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Resumen

Este artículo describe un protocolo experimental que utiliza espectrometría de masas de movilidad de iones por electrospray, cálculos cuánticos semiempíricos y disociación inducida por colisión de umbral resuelta por energía para medir la termoquímica relativa de la disociación de complejos metálicos ternarios relacionados.

Resumen

Este artículo describe un protocolo experimental que utiliza electrospray-ion mobility-mass spectrometry (ES-IM-MS) y energía resuelta umbral de disociación inducida por colisión (TCID) para medir la termoquímica de la disociación de complejos ternarios [amb+M(II)+NTA]- cargados negativamente en dos canales de producto: [amb+M(II)] + NTA o [NTA+M(II)]-  + amb, donde M = Zn o Ni y NTA es ácido nitrilotriacético. Los complejos contienen uno de los heptapéptidos alternativos de unión metálica (amb) con las estructuras primarias acetil-His 1-Cys 2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7 o acetil-Asp 1-Cys 2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7, donde los aminoácidos' Aa1,2,6,7 Las posiciones son los sitios potenciales de unión de metales. Los estados estacionarios optimizados por geometría de los complejos ternarios y sus productos se seleccionaron a partir de cálculos de química cuántica (actualmente el hamiltoniano semiempírico PM6) comparando sus energías electrónicas y sus secciones transversales de colisión (CCS) con las medidas por ES-IM-MS. A partir de los cálculos de frecuencia de PM6, los parámetros moleculares del complejo ternario y sus productos modelan las intensidades dependientes de energía de los dos canales de productos utilizando un método TCID competitivo para determinar las energías umbral de las reacciones que se relacionan con las entalpías 0 K de disociación (ΔH0). Las correcciones térmicas y de entropía de la mecánica estadística utilizando las frecuencias rotacionales y vibracionales PM6 proporcionan las entalpías de disociación de 298 K (ΔH298). Estos métodos describen una rutina EI-IM-MS que puede determinar la termoquímica y las constantes de equilibrio para un rango de complejos de iones metálicos ternarios.

Introducción

Este estudio describe una nueva técnica utilizando un espectrómetro de masas de movilidad iónica disponible comercialmente que permite la determinación de la termoquímica relativa para la disociación de un complejo metálico ternario de unión metálica alternativa (amb) [amb + M (II) + NTA], donde M = Zn o Ni y NTA = ácido nitrilotriacético (Figura 1). Estas reacciones modelan la disociación de la proteína recombinante marcada con AMB unida al metal inmovilizado con NTA durante la cromatografía de afinidad metálica inmovilizada (IMAC)1,2. Como ejemplo, este método se describe utilizando las etiquetas de heptapéptido amb de amb A y H (Figura 2) (elegidas de los estudios previos 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ) que exhiben propiedades de unión de Zn(II) y Ni(II) y, por lo tanto, tienen aplicaciones potenciales como etiquetas de purificación. Sin embargo, el proceso descrito se puede utilizar para evaluar las energías termoquímicas en cualquier sistema organometálico. Estos péptidos amb tienen sitios de unión a metales en las posiciones Aa1-Aa 2 y Aa6-Aa 7 que compiten con los sitios de carboxilato y amina de la NTA. Los tres aminoácidos de amb central proporcionan un espaciador (Gly3), la bisagra para los dos brazos (Pro4) y una interacción catiónica π-metal de larga distancia (Tyr5).

El estado general de carga 1− de los complejos [amb+M(II)+NTA]- está determinado por el estado de protonación de sus posibles sitios de unión. Dado que hay Ni(II) o Zn(II) con el estado de oxidación 2+, debe haber una red de tres sitios desprotonados cargados negativamente. El modelado molecular de los complejos [amb+M(II)+NTA]- predice que estos son dos protones del NTA y un protón del amb (es decir, [amb-H+M(II)+NTA-2H]-). Los canales del producto contienen una especie iónica y una especie neutra (es decir, [NTA-3H+M(II)]- + amb o [amb-3H+M(II)]- + NTA). En el manuscrito, "-3H" está excluido en los nombres de los complejos, pero el lector debe saber que el -3H está implícito. El instrumento mide las intensidades relativas de las dos especies iónicas de masa a carga (m/z). Un atributo importante de los análisis ES-IM-MS es que permite el examen de la reactividad de una especie específica m/z, como se utiliza aquí y en estudios amb anteriores 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.

La adquisición de datos termoquímicos para grandes complejos utilizando disociación inducida por colisión es un tema de gran interés13,14. Las metodologías, incluido el método cinético, no son propicias para ajustar los datos en un rango de energías, ni tienen en cuenta los entornos de colisión múltiple15,16,17,18. Aquí, el método CID de umbral (TCID), desarrollado utilizando espectrometría de masas en tándem de haz de iones guiado por Armentrout, Ervin y Rodgers, se aplica19 a una nueva plataforma de instrumentos ES-IM-MS utilizando guías de iones de onda viajera. El método TCID permite el análisis termoquímico relativo de la disociación de los complejos ternarios en sus dos canales de producto e incluye una ley de umbral que describe la transferencia de energía de colisión entre la energía de traslación del reactivo (complejo ternario en esta investigación) y un gas objetivo inerte (argón en este caso). El método incluye la integración sobre la distribución interna de energía del reactivo20, las distribuciones de energía de traslación entre el reactivo y el gas objetivo 21, y las distribuciones de momento angular total22,23. Se incluye una probabilidad de disociación y una corrección estadística de Rice-Ramsperger-Kassel-Marcus (RRKM) de los cambios cinéticos resultantes de la ventana de tiempo limitada para la observación de los productos24. Para dos canales de productos independientes, el método TCID competitivo permite el ajuste simultáneo de los dos canales de productos competidores. La disociación del complejo es a través de un estado de transición orbital, que tiene las propiedades de los productos, pero se mantiene unido por un dipolo bloqueado25. El método TCID se incorpora al programa CRUNCH26, y aquí se describe el funcionamiento de la interfaz de usuario para evaluar la termoquímica de los dos canales de disociación de los complejos ternarios [amb+M(II)+NTA]-. El programa CRUNCH está disponible a petición de los desarrolladores26.

