Enfoques de fenotipado múltiple para caracterizar los sistemas radiculares de la caña de azúcar

Resumen

La caracterización de los rasgos del sistema radicular es una de las áreas de investigación que aún está en pañales, particularmente en la caña de azúcar. La integración de múltiples enfoques para el fenotipo preciso de las raíces de la caña de azúcar conduce a resultados integrales y holísticos, lo que permite la utilización de rasgos y mecanismos identificados para el mejoramiento convencional y molecular.

Resumen

Las raíces son los principales conductores de agua y nutrientes y desempeñan un papel vital en el mantenimiento del crecimiento y el rendimiento en entornos estresantes. El estudio de las raíces de las plantas plantea dificultades metodológicas en la evaluación y el muestreo in situ , lo que es especialmente cierto para la caña de azúcar (Saccharum spp.). Los métodos tradicionales durante la década de 1920 documentaron la variación genotípica en los sistemas de raíces de la caña de azúcar, después de lo cual se informaron pocos estudios sobre los rasgos de la raíz de la caña de azúcar per se hasta hace poco. Además de la morfología, las características de la rizosfera, incluidos los efectos alelopáticos y/o la afinidad por la simbiosis microbiana, determinan el establecimiento y la supervivencia de las plantas.

En última instancia, los sistemas radiculares definen la productividad aérea de la caña de azúcar. Con el ímpetu de las variedades resistentes al clima, se está volviendo más relevante explorar y utilizar la variabilidad en los rasgos del sistema radicular de la caña de azúcar. Este artículo describe enfoques múltiples para el fenotipado de raíces de caña de azúcar, incluida la excavación de campo mediante muestreo en zanjas, el uso de un muestreador de núcleos de raíces, plataformas elevadas para el muestreo de raíces y el cultivo de plantas bajo cultivo hidropónico, empleados por un equipo de científicos del Consejo Indio de Investigación Agrícola-Instituto de Mejoramiento de Caña de Azúcar (ICAR-SBI).

La excavación de campo mediante muestreo de zanjas es imprescindible para evaluar las raíces de las plantas en su entorno de crecimiento natural. El uso de plataformas elevadas que simulan las condiciones del campo y un muestreador de núcleos de raíces son enfoques alternativos, con una reducción considerable del tiempo, un tamaño de muestra uniforme y una menor pérdida de material radicular. El cultivo hidropónico de plantas permite el estudio de la morfología, las características anatómicas y la biología de la rizosfera, incluida la exudación de compuestos orgánicos y las interacciones microbianas. Los datos generados a partir de diferentes experimentos utilizando diversos métodos de muestreo se suman a la gran cantidad de información sobre las características del sistema radicular de la caña de azúcar.

Introducción

La caña de azúcar (Saccharum spp.), una importante fuente de alimento y bioenergía, es un importante cultivo industrial adecuado para el cultivo en muchos países con condiciones climáticas tropicales y subtropicales. Debido a la vía fotosintética C₄ para la asimilación de carbono, la caña de azúcar es altamente productiva y utiliza eficientemente insumos agrícolas como el agua y los fertilizantes. El procesamiento poscosecha de la caña de azúcar produce productos económicamente valiosos como el azúcar y el azúcar moreno, junto con sus subproductos: melaza, etanol y energía. La caña de azúcar es producida por casi 100 países en una superficie de 25,97 Mha, que es aproximadamente el 1,5% del total de la tierra cultivable. Solo la India contribuye con el 16% de la producción mundial de caña de azúcar (aproximadamente 306 Mt), con una productividad promedio de 70 t·^{ha-1 1}. Los principales estreses abióticos que afectan drásticamente la producción de caña de azúcar incluyen déficits de agua, anegamiento, temperaturas extremas y propiedades del suelo como deficiencia de nutrientes, salinidad, sodicidad y alcalinidad. El mayor desafío para el desarrollo de cultivos abióticos tolerantes al estrés es identificar rasgos específicos que confieran una ventaja sustancial en el rendimiento en condiciones de estrés.

