.
5. Sembrar todas las células en una placa de seis pocillos a una densidad de 1 x 10⁶ celdas/1.5 mL de medio RPMI al 10% por pozo.
6. Centrifugar la placa durante 90 min a 920 x g a 37 °C.
7. Incubar la placa durante la noche en una incubadora de CO₂ (5% de CO₂ a 37 °C).
8. Después de 24 h, cambie el medio y transfiera las células transducidas a un matraz T-75.
9. Después de 48 h, verifique el GFP bajo un microscopio de fluorescencia para garantizar una transducción exitosa.
10. Después de 72 h, cuantificar el porcentaje de células GFP+ por citometría de flujo.

5. Enriquecimiento de células GFP positivas

NOTA: Expanda las células transducidas cultivándolas a una densidad de 0,5 x 10⁶ células/ml durante 5-7 días. Estas células son una población mixta de transducidos y no transducidos, seleccionados en función de GFP por clasificación, como se menciona en el siguiente paso.

1. Realice la clasificación de flujo de células transducidas GFP + con los ajustes de clasificación de flujo establecidos como de alta pureza y bajo rendimiento. Utilice las celdas no transducidas para establecer la puerta. Una población más allá de 1 x 10² hacia la derecha se considera una población positiva.
2. Recolectar las células clasificadas en RPMI al 5% (RPMI con FBS al 5% suplementado con penicilina 100 U/mL y estreptomicina 100 U/mL).
3. Cultive las células clasificadas en un medio RPMI al 10%.
4. Después de 72 h, realice la estimación posterior a la clasificación del porcentaje de células GFP + para garantizar una eficiencia de clasificación >95%.
   NOTA: Asegúrese de obtener ~ 3-5 x 10⁶ celdas positivas GFP después de la clasificación para obtener una representación de 450x a ~ 500x de la biblioteca shRNA.

6. Detección de abandono para identificar los factores epigenéticos que median la resistencia a los medicamentos

1. Cultive las células transducidas por la biblioteca de shRNA en 10% RPMI durante un máximo de 5 días. Criopreservar las células transducidas para futuros experimentos, si es necesario, antes del tratamiento farmacológico.
2. Centrífuga 1 x 10⁷ celdas por duplicado a 280 x g durante 5 min a 25 °C. Deseche el sobrenadante y guarde los gránulos a -80 °C. Estas muestras servirán como referencia de referencia para la biblioteca epigenética de SHRNA.
3. Cultive las células transducidas restantes como duplicadas (R1 y R2), cada una mantenida en un recuento de células que proporciona una representación 500x de la biblioteca.
4. Trate uno de los duplicados con el fármaco (10 μM de citarabina) (R2) y el otro sin el tratamiento farmacológico (R1).
5. Cambie el medio para los matraces con y sin el medicamento cada 72 h. Repita el cambio medio 3 veces para una exposición acumulativa al medicamento de 9 días.
6. Después de 9 días de tratamiento farmacológico, verifique la viabilidad de las células mediante el método de exclusión de azul de tripano.
7. Centrifugar las celdas restantes a 280 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspend las células en PBS estéril y lave las células. Centrifugadora a 280 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
8. Deseche el sobrenadante y almacene los gránulos a -80 °C para la extracción de ADN.