Protocolo

NOTA: La figura 1 muestra una descripción general del protocolo.

1. Preparación de los reactivos

  1. Compre péptidos amb liofilizados (>98% de pureza) y guárdelos en un congelador de -80 °C.
  2. Compre >99% de pureza de zinc (II) nitrato hexahidratado y níquel (II) nitrato hexahidratado.
    PRECAUCIÓN: El nitrato de níquel (II) hexahidratado presenta un peligro para el medio ambiente y la salud.
  3. Compre el ácido nitrilotriacético, polímeros de poli-DL-alanina, acetato de amonio de grado ultrapuro / traza, hidróxido de amonio, ácido acético glacial y acetonitrilo de grado HPLC.

2. Preparación de soluciones madre

  1. Péptido amb solución madre
    1. Preparar una solución acuosa de 12,5 mM de concentración de amb pesando 10-20 mg del péptido liofilizado utilizando no menos de tres cifras significativas y colocándolo en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,7 ml.
    2. Añadir el volumen adecuado de agua desionizada (>17,8 MΩ cm) al tubo de microcentrífuga. Cierre la tapa y mezcle bien con al menos 20 inversiones.
    3. Cree alícuotas de 50 μL a partir de la solución de 12,5 mM de amb y colóquelas en tubos de microcentrífuga marcados de 1,7 ml. Conservar las soluciones madre alícuotas a −80 °C.
  2. Soluciones de material de iones metálicos
    1. Preparar las soluciones acuosas de Zn(II) y Ni(II) de concentración de 12,5 mM pesando 10-30 mg del nitrato metálico hexahidratado utilizando no menos de tres cifras significativas y colocándolo en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,7 ml.
    2. Agregue la cantidad adecuada de agua DI al tubo de microcentrífuga. Cierre la tapa y mezcle bien con al menos 20 inversiones. Conservar 50 μL de solución madre alícuota a −80 °C.
  3. Soluciones de stock iónico NTA
    1. Preparar una solución acuosa de NTA pesando 10-30 mg de NTA utilizando no menos de tres cifras significativas y colocándola en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
    2. Agregue la cantidad adecuada de agua DI al NTA en el tubo de microcentrífuga para lograr una concentración final de 12.5 mM. Cierre la tapa y mezcle bien con al menos 20 inversiones. Conservar 50 μL de solución madre alícuota a −80 °C.
  4. Soluciones madre de acetato de amonio: Pesar 30,8 mg de acetato de amonio y añadir a 40 ml de agua DI para obtener una solución de 10 mM. Ajustar el pH de la solución de acetato de amonio a pH 7,7 con 1 mM de hidróxido de amonio.
  5. Solución madre de poli-DL-alanina: Haga una solución madre de poli-DL-alanina (PA) de 1 ml y 1,000 ppm disolviendo 1.0 mg de PA en agua DI. Mezclar exhaustivamente. Cree alícuotas de 50 μL y colóquelas en tubos de microcentrífuga etiquetados individualmente. Conservar la solución de 1.000 ppm a −80 °C.

3. Análisis de disociación inducida por colisión (CID) de la espectrometría de masas de movilidad de iones por electrospray (ES-IM-MS)