Varios aspectos de la fisiología de la caña de azúcar son poco conocidos, incluida la relación raíz-brote, que afecta drásticamente la productividad de la caña. La raíz de la caña de azúcar no está tan bien estudiada como los brotes, aunque los diferentes tipos, como las raíces esquejadas, las raíces de los brotes y las raíces adultas, pueden ser distintas en el desarrollo con diferentes funciones. Se han observado diferencias genotípicas con respecto al número y longitud de las raíces escarchadas que emergen durante la germinación². Las raíces de esquete están implicadas en la germinación de las yemas de la caña de azúcar, asegurando el establecimiento temprano del cultivo, y luego son reemplazadas por raíces de brotes, que son robustas, que emergen de la base del brote^{en desarrollo 3}. Las ramas finas observadas en las raíces de los brotes ayudan a anclar las plantas jóvenes y ayudan a la absorción de agua y nutrientes hasta que son reemplazadas por raíces de brotes. Al igual que las raíces de los esquejes, las raíces de los brotes también surgen de los primordios de las raíces presentes en los entrenudos inferiores no expandidos de la caña.

Como las raíces de los brotes persisten en la planta durante más tiempo, son de 4 a 10 veces más gruesas que las raíces de los brotes. Las raíces de los brotes constituyen el único sistema radicular de la caña de azúcar, con un papel importante en el crecimiento y desarrollo posteriores. El vigor de las raíces de los brotes se asocia positivamente con el vigor vegetativo general de la planta. El desarrollo continuo de las raíces resultante de la renovación de las raíces escogidas y las raíces de los brotes da lugar al "sistema radicular adulto" de la caña de azúcar, que se adapta constantemente a las condiciones ambientales prevalecientes. En general, un sistema radicular más profundo y prolífico hace que el cultivo disponga de más agua y nutrientes que una distribución más superficial de las raíces. Las disecciones periódicas revelaron que, cuando el contenido de humedad del suelo era alto, se observaron sistemas radiculares poco profundos, mientras que se desarrolló un sistema radicular mucho más profundo a medida que el nivel freático^{descendía 2}. El sistema radicular de la caña de azúcar permanece activo incluso después de la cosecha del cultivo, lo que contribuye al crecimiento del cultivo de soca hasta que emergen nuevas raíces de brotes de las yemas subterráneas⁴. El ángulo de la raíz y el nivel de ramificación de la raíz son dos factores importantes que determinan el volumen de suelo explorado por las raíces de las plantas. El ángulo de la raíz, un rasgo genotípico, puede alterarse mediante la cría convencional o enfoques moleculares para mejorar la tolerancia al estrés biótico y abiótico. Por el contrario, el nivel de ramificación de las raíces está influenciado principalmente por el medio ambiente, lo que requiere un monitoreo periódico del desarrollo de las raíces y su respuesta a las condiciones localizadas del suelo.

Las características anatómicas de las raíces de la caña de azúcar han sido examinadas para determinar las diferencias con respecto al genotipo y el medio ambiente. La anatomía de las raíces sett en la caña de azúcar se asemeja a la de las raíces maduras en otras gramíneas como el maíz, en las que la corteza comprende capas celulares bien diferenciadas en un patrón regular. La endodermis está suberizada, seguida de un periciclo de una sola capa. Los elementos metaxilema son los principales conductores de iones de agua y nutrientes, dispuestos radialmente e intercalados con grupos de floema, este último compuesto por un elemento tamiz con dos células compañeras. La gran masa central de células indiferenciadas forma la médula de la raíz. Las características anatómicas distintivas de los cultivares de caña de azúcar corresponden a las propiedades hidráulicas de la raíz, lo que influye en el movimiento del agua. Los primeros estudios sobre las diferencias en los rasgos anatómicos de la raíz de la caña de azúcar revelaron que, en condiciones de bajo estrés hídrico, se observó un engrosamiento pronunciado de la pared celular en las capas inmediatamente internas de la endodermis, entre la médula y la región vascular, y alrededor de los vasos⁵. Estas células engrosadas pueden ser una adaptación para evitar el flujo inverso de la savia y para la resistencia mecánica durante el estrés.