7. Amplificación de los shRNAs integrados por PCR

1. Extraer ADN de las células basales transducidas (T) (paso 6.2.) y de las células tratadas con el fármaco (R2) y no tratadas con el fármaco (R1).
2. Compruebe la concentración de la muestra con un fluorómetro.
3. Calcule la cantidad de ADN requerida para la PCR de la siguiente manera:
   5.485 (no. de shRNAs) × 500 (representación de shRNA) × 1 x 6.6⁻¹² (g/genoma diploide) = 15 μg de ADN
4. Someter las muestras a la primera ronda de PCR.
   NOTA: La mezcla de reacción de PCR se muestra en la Tabla 2 con las condiciones del termociclador. Los detalles de los cebadores se proporcionan en la Tabla suplementaria 1.
5. Configure múltiples reacciones que contengan 850 ng de ADN por tubo (para un total de 43 reacciones).
   NOTA: La primera ronda de PCR amplifica las regiones flanqueantes del shRNA dando como resultado un tamaño de amplicón de 397 pb.
6. Agrupe los productos de PCR y purifique los productos de PCR utilizando 3-4 columnas de un kit de purificación de gel / PCR estándar.
   NOTA: Los detalles se proporcionan en la Tabla 3.
7. Elute el producto en 50 μL de tampón de cada columna y agrupe los elutes.
8. Cuantificar el ADN y almacenarlo a -20 °C.
   NOTA: Los reactivos se tabulan en la Tabla 4 con las condiciones del termociclador. La PCR de segunda ronda utiliza los cebadores con la secuencia INDEX requerida para la multiplexación en NGS en una celda de flujo único. Por lo tanto, cada muestra debe etiquetarse con un índice diferente. Las secuencias de imprimación se proporcionan en la Tabla suplementaria 1.
9. Configure cuatro reacciones con 500 ng del producto primario de PCR en un volumen de reacción total de 50 μL para cada muestra y el control negativo.
10. Cargue todo el producto para electroforesis utilizando gel de agarosa TBE al 2% y confirme el tamaño de la banda utilizando una escalera molecular de 1 kb. El tamaño del amplicón es de 399 pb.
11. Visualice los productos de PCR en el sistema de documentación del gel.
12. Elimine la banda específica y purifique con un kit de purificación en gel.
    NOTA: Los cálculos para la purificación con el kit se proporcionan en la Tabla 3.
13. Elute en un volumen final de 30 μL de tampón de elución. La concentración aproximada de cada eluyente será de alrededor de 80-90 ng/μL con un volumen total de 30 μL.

8. Secuenciación de próxima generación y análisis de datos

1. Secuencia el producto purificado en gel a partir del paso 7.13. en un secuenciador de próxima generación (por ejemplo, Illumina) para obtener el recuento de lectura para los shRNAs agotados.
2. Recorte las secuencias de adaptadores de las lecturas FastQ generadas mediante el kit de herramientas Fastx (versión 0.7).
3. Alinee las lecturas filtradas con secuencias de referencia utilizando un alineador Bowtie con el parámetro de permitir dos desajustes. Asegúrese de que la longitud de lectura después del recorte del adaptador sea de alrededor de 21 pb.
4. Cargue los archivos utilizando el programa Samtools (versión 1.9). Utilice la opción Flagstat y calcule el resumen de alineación.
5. Cargue los archivos fastQ recortados en el software CRISPRCloud2 (CC2) (https://crispr.nrihub.org/) junto con las secuencias shRNA de referencia en forma de archivos FASTA y realice el análisis según las instrucciones.
   1. Haga clic en el enlace Iniciar análisis en el CC2.
   2. Seleccione el tipo de pantalla como pantallas supervivencia y abandono. Establezca el número de grupos y escriba el nombre de cada grupo.
   3. Cargue la biblioteca de referencia en formato de archivo FASTA. Los datos cargados se procesan. Haga clic en la URL de salida para obtener los resultados.
      NOTA: Este software utiliza un modelo beta-binomial con una prueba t de Student modificada para medir las diferencias en los niveles de sgRNA / shRNA, seguido de la prueba de probabilidad combinada de Fisher para estimar la significación a nivel de gen. Calcula los cambios totales estimados de_{log 2} veces (Log2Fc) de shRNAs para los factores epigenéticos entre las muestras tratadas (enriquecidas/agotadas) y las no tratadas (línea de base) con "valores p" y "valores FDR".
6. Asegúrese de que el valor de FDR sea "Negativo" para una pantalla de abandono y "Positivo" para una pantalla de supervivencia.
   NOTA: CC2 es una plataforma de análisis para contar las lecturas y calcular la representación de pliegues (enriquecimiento o agotamiento) de shRNAs entre muestras.
7. Identifique los shRNAs significativamente enriquecidos y agotados (FDR <0.05) a partir de los resultados de CC2.
   NOTA: Hay 5-24 shRNAs contra cada factor. Compruebe los valores de FDR para cada uno de los shRNAs; considere el FDR, que es <0.01, y tome un promedio para los SHRNA seleccionados. Considere los 40 mejores éxitos. Grafique el gráfico para los factores seleccionados en función de los valores negativos de Log2Fc o FDR. Asegúrese de que los shRNAs no dirigidos también tengan valores FDR significativos para garantizar la autenticidad de los datos, ya que sirven como shRNAs de control.