  1. Prepare el instrumento limpiando el tubo de entrada ES y el capilar metálico inyectando 500 μL de ácido acético glacial 0,1 M, seguido de 500 μL de hidróxido de amonio 0,1 M y, finalmente, 500 μL de solución de acetato de amonio de pH 7,7.
  2. Licuar la solución madre de 12,5 mM amb llevándola a temperatura ambiente. Crear una concentración final de 0,125 mM amb haciendo dos diluciones sucesivas con agua DI. Mezclar exhaustivamente después de cada dilución.
  3. Licuar la solución madre de iones metálicos de 12,5 mM llevándola a temperatura ambiente. Cree una concentración final de iones metálicos de 0,125 mM haciendo dos diluciones sucesivas con agua DI. Mezclar exhaustivamente después de cada dilución.
  4. Licuar la solución madre de NTA de 12,5 mM. Crear una concentración final de 0,125 mM NTA haciendo dos diluciones sucesivas con agua DI. Mezclar exhaustivamente después de cada dilución.
  5. Para hacer una muestra de 2 ml del complejo ternario, agregue 800 μL de solución de NTA de 0,125 mM y 400 μL de solución de iones metálicos 0,125 a un tubo de microcentrífuga de 2 ml, y mezcle bien con al menos 20 inversiones. Añadir 400 μL de solución de acetato de amonio (pH 7,7) y 400 μL de solución de amb 0,125 mM, mezclar bien con al menos 20 inversiones y dejar que la muestra se equilibre durante 10 min a temperatura ambiente.
  6. Cargue la muestra de 2 ml en una jeringa de nariz roma de 2,5 ml e inyecte la muestra en el ES del instrumento utilizando la bomba de jeringa del instrumento a un flujo de 10 μL/min.
  7. Coloque el instrumento en modo IM-MS negativo. Utilice las condiciones de funcionamiento típicas del instrumento27 para estos experimentos de la siguiente manera.
    1. Inyectar la muestra a un caudal de 10 μL/min en el capilar ES mantenido a -2 kV con un caudal de desolvatación de nitrógeno de 500 L/h. Ajuste las temperaturas de fuente ES y de disolución a 130 °C y 263 °C, respectivamente. Ajuste los conos de muestreo y extracción a 25 V y 3 V, respectivamente.
    2. Para los experimentos CID, utilice el analizador de masas cuadrupolo para seleccionar el patrón isotópico del complejo ternario [amb+M(II)+NTA]- utilizando el m/z del pico monoisotópico con ajustes de resolución de baja masa = 4,5 y alta masa = 16,5.
      NOTA: Los iones [amb+M(II)+NTA]- se pasan a las guías secuenciales de iones de tres ondas viajeras (onda T).
    3. Asegúrese de que la onda T de la trampa tenga un flujo de gas argón de 3 ml / min y una presión de 2.83 x 10-2 mbar. Ajuste la energía de colisión (CE) a la trampa a 5 V para evitar cualquier disociación del complejo ternario. Deje que la trampa recoja los iones del complejo ternario antes de liberarlos (tiempo de liberación de 200 μs) en la guía de iones de onda T de movilidad iónica (IM) utilizando un sesgo de CC de trampa de 14 V, que mantiene la disociación del complejo en la entrada IM al mínimo.
    4. Asegúrese de que la guía de iones IM tenga una presión de 0,507 mbar utilizando un caudal de 20 ml / min de gas tampón deN2 ultrapuro. Rampa las ondas T en el IM con alturas de 7 V a 30 V y con velocidades de 290 m/s a 801 m/s para cada barrido inicial y final de la guía de iones IM.
    5. Ajuste el flujo de argón y la presión de la onda T de transferencia igual que la onda T de la trampa. La onda T de transferencia se utilizó para la disociación inducida por colisión del complejo ternario [amb+M(II)+NTA]- utilizando la transferencia CE.
  8. Seleccione el patrón de isótopos m/z del complejo cargado negativamente [amb+M(II)+NTA]- utilizando el cuadrupolo de transmisión en modo de resolución.
    1. Identifique el patrón de isótopos m/z abriendo el programa de espectrometría de masas y seleccionando Espectro. Seleccione Herramientas > Modelo de isótopos. En la ventana emergente, enumere la fórmula molecular del complejo, marque la casilla Mostrar ion cargado, ingrese 1 para la carga de negativo y haga clic en Aceptar.
    2. En el patrón de isótopos mostrado del complejo, observe el pico de masa más bajo. En el software del instrumento, seleccione Configuración > Perfil cuádruple. En la ventana que se abre, seleccione Manual fijo e introduzca la masa del pico de patrón isotópico más bajo. Haga clic en Actualizar y luego en Cerrar.
    3. Seleccione Configuración de nuevo y, a continuación, haga clic en Resolución de cuádruple. Recopile los espectros de iones negativos ES-IM-MS de forma incremental a través de un rango de energías de colisión de transferencia utilizando una duración de ejecución de 5 minutos y un tiempo de escaneo de 2 s.
      NOTA: Las energías de transferencia preliminares se pueden probar de 26-60 V en intervalos de 2 V. El rango final de energías de colisión de transferencia examinadas no debe demostrar disociación del complejo ternario a la energía más baja y disociación completa en los productos a la energía más alta. Para un análisis estadístico de alta calidad, este análisis ES-IM-MS debe realizarse para cada complejo interno al menos 3 veces por diferentes personas y en diferentes días para determinar las medias y las desviaciones estándar.

4. Análisis de sección transversal de colisión (CCS) ES-IM-MS

  1. Limpie el tubo de entrada ES y el capilar metálico con 500 μL de ácido acético glacial 0,1 M, seguido de 500 μL de hidróxido de amonio 0,1 M y, finalmente, 500 μL de solución de acetato de amonio de pH 7,7.
  2. Licuar la solución madre de PA de 1.000 ppm a temperatura ambiente y hacer dos diluciones seriadas; diluir a 100 ppm de PA con agua DI, y luego diluir a 10 ppm de solución de PA diluyendo con una proporción de 1:1 de agua DI y acetonitrilo de grado HPLC.
  3. Recopile los espectros IM-MS de iones negativos de la muestra de PA de 10 ppm durante 10 minutos utilizando condiciones de funcionamiento instrumentales.
    NOTA: El caudal de inyección y las condiciones de la fuente ES fueron las mismas que para los experimentos CID (paso 3.). Para las mediciones del CCS, el analizador de masas cuadrupolo estaba en modo de no resolución y pasaba todos los iones a las tres guías secuenciales de iones de onda T. El funcionamiento de las guías de iones de onda T trampa y onda T IM fue el mismo que para los experimentos CID. La energía de colisión de la celda de onda T de transferencia fue de 4 V para permitir que los iones pasaran sin disociación.
  4. Preparar cada uno de los complejos ternarios como se describe en los pasos 3.2.-3.6.
  5. Recoger los espectros IM-MS de cada complejo ternario durante 5 min.
    NOTA: Utilice las mismas condiciones instrumentales que en el paso 4.3.
  6. Recoja los espectros IM-MS de iones negativos de la muestra de PA de 10 ppm durante 10 min.
    NOTA: La media de los tiempos de llegada de los calibrantes de AP recogidos antes y después de los complejos terminales se utiliza en la determinación de CAC.