Algunos rasgos importantes implicados en la resistencia a la sequía de la caña de azúcar incluyen el grosor relativo y el número de capas exodérmicas, la proporción de corteza a estela, los espacios intercelulares en la corteza y el engrosamiento de las puntas de los pelos de la raíz. Las relaciones entre el área ocupada por las células corticales y el área ocupada por los tejidos estelares de las raíces de los brotes son significativamente diferentes entre los cultivares de caña de azúcar, con amplia variabilidad con respecto al área de la estela⁶. La conductividad hidráulica de las raíces de la caña de azúcar está relacionada con el tamaño y el número de elementos del metaxilema en las raíces de los brotes. Es probable que las capas celulares hidrofóbicas dentro de la raíz definan zonas de movimiento de agua apoplástica. Las bandas de Casparia suberizadas se encuentran en la endodermis y en la hipodermis (denominada exodermis), que sirven como barreras hidrofóbicas. La desintegración de las células corticales conduce a la formación de aerénquima lisógeno en las raíces más viejas y en las plantas sometidas a condiciones hipóxicas, independientemente de la edad de desarrollo. La formación de aerénquima durante el estrés anegamiento se correlaciona con el mantenimiento del crecimiento en variedades resistentes⁷.

La morfología y anatomía de las raíces de Erianthus arundinaceus [Retzius] Jeswiet (géneros relacionados con Saccharum spp.) están implicadas en su fuerte tolerancia a los estreses ambientales⁸. Las raíces de Erianthus arundinaceus exhiben raíces nodales distribuidas en ángulos pronunciados, con pelos densos en las raíces para facilitar la absorción de iones de agua y nutrientes de las zonas más profundas del suelo. El sistema de raíces profundas consta de muchas raíces nodales que crecen con ángulos de crecimiento pronunciados. El diámetro de las raíces nodales se correlaciona con el tamaño y el número de vasos grandes del xilema, los primeros variando ampliamente de 0,5 mm a 5,0 mm. Estas raíces nodales también forman una vaina rizomatosa, con una hipodermis que muestra esclerénquima lignificado en la corteza externa (exodermis), aerénquima lisógeno en la porción media de la corteza y gránulos de almidón en la estela. Además de la arquitectura y los rasgos morfológicos, los compuestos orgánicos exudados por las raíces desempeñan un papel importante en la determinación de la germinación, el establecimiento y la supervivencia de las plantas, con efectos alelopáticos plausibles y/o afinidad por la simbiosis microbiana.

La actividad enzimática de la raíz y los detalles más finos de la morfología, incluyendo la pigmentación del sombrero de la raíz y el potencial de rejuvenecimiento después de la lesión, fueron documentados en variedades de caña de azúcar cultivadas bajo cultivo hidropónico⁹. El crecimiento de las raíces muestra una respuesta altamente plástica a los cambios en el entorno del suelo, tanto en términos de la forma como del tamaño del sistema radicular. La variedad de caña de azúcar más eficiente sería una que tenga pocos o un número óptimo de brotes, con un número correspondientemente menor de raíces, lo que ayuda a una mejor supervivencia en condiciones de estrés. Por lo tanto, el estudio sistemático del sistema radicular debe constituir un componente importante de cualquier programa de mejoramiento de cultivos¹⁰. La mayoría de los experimentos centrados en las raíces se basan principalmente en aspectos de desarrollo, mientras que a menudo falta un enfoque en la plasticidad funcional¹¹. Aparte de la distribución estructural, la plasticidad funcional de la raíz juega un papel crucial en la supervivencia bajo estrés y, por lo tanto, apoyaría a los mejoradores en sus esfuerzos por incluir rasgos del sistema radicular en la línea de selección para la tolerancia al estrés abiótico y mejorar la robustez de la caña de azúcar.