Resultados

El flujo de trabajo de filtrado general se muestra en la Figura 1A. La citotoxicidad in vitro del MV4-11 AraC R (48 h) reveló que el IC50 a citarabina en el MV4-11 AraC R era mayor que el MV4-11 P (Figura 1B). Esta línea celular se utilizó en el estudio como modelo para el cribado de los factores epigenéticos responsables de la resistencia a la citarabina.

La Figura 2A muestr...

Discusión

La interferencia de ARN (ARNi) se utiliza ampliamente para estudios de genómica funcional, que incluyen la detección de siRNA y shRNA. El beneficio de los shRNA es que pueden incorporarse a vectores plásmidos e integrarse en el ADN genómico, lo que resulta en una expresión estable y, por lo tanto, un derribo más prolongado del ARNm objetivo. Un cribado de biblioteca de shRNA agrupado es robusto y rentable en comparación con los cribados convencionales (siRNA). Identificar la esencialidad de una clase específica d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
100 bp Ladder Hyper Ladder	BIOLINE	BIO-33025
1kb Ladder Hyper Ladder	BIOLINE	BIO-33056
Agarose	Lonza Seachekm	50004
Betaine (5mM)	Sigma	B03001VL
Boric Acid	Qualigens	12005
Cell culture plasticware	Corning	as appicable
Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride	Sigma	C1768-500MG
DMEM	MP BIO	91233354
DMSO	Wak Chemie GMBH	Cryosure DMSO 10ml
EDTA	Sigma	E5134
Ethidium Bromide	Sigma	E1510-10 mL
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044
Gel/PCR Purification Kit	MACHEREY-NAGEL	REF 740609.50
Gibco- RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	23400021
Glacial Acetic Acid	Thermo	Q11007
hCMV GFP Plasmid	Transomics	TransOmics Promoter selection KIT
hEF1a GFPlasmid	Transomics	TransOmics Promoter selection KIT
HEK 293T	ATCC	CRL-11268
HL60 cell line	ATCC	CCL-240
KOD Hot Start Polymerase	Merck	71086
Molm13 cell line	Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA	Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA
MV4-11 cell line	ATCC	CRL-9591
Penicillin streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
psPAX2 and pMD2.G	Addgene	Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	REF Q32854
SFFV  GFP Plasmid	Transomics	TransOmics Promoter selection KIT
shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics	Transomics	Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14
Trans-IT-LTI Mirus	Mirus	Mirus Catalog Number: MIR2300
Tris	MP Biomedicals	0219485591
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154-100ML
Ultra centrifuge Tubes	Beckman Coulter	103319
Equipments
5% CO2 incubator	Thermo Fisher
BD Aria III cell sorter	Becton Dickinson
Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation	Beckman coulter
Centrifuge	Thermo Multiguge 3SR+
ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system)	Fluro Chem
Leica AF600	Leica
Light Microscope	Zeiss Axiovert 40c
Nanodrop	Thermo Scientific
Qubit 3.0 Fluorometer	Invitrogen
Thermal Cycler	BioRad