5. Análisis de los datos ES-IM-MS CID

  1. Identificar la especie haciendo coincidir los patrones teóricos de isótopos m/z del complejo ternario y sus productos con los espectros experimentales IM-MS.
    1. Abra el programa de espectrometría de masas y seleccione Cromatograma para abrir una nueva ventana.
    2. En la ventana Cromatograma , haga clic en Archivo > Abrir para encontrar y abrir el archivo de datos IM-MS deseado.
    3. Haga clic con el botón derecho del ratón, arrastre por el cromatograma y suéltelo. El espectro MS se mostrará en una ventana de espectro separada.
    4. En la nueva ventana que muestra los espectros, seleccione Herramientas > modelo de isótopos. Aparecerá una pequeña ventana. Ingrese la fórmula molecular de la especie amb, marque la casilla Mostrar ion cargado e ingrese el estado de carga deseado. Haga clic en Aceptar.
    5. Para distinguir todas las especies en el espectro IM-MS, repita este proceso en la ventana Espectro y registre su rango de isótopos m/z .
  2. Para el complejo ternario amb y sus productos, utilice su rango de isótopos m/z para identificarlos y extraer sus distribuciones de tiempo de llegada (ATD).
    1. Abra el software de separación de movilidad iónica y seleccione Archivo > Abrir para buscar y abrir el archivo de datos.
    2. Haga clic izquierdo y arrastre con el ratón para ampliar el rango de isótopos m / z del complejo ternario [amb + M (II) + NTA]-.
    3. Con la herramienta Selección , haga clic con el botón izquierdo y arrastre para seleccionar el rango de isótopos específico para [amb+M(II)+NTA]- como se identificó en el paso 5.1. Haga clic en el botón Aceptar selección actual .
    4. Para eliminar cualquier especie m /z coincidente o señal de fondo, utilice la herramienta Selección para elegir el ATD asociado al complejo ternario. Haga clic en el botón Aceptar selección actual .
    5. Para exportar el archivo ATD al software de espectrometría de masas, vaya a Archivo > Exportar y, a continuación, haga clic en Conservar tiempo de deriva. Cambie el nombre del archivo si lo desea y guárdelo en la carpeta correspondiente.
  3. Determinar mediante la integración del área bajo la curva ATD extraída la intensidad relativa de la especie.
    1. En la ventana Cromatograma , abra el archivo exportado guardado desde el software de separación de movilidad iónica. Seleccione Proceso y, a continuación, Integrar. Utilice un ajuste de amplitud de pico a pico de 20 y haga clic en Aceptar.
    2. Registre el área integrada como se muestra en la ventana Cromatograma . Repita los pasos 5.2.2.-5.2.5. para los dos productos, a saber, [NTA+M(II)]- y [amb+M(II)]-.
    3. Repita los pasos 5.2.1.-5.3.2. para cada energía de colisión de transferencia registrada.
  4. Utilice las áreas ATD integradas para el complejo ternario [amb+M(II)+NTA]- y dos productos [NTA+M(II)]- y [amb+M(II)]- en cada punto de energía de colisión de transferencia para normalizar a una escala porcentual relativa.
    1. Cree una hoja de cálculo introduciendo las identidades del complejo ternario y sus productos y su ATD integrado en cada energía de colisión.
    2. Para cada energía de colisión, utilice la suma de los ATD integrados para [amb+M(II)+NTA]-, [NTA+M(II)]- y [amb+M(II)]- para normalizar sus ATD individuales a una escala porcentual relativa.
    3. A partir de las mediciones TCID replicadas, encuentre la media y las desviaciones estándar de cada punto de datos. Convierta la energía de colisión de transferencia del marco de laboratorio (E lab) a la energía de colisión del centro de masa (E cm) utilizando las masas promedio del gas de colisión argón (m Ar) y el complejo ternario (complejo m): E cm = Elab (m Ar) / (m Ar + mcomplejo).
      NOTA: Ecm representa la energía máxima de la colisión con el gas argón, que está disponible para la disociación del complejo ternario.
    4. Trazar la media y la desviación estándar de las intensidades porcentuales individuales de [amb+M(II)+NTA]-, [NTA+M(II)]- y [amb+M(II)]- en un gráfico de intensidad relativa (%) vs. energía de colisión del centro de masa (eV) para exhibir cómo cambian las intensidades relativas de la especie en función de la energía de colisión.