Teniendo en cuenta su importancia para mantener el crecimiento y el rendimiento en ambientes estresantes, es esencial explorar y utilizar la variabilidad inherente en los rasgos del sistema radicular de la caña de azúcar. El énfasis en la selección de los componentes, las características y los mecanismos que imparten sistemas radiculares superiores es el camino a seguir para mejorar el rendimiento de los cultivos en condiciones climáticas cambiantes. La evaluación fenotípica es un proceso largo y costoso; Sin embargo, la integración de enfoques múltiples añadiría un enorme valor a su utilidad en el mejoramiento de cultivos. En este manuscrito, se describen cuatro enfoques diferentes para el fenotipado de raíces en la caña de azúcar, cada uno con su propio conjunto de méritos y deméritos, lo que implica que se requiere un esfuerzo concertado para llegar a resultados integrales y holísticos.

Protocolo

1. Excavación de campo por muestreo de zanjas

1. Cultivar híbridos comerciales de caña de azúcar (en lo sucesivo denominados "variedades") en el campo a partir de esquejes de dos yemas plantados con una separación entre hileras de 120 cm, con 90 cm dentro de las hileras, siguiendo el paquete de prácticas recomendadas (COP) para asegurar un buen establecimiento y crecimiento de los cultivos.
2. Al final de la fase de madurez del cultivo, emplee una excavadora para cavar una zanja (1,5 m de profundidad y 1,0 m de ancho) en el campo. A través de un chorro de agua continuo, asegúrese de que los suelos de las zonas de raíces se limpien sin dañar las raíces (Figura 1).
3. Cuando la tierra adherida se afloje, arranque la caña junto con el sistema radicular y llévela al laboratorio para la medición manual del número de raíces, la longitud de la raíz, el volumen y el peso.

Figura 1: Método de muestreo de zanjas para la excavación de raíces en el campo. (A) Zanja excavada lateralmente a lo largo del campo, (B) chorro de agua y (C) vista interior que muestra la profundidad de la zanja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Muestreador de núcleo de raíz para reducir los errores de muestreo

1. Utilice un muestreador cilíndrico de raíz de 61 cm de altura y 16 cm de diámetro con un peso de 8 kg, fabricado con material de acero dulce (MS) para el muestreo de raíz de caña de azúcar en el campo. Proporcione un borde afilado en el borde inferior del muestreador para facilitar la penetración mientras se inserta en el suelo. Proporcione a la parte superior collares de 3 cm de diámetro para levantar el muestreador (Figura 2).
2. Cultive variedades de caña de azúcar en el campo a partir de esquejes de dos yemas plantadas a una distancia entre hileras de 120 cm, con 90 cm dentro de las hileras, siguiendo el COP recomendado para garantizar un buen establecimiento y crecimiento del cultivo.
3. En la fase de madurez del cultivo, fije el borde superior del muestreador al brote/caña primario y martillee continuamente para alcanzar la profundidad de suelo deseada (45 cm). Levante toda la masa de tierra en el muestreador y lávela cuidadosamente con agua corriente para separar las raíces adheridas.
4. Después de lavar a fondo las raíces, registre el volumen, la superficie, la longitud y el peso mediante medición manual, así como extendiendo las raíces en bandejas transparentes para escanear y analizar las imágenes digitalizadas correspondientes utilizando el software de referencia (consulte la Tabla de materiales).

Figura 2: Muestreador de núcleo raíz. (A) dimensiones, (B) vista superior y (C) sitio de muestreo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Estructura del fenotipado radicular para facilitar el muestreo en diferentes fenofases