6. Análisis de los tiempos medios de llegada para determinar las secciones transversales de colisión (CCS)

  1. Abra el software de separación de movilidad iónica y el archivo que contiene el espectro IM-MS de la muestra de PA de 10 ppm recogida con la energía de colisión de transferencia establecida en 4 V. Extraiga el ATD de cada una de las especies de PA cargadas negativamente y exporte los archivos al software de espectrometría de masas utilizando la opción Retain Drift Time (consulte el paso 5.2.5.). Repita el procedimiento para el segundo archivo de calibrantes de PA.
  2. Abra el software de separación de movilidad iónica. Utilice Archivo > Abrir para abrir uno de los archivos que contienen los espectros IM-MS de los complejos terminales grabados entre los calibrantes PA. Extraiga el ATD de cada uno de los complejos ternarios y exporte sus archivos al software de espectrometría de masas utilizando la opción Retain Drift Time (ver paso 5.2.5.).
  3. Utilice un método de calibración transversal28 para calcular la CAC del complejo ternario y sus productos.
    1. En una hoja de cálculo, calcule la CAC corregida (Ω c) para cada una de las especies de PA cargadas negativamente de su CAC (Ω)29,30 medida en gas tampón de helio31 utilizando la Ecuación 1, donde z = carga del complejo ternario, ec = 1.602 x 10−19 C; m N2 = masa de nitrógeno (u), y mion = masa del complejo ternario28.
       figure-protocol-17312(1)
    2. Encuentre los tiempos de deriva (tD) de los calibrantes PA y los complejos ternarios obteniendo primero los tiempos de llegada promedio (tA) de los máximos de las curvas ATD correspondientes y luego aplicando la Ecuación 2, donde c = coeficiente de retardo del detector (1.41 ms; verifique el instrumento ya que esto puede variar entre instrumentos) y m / z = relación masa-carga del calibrante PA o complejo ternario amb.
      tD =tA figure-protocol-17956 (2)
    3. Cree un gráfico trazando t D vs. Ωc de los calibrantes PA. Luego, usando la Ecuación 3, ajuste los datos con una regresión de mínimos cuadrados para encontrar las constantes A 'y B, donde A' corrige el campo eléctrico, la temperatura y la presión en el instrumento y B corrige el comportamiento no lineal del dispositivo T-wave IM.
      Ωc = A' tDB (3)
    4. Utilizando las constantes A' y B y el valor tD de los complejos ambularios, calcula su Ωc usando la Ecuación 3 y su Ω usando la Ecuación 1. Los valores de CCS estimados por este método tienen errores absolutos de alrededor del 2%29.

7. Métodos computacionales

  1. Utilice el método semiempírico PM632 implementado en el modelado estructural y el software computacional33 para localizar conformadores optimizados para geometría de los complejos ternarios [amb+M(II)+NTA]- y los pares de iones y productos neutros: [amb+M(II)]- + NTA y [NTA+M(II)]- + amb observados en los experimentos CID. Consulte el uso del visualizador de cálculo en el Archivo complementario para obtener información específica sobre cómo desarrollar y enviar cálculos.
    NOTA: Para los sistemas actuales, el método PM6 reprodujo correctamente los datos experimentales, pero en general, se puede utilizar cualquier método de química cuántica que sea confiable y computacionalmente factible.
  2. Ejecute optimizaciones de geometría y cálculos de frecuencia en múltiples estructuras iniciales diferentes para explorar diferentes conformaciones, estados de protonación y posibles sitios de unión. Registrar las energías electrónicas + punto cero de cada uno de los puntos estacionarios localizados para cada uno de los complejos ternarios y sus productos.
    NOTA: Las estructuras iniciales para las optimizaciones de geometría deben investigar diferentes combinaciones posibles de sitios de unión y disposiciones conformacionales. Las estructuras de partida se basaron en conformadores B3LYP34 [amb+M(II)]- previamente localizados 3,4,6. Para [amb+M(II)+NTA]-, NTA se posicionó para competir con los sitios sustituyentes del amb en el Aa 1-Aa2-Aa 6-Aa 7 y el extremo carboxilato para el estado de espín singlete de Zn(II) o el estado de espín triplete de Ni(II).
  3. Utilice un programa que pueda realizar mediciones precisas de la sección transversal de colisión medida en gas tampón de helio (CCSHe) utilizando las coordenadas atómicas de estos cálculos químicos cuánticos35.
    NOTA: Los programas desarrollados para calcular CCS He precisos a partir de estructuras peptídicas localizadas por cálculos químicos cuánticos incluyen MobCal 36 y HPCCS37,38.
  4. Elija el conformador de energía más bajo que exhiba el CCSHe de Lennard-Jones que esté de acuerdo con elCCS He medido por IM-MS para seleccionar las estructuras de complejos ternarios y productos de disociación para incluir en el modelado CRUNCH a continuación.