1. Construir una estructura de fenotipado radicular que comprenda tres compartimentos adyacentes de dimensiones 4.5 m x 10.1 m para el muestreo de las raíces de la caña de azúcar, con provisiones para el desmantelamiento manual de las paredes laterales para revelar el sistema radicular subterráneo (hasta una profundidad de 80-100 cm) (Figura 3). Construir los muros laterales con losas prefabricadas de 1,8 m de largo, 30 cm de ancho y 4 cm de espesor.
2. Rellene y compacte la estructura con tierra de campo, dejando un espacio libre de ~ 20 cm, con orificios de drenaje adecuados para facilitar la aireación del suelo.
3. Siembre las yemas de los clones de germoplasma que comprenden Saccharum officinarum L., Saccharum spontaneum L., Saccharum barberi Jesw., Saccharum sinense Roxb., y Saccharum robustum Brandes y Jeswiet ex Grassl. (en lo sucesivo denominados "clones de Saccharum spp.") y dejarlos germinar durante 30 días en protrayentes que comprendan medios de enraizamiento (tierra roja: estiércol de granja: arena = 2:2:1). Trasplante los asentamientos uniformes y saludables a la estructura con un espaciamiento entre hileras de 90 cm, con 60 cm dentro de las hileras, siguiendo el POP recomendado para asegurar un buen establecimiento y crecimiento del cultivo.
4. Durante las fases de formación (60-120 días después de la siembra [DAP]) y de gran crecimiento (120-150 DAP), se deben retirar manualmente los muros laterales formados por las losas prefabricadas, seguidas de una pulverización continua del chorro de agua para exponer las raíces.
5. Desarraigue todo el sistema radicular y llévelo al laboratorio para la medición manual de la longitud, el volumen y el peso, y extienda las raíces en bandejas transparentes para escanear y analizar las imágenes digitalizadas correspondientes en el software de referencia (consulte la Tabla de materiales).
6. Imponga el estrés por sequía reteniendo el riego en uno de los compartimentos y tape los orificios de drenaje en el segundo compartimento para mantener la saturación del suelo y simular el estrés del anegamiento. Regar el tercer compartimento de acuerdo con el COP recomendado para mantener la capacidad del campo y servir de control.

Figura 3: Estructura del fenotipado de la raíz. (A) Dimensiones, (B) vista general de los tres compartimentos y (C) vista de un compartimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Cultivo hidropónico de plantas para estudiar la biología de la rizosfera

1. Fabricar un sistema hidropónico interno en un invernadero de ambiente controlado propicio para el cultivo de caña de azúcar para estudiar los detalles más finos de la biología de las raíces. Agregue ~ 15 L de solución nutritiva de Hoagland modificada (Tabla 1) a tanques de vidrio de dimensiones 20 cm x 20 cm x 50 cm, con aireación proporcionada por bombas de acuario (Figura 4).
2. Siembre las yemas de las variedades de caña de azúcar y clones de Saccharum spp. y déjelas germinar durante 30 días en protrayentes compuestas por médula de coco compostada. Trasplante las sedimentaciones uniformes y saludables a tanques hidropónicos con una frecuencia de tres sedimentaciones por tanque, teniendo cuidado de colocar toda la raíz en la solución nutritiva. Cubra los tanques con un paño negro para asegurarse de que las raíces no estén expuestas a la luz. Use una malla de plástico (20 cm x 20 cm) en el borde de los tanques de vidrio para sostener las plantas en posición vertical.
3. Al final de la fase de germinación (60 días), recoja los exudados de las raíces sumergiendo las raíces de las plantas intactas en 50 mL de solución trampa (agua estéril de doble destilación) durante 4 h (0800 h a 1200 h) durante el tiempo de máxima actividad fotosintética. Filtre la solución recolectada a través de papel de filtro Whatman, luego pásela a través de columnas de vidrio llenas de intercambio aniónico seguido de resinas de intercambio catiónico¹². Evapore las fracciones eluidas hasta que se sequen y almacene a -20 °C hasta su posterior procesamiento.
4. Analizar las muestras de exudado radicular procesadas por HPLC para la determinación de ácidos orgánicos¹² y por espectrofotometría para la estimación de fenólicos totales¹³, proteínas¹⁴, azúcares¹⁵ y aminoácidos¹⁶ según protocolo estándar.
5. Controle el crecimiento de la raíz a intervalos semanales para registrar la pigmentación de la punta de la raíz y la densidad del pelo de la raíz. Evaluar la actividad de las enzimas, peroxidasa¹⁷ y superóxido dismutasa¹⁸, y el contenido fenólico total¹⁹ al 3er mes según el protocolo estándar.
6. Evalúe la respuesta a la lesión de la raíz mediante la aplicación de un corte longitudinal en la raíz primaria hasta la punta de la raíz con una cuchilla quirúrgica estéril y controle los cambios periódicamente.