8. Modelado CRUNCH

  1. Cree un archivo de texto en el formato descrito en la sección de discusión ("Formato de archivo de texto de entrada CRUNCH").
    NOTA: El archivo incluye las siguientes columnas: (−1) energía de colisión del centro de masa (Ecm), (1) media de la intensidad relativa del producto [amb+M(II)]-, (2) desviación estándar de la intensidad [amb+M(II)]-, (3) media de la intensidad relativa del producto [NTA+M(II)]- y (4) desviación estándar de la intensidad [NTA+M(II)]- intensidad.
  2. Modele el Ecm-intensidades dependientes de los dos canales de reacción [amb+M(II)+NTA]-a [amb+M(II)]- + NTA y [amb+M(II)+NTA]- a [NTA+M(II)]- + amb utilizando la técnica TCID en el programa CRUNCH.
    NOTA: Utilice las frecuencias vibracionales y rotacionales PM6 para el complejo ternario y los dos canales de iones y productos neutros. Utilice masas promedio del complejo ternario, gas de colisión de argón y productos iónicos y neutros. Utilice valores de los cálculos de PM6 o de la base de datos NIST para las polarizabilidades (Å3) y momentos dipolares (Debye) para los productos neutros.
    1. Desde el menú principal de CRUNCH, abra el archivo de texto (. GB5) que contiene las intensidades relativas dependientes de Ecm de los productos. Responder No a los parámetros de lectura.
    2. En el menú principal de CRUNCH, seleccione Modelado > Establecer todos los parámetros. En las opciones del modelo de reacción, elija la opción predeterminada CID de umbral seguida de RRKM con integración sobre la distribución de transferencia de energía del complejo ternario20, introduzca 2 para los canales de producto independientes modelados y seleccione Calcular secciones transversales. Ingrese No a ¿Dos canales de productos tienen la misma masa de iones?
    3. Para el canal de producto # 1, ingrese la columna [1] para los datos experimentales del producto [amb+M(II)], la columna [2] para las desviaciones estándar del producto [amb+M(II)], la columna [5] para la sección transversal del modelo no enrevesado y la columna [6] para la sección transversal del modelo enrevesado. Introduzca 0 para los residuos de ajuste.
      Nota: Estos números de columna corresponden a las columnas del archivo de entrada en el paso 8.1. como se describe en la discusión ("Formato de archivo de texto de entrada CRUNCH").
    4. Para el canal de producto # 2, introduzca la columna [3] para los datos experimentales del producto [NTA+M(II)], la columna [4] para las desviaciones estándar del producto [NTA+M(II)], la columna [7] para la sección transversal del modelo no enrevesado y la columna [8] para la sección transversal del modelo enrevesado. Introduzca 0 para los residuos de ajuste.
    5. Para el tipo de modelo no enrevesado, elija la sección transversal 0 K (desplazamiento cinético incluido), que incluye la corrección estadística RRKM de los desplazamientos cinéticos debidos a la ventana de tiempo de 50 μs desde la celda de colisión hasta el detector TOF18.
    6. Para las opciones de convolución, elija la integral doble de Tiernan, que incluye la convolución sobre distribuciones de energía de traslación entre el ion complejo ternario y el gas de colisión de argón21.
    7. Para el método de integración numérica, elija la cuadratura gaussiana con secciones transversales guardadas previamente, seguida del número de puntos de integración = 32, el número de desviaciones estándar = 3.0 y el número de desviaciones estándar para la segunda integral = 3.0.
    8. La masa del ion complejo ternario (u) se lee automáticamente a partir del . Archivo de texto GB5, seguido de la masa del gas de colisión (39.948 para argón); utilice los valores predeterminados de 0,20 eV para el FWHM del haz de iones y 298,15 K para la temperatura del gas. El programa lee automáticamente las energías de colisión mínimas y máximas del centro de masa del . Archivo de texto GB5; Utilice el valor predeterminado para el incremento de energía mínimo.
    9. Utilice el valor predeterminado para el factor de escala Sig0, No para permitir el escalado de canales de productos individuales y los valores predeterminados para N y M. Para el método para el cálculo de g(i), elija integrar sobre la densidad ro-vibracional de los estados, que incluye la distribución interna de energía20 del complejo ternario [amb+M(II)+NTA]-.
    10. Desde las opciones para ingresar los parámetros moleculares, ingrese G para leer el archivo de modelado estructural33 con las frecuencias vibracionales y rotacionales PM6 del complejo ternario. Respuesta Sí a la pregunta ¿es atómico uno de los reactivos? Escriba la ubicación y el nombre del archivo de modelado.
      NOTA: Las otras opciones para ingresar las frecuencias vibracionales y rotacionales incluyen el archivo de parámetros de lectura, que leerá los parámetros de un archivo de texto, o editar / ingresar constantes, lo que permite la entrada manual de cada parámetro.
    11. Escale las frecuencias utilizando el factor de escala PM6 recomendado por el NIST (1.062). Para obtener más detalles sobre la escala, consulte la discusión ("factores de escala para las frecuencias vibratorias"). El número de átomos en el complejo ternario se lee del archivo. Respuesta No a ¿es lineal la molécula ? Introduzca la descripción de los reactivos (por ejemplo, H+Zn+NTA- + Ar).
    12. Ingrese 1 para la carga en el ion y 1.664 para la polarizabilidad del gas argón39. La masa del ion y la masa del objetivo son para el complejo ternario y el argón, respectivamente, y se leen automáticamente del . Archivo de texto GB5. Introduzca 0 para vibraciones armónicas.
      NOTA: Las siguientes opciones son para elegir diferentes factores de escala para frecuencias vibratorias altas o bajas. Ingrese 1.062 para frecuencias altas y 0.0 para frecuencias bajas (ver discusión: factores de escala para las frecuencias vibratorias). Se muestran las frecuencias escaladas. Elija 0 para seleccionar Sin cambios.
    13. Pulse Intro para leer las constantes de rotación 1D y 2D del archivo de modelado estructural33 introducido en el paso 8.2.10. Seleccione los valores predeterminados de 0 para los tratamientos de rotor obstaculizado y 1 para la simetría de moléculas.
      NOTA: El programa muestra los datos introducidos; presione Enter para No hay cambios.
    14. Elija los 300 K predeterminados para la temperatura del reactivo. Seleccione Integración para el método de reducción de la densidad de la matriz de estados. Seleccione Sí para truncar la distribución de energía. Introduzca 40000 cm−1 para la energía máxima para la distribución, 2,0 cm−1 para el tamaño del contenedor y 32 para el número de puntos en la distribución de energía.
      NOTA: Presione Enter 2x y verifique que la matriz truncada de 32 puntos tenga una población >0.9. Si >0,9, escriba No para cambiar los contenedores o el factor de condensación. Si <0,9, escriba Sí y cambie la energía máxima para la distribución y/o el tamaño del contenedor.
    15. Para los parámetros para el modelo TCID/RRKM, elija Sí para Cambiar, introduzca 0 para el tiempo fijo y 0,000050 s para el límite superior de la ventana de detección. Para el instrumento utilizado, este es el tiempo que tardan los iones en viajar desde la celda de colisión de transferencia hasta el detector TOF y se calcula utilizando la Ecuación 2.
    16. Para la molécula energizada, ingrese C para copiar los valores de los reactivos ya ingresados. Introduzca −1 para el estado de transición de origen (TS), 0 para el TS de destino y P para continuar.
    17. Para el canal de producto 1, seleccione 1 para el estado de transición único en las opciones del canal de disociación y 0 para ninguno para la disociación secuencial. Para el tipo de estado de transición, elija 1 para orbitar.
    18. Seleccione G para leer los archivos de programa de modelado que contienen los parámetros rotacionales y vibracionales PM6 para los productos [amb+M(II)]- + NTA. Ingrese No para es atómica una de las especies PSL TS? Introduzca la ubicación y el nombre del archivo [amb+M(II)]. Use 1.062 para frecuencias de escala, presione Enter para el número de átomos e ingrese No para ¿es lineal la molécula?
    19. Introduzca la ubicación y el nombre del archivo de modelado que contiene las frecuencias vibracionales y rotacionales del producto NTA. Use 1.062 para frecuencias de escala, presione Enter para el número de átomos e ingrese No para ¿es lineal la molécula ? Introduzca la descripción del TS en órbita, por ejemplo, H+Zn-... NTA.
    20. Ingrese 1 para la carga del ion [amb+M(II)] e ingrese la polarizabilidad (16.12 Å3) y el momento dipolar (4.6183 Debye) de NTA. Seleccione 0 K para la temperatura de rotación y dipolo bloqueado para el tratamiento del estado de transición orbital. Introduzca las masas medias (u) del ion [amb+M(II)]- y NTA.
    21. Introduzca 0 para vibraciones armónicas. Introduzca 1,062 para las frecuencias altas y 0,0 para las frecuencias bajas. Consulte la sección de discusión para obtener más detalles sobre las frecuencias de escala; Se muestran las frecuencias escaladas. Elija 0 para seleccionar Sin cambios. Pulse Intro para leer las constantes de rotación 1D y 2D de los archivos de modelado. Seleccione 0 para rotores obstaculizados, 1 para simetría de moléculas y 1 para degeneración de reacción. Introduzca la opción Sin cambios.
    22. Para el canal de producto 2, seleccione 1 para el estado de transición único, 0 para ninguno para la disociación secuencial y 1 para orbitar para el tipo de estado de transición.
    23. Seleccione G para leer en archivos de modelado que contengan los parámetros rotacionales y vibratorios PM6 para los productos [NTA+M(II)]- y amb. Ingrese No para es atómica una de las especies PSL TS? Escriba la ubicación y el nombre del archivo de modelado [ NTA+M(II)].
    24. Use 1.062 para frecuencias de escala, presione Enter para leer el número de átomos e ingrese N para si la molécula es lineal. Escriba la ubicación y el nombre del archivo de modelado amb. Use 1.062 para frecuencias de escala, presione Enter para el número de átomos e ingrese N para si la molécula es lineal?
    25. Introduzca la descripción del TS en órbita (por ejemplo, NTA+Zn-... H). Introduzca 1.0 para la carga del ion [NTA+M(II)]- e introduzca la polarizabilidad (Å3) y el momento dipolar (Debye) del amb. Seleccione 0,0 K para la temperatura de rotación y dipolo bloqueado para el tratamiento del estado de transición orbital. Indíquense las masas medias (u) de los productos [NTA+M(II)]- y amb.
      NOTA: El archivo de salida contiene los momentos de polarizabilidad y dipolo del amb. La polarizabilidad está en unidades de Bohr 3 y necesita ser convertida a las unidades de Å3.
    26. Introduzca 0 para vibraciones armónicas. Introduzca 1.062 para frecuencias altas y 0 para frecuencias bajas. Consulte la discusión para obtener más detalles sobre las frecuencias de escala. Se muestran las frecuencias escaladas. Elija 0 para seleccionar Sin cambios. Pulse Intro para leer las constantes de rotación 1D y 2D de los archivos de modelado. Seleccione 0 para rotores obstaculizados, 1 para simetría de moléculas y 1 para degeneración de reacción. No introduzca ningún cambio.
    27. Para manejar rotaciones 2D inactivas, seleccione las opciones predeterminadas de distribución de momento angular estadístico e integre P(E,J) sobre la distribución J. Utilice el valor predeterminado de 32 en el número de puntos de integración.
      NOTA: Estas selecciones eligen el método de integración sobre el momento angular total J niveles16,17. La salida resultante permite al investigador comprobar que toda la entrada es correcta.
    28. Seleccione las energías de activación relativas a la opción de molécula energizada e introduzca la energía relativa (eV) para el canal de producto 1 que esté cerca de la energía umbral observada en el gráfico de la intensidad relativa frente a la energía de colisión del centro de masa del producto [amb+M(II)]- (Figura 4).
    29. Para el canal de producto 2, introduzca la energía relativa (eV) que está cerca de la energía umbral observada en el gráfico de la intensidad frente a la energía de colisión del centro de masa del producto [NTA+M(II)]. Para calcular el número de estados para cada canal de producto, utilice un tamaño de contenedor de 2,0. Presione Entrar y luego No para continuar.
    30. En el menú Modelo , seleccione Optimizar parámetros para ajustar datos e introduzca la energía mínima y la energía máxima para iniciar y finalizar el ajuste de datos, respectivamente.
      NOTA: Utilice un rango de energía pequeño que incluya los umbrales de ambos canales. Para obtener más detalles, consulte la discusión: rango de energía para ajustar el modelo TCID seleccionado a los datos experimentales.
    31. Seleccione -1 para los modos de ponderación de las desviaciones estándar experimentales. Según los datos, seleccione una desviación estándar mínima aceptable de 0.01 a 0.001. Seleccione No para el escalado optimizado de canales individuales y 0 para el número de iteraciones.
      NOTA: Una alternativa al uso de desviaciones estándar es la opción estadística .
    32. Utilice el valor predeterminado para el límite de convergencia E0 y seleccione No para mantener cualquier parámetro en el valor actual. Introduzca 0,5 y 2,0 eV para los límites inferior y superior para evitar fallos de optimización y seleccione la diferencia finita central para el método de evaluación de derivadas. Utilice el valor predeterminado para la precisión numérica y seleccione No para cambiar los tamaños de paso derivados.
      Nota : un método alternativo es seleccionar Sí para mantener cualquier parámetro en el valor actual. Este método se describe más adelante en la discusión: optimización de parámetros.
    33. En el menú Optimización , seleccione comenzar optimización. El programa CRUNCH optimizará el modelo TCID seleccionado para los datos experimentales.
      NOTA: Si la optimización no encuentra ajustes satisfactorios, desde el menú de cambios , intente cambiar el rango de energía para cubrir solo las primeras intensidades que se elevan desde los umbrales. Cuando se encuentre un ajuste razonable, aumente el rango de energía y vuelva a ajustar. Otras opciones que pueden ayudar a encontrar ajustes a los datos incluyen elegir mantener cualquier parámetro en el valor actual en parámetros optimizados y cambiar las opciones de ponderación en pesos. Consulte la discusión para conocer estas opciones.
    34. Cuando se encuentre un modelo que se ajuste a los datos, presione Enter hasta que aparezca el menú Modelo . Si solo una parte del rango de energía de los datos experimentales está equipada con el modelo TCID, seleccione Calcular y modelo de contorsión para extender el ajuste del modelo a todas las energías de colisión experimentales.
    35. En el menú Modelo , seleccione Delta H y S en T.
      NOTA: El modelo CRUNCH no enrevesado relaciona las energías umbral 0 K con las entalpías 0K (ΔH0) de disociación del complejo ternario en los dos canales de producto independientes (Tabla 2). Las entalpías de 298 K (ΔH 298) y las energías libres de Gibbs (ΔG298) de disociación también se derivan con correcciones térmicas y de entropía de mecánica estadística utilizando el reactivo y los productos PM6 frecuencias rotacionales y vibratorias.