Químico	Concentración final
Nitrato de potasio	0,608 g· L-1
Nitrato de calcio	1.415 g· L-1
Dihidrógeno fosfato de potasio	0,164 g· L-1
Sulfato de magnesio	0,560 g· L-1
EDTA-sal monosódica férrica	6.00 g·250L-1
Ácido bórico	1,43 g·250L-1
Cloruro de manganeso tetrahidratado	0,91 g·250L-1
Sulfato de zinc	0,11 g·250L-1
Supfato cúprico	0,04 g·250L-1
Ácido molibdico	0.01 g250L-1

Tabla 1: Composición de la solución nutritiva modificada para el cultivo hidropónico de caña de azúcar.

Figura 4: Configuración hidropónica. La configuración (A) personalizada para el cultivo de caña de azúcar y (B) cultivo de 5 meses (tela negra quitada solo con fines fotográficos). Esta figura ha sido modificada a partir de Hari et ^al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Variación en los rasgos morfológicos de la raíz de las variedades de caña de azúcar
En la Figura 5A, B se presentan imágenes representativas del sistema radicular en Co 62175, excavadas en el campo mediante muestreo en zanjas y cultivadas en una configuración hidropónica. Se observaron raíces largas (~100 cm) en las variedades Co 62175 y Co 99006, mientras que Co 99006 registró el mayor peso de raíz (127 g·

Discusión

Los sistemas radiculares definen la productividad aérea de la caña de azúcar, por lo que es necesario explorar y comprender a fondo todas sus facetas para el desarrollo de variedades resistentes al clima. Un equipo de científicos del ICAR-SBI, compuesto por fisiólogos de plantas, un microbiólogo, un ingeniero agrónomo, un bioquímico y fitomejoradores, empleó enfoques múltiples para el fenotipado de las raíces de la caña de azúcar, incluida la excavación de campo mediante mu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aeration pump with pipeline accessories	Purchased from local sources	NA	Used for hydroponic culture of sugarcane
Boric acid	Sisco Research Laboratories, India	80266	Preparation of modified Hoagland's solution
Calcium nitrate	Central Drug House, India	27606	Preparation of modified Hoagland's solution
Composted coir pith	Purchased from local sources	NA	Used for germinating sugarcane setts
Cupric sulphate	Sisco Research Laboratories, India	38869	Preparation of modified Hoagland's solution
DEAE-cellulose	Sisco Research Laboratories, India	10529	anion exchange resin for processing of root exudates
EDTA-ferric monosodium salt	Sisco Research Laboratories, India	59389	Preparation of modified Hoagland's solution
Farm yard manure	Purchased from local sources	NA	Used for germinating sugarcane setts
Glass tanks	Fabricated in-house	NA	Used for hydroponic culture of sugarcane
HPLC	Agilent Technologies	1200 Infinity	Quantification of organic acids in root exudates
Magnesium sulphate	Sisco Research Laboratories, India	29117	Preparation of modified Hoagland's solution
Manganese chloride	Sisco Research Laboratories, India	75113	Preparation of modified Hoagland's solution
Molybdic acid	Sisco Research Laboratories, India	49664	Preparation of modified Hoagland's solution
Potassium dihydrogen phosphate	Central Drug House, India	29608	Preparation of modified Hoagland's solution
Potassium nitrate	Central Drug House, India	29638	Preparation of modified Hoagland's solution
Protrays	Fabricated in-house	NA	Used for germinating sugarcane setts
Red soil	Purchased from local sources	NA	Used for germinating sugarcane setts
Root core sampler	Fabricated in-house	NA	Used for in situ root sampling
Sand	Purchased from local sources	NA	Used for germinating sugarcane setts
Seralite-120	Sisco Research Laboratories, India	14891	cation exchange resin for processing of root exudates
Supporting frame	Purchased from local sources	NA	Used for hydroponic culture of sugarcane
Water motor pump	Purchased from local sources	NA	Used for hydroponic culture of sugarcane
Whatman filter paper grade 1	Universal Scientific	1001090	Processing of root exudates
WinRhizo PRO (software)	Regent Instruments Inc., Canada	STD4800	Two-dimensional root scanner with software for analysis of roots
Zinc sulphate	Sisco Research Laboratories, India	76455	Preparation of modified Hoagland's solution