Resultados

La disociación competitiva inducida por colisión de los complejos ternarios [amb+M(II)+NTA]- de A y H en [amb+M(II)]- + NTA o [NTA+M(II)]- + amb, se muestra en la Figura 3. El amb se muestra como A o H y M = Zn o Ni. El complejo ternario [A+Zn(II)+NTA]- (Figura 3A) exhibe umbrales aparentes de aproximadamente 0,7 eV de energía de colisión (CE) para producir [...

Discusión

Pasos críticos
Análisis de disociación inducida por colisión por umbral (TCID) de ES-IM-MS. El TCID utilizó la célula de onda T de transferencia en presencia de argón como célula de colisión. Antes de la disociación, los iones precursores son termalizados por colisiones de baja energía con gas nitrógeno a medida que pasan a través de la celda de movilidad iónica (IM). Esto da como resultado un TCID de energía resuelta más reproducible que el que se logra utilizando la ...

Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este material se basa en el trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo 1764436, NSF REU program (CHE-1659852), NSF instrument support (MRI-0821247), Physics and Astronomy Scholarship for Success (PASS) NSF project (1643567), Welch Foundation (T-0014), y recursos informáticos del Departamento de Energía (TX-W-20090427-0004-50) y L3 Communications. Los autores agradecen a Kent M. Ervin (Universidad de Nevada - Reno) y Peter B. Armentrout (Universidad de Utah) por compartir el programa CRUNCH y por los consejos sobre ajuste de PBA. Los autores agradecen al grupo de Michael T. Bower en la Universidad de California - Santa Bárbara por compartir el programa Sigma.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile HPLC-gradeFisher Scientific (www.Fishersci.com)A998SK-4
Alternative metal binding (amb) peptidesPepmicCo (www.pepmic.com)designed peptides were synthized by order
Ammonium acetate (ultrapure)VWR97061-014
Ammonium hydroxide (trace metal grade)Fisher Scientific (www.Fishersci.com)A512-P500
Driftscope 2.1 software programWaters (www.waters.com)software analysis program
Gaussian 09GaussianElectronic Structure Modeling Software
GaussViewGaussianGraphical Interface to Visualize Computations
Glacial acetic acid (Optima grade)Fisher Scientific (www.Fishersci.com)A465-250
Ion-scaled Lennard-Jones (LJ) methodSigmaMichael T. Bowers’ group of University of California at Santa Barbara
MassLynx 4.1Waters (www.waters.com)software analysis program
Microcentrifuge TubesVWR87003-2941.7 mL, polypropylene
Microcentrifuge TubesVWR87003-2982.0 mL, polypropylene
Ni(II) nitrate hexahydrate (99% purity)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)A15540
Poly-DL-alanineSigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)P9003-25MG
Waters Synapt G1 HDMSWaters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
Zn(II) nitrate hexahydrate (99%+ purity)Alfa Aesar (www.alfa.com)12313

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