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  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo descrive un protocollo sperimentale che utilizza la spettrometria di massa a mobilità ionica elettrospray, calcoli quantistici semi-empirici e dissociazione indotta da collisione di soglia risolta dall'energia per misurare la termochimica relativa della dissociazione dei complessi metallici ternari correlati.

Abstract

Questo articolo descrive un protocollo sperimentale che utilizza la spettrometria di mobilità-massa elettrospray-ioni (ES-IM-MS) e la dissociazione indotta da collisione di soglia risolta in energia (TCID) per misurare la termochimica della dissociazione di complessi ternari [amb+M(II)+NTA]- caricati negativamente in due canali di prodotto: [amb+M(II)] + NTA o [NTA+M(II)]-  + amb, dove M = Zn o Ni e NTA è acido nitrilotriacetico. I complessi contengono uno degli eptapeptidi alternativi di legame dei metalli (amb) con le strutture primarie acetil-His 1-Cys 2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7 o acetil-Asp 1-Cys 2-Gly 3-Pro 4-Tyr 5-His 6-Cys 7, dove gli amminoacidi 'Aa1,2,6,7 Le posizioni sono i potenziali siti di legatura dei metalli. Gli stati stazionari ottimizzati per la geometria dei complessi ternari e dei loro prodotti sono stati selezionati dai calcoli di chimica quantistica (attualmente l'hamiltoniana semi-empirica PM6) confrontando le loro energie elettroniche e le loro sezioni trasversali di collisione (CCS) con quelle misurate da ES-IM-MS. Dai calcoli di frequenza PM6, i parametri molecolari del complesso ternario e dei suoi prodotti modellano le intensità dipendenti dall'energia dei due canali del prodotto utilizzando un metodo TCID competitivo per determinare le energie di soglia delle reazioni che si riferiscono alle entalpie 0 K di dissociazione (ΔH0). Le correzioni termiche ed entropiche della meccanica statistica che utilizzano le frequenze rotazionali e vibrazionali PM6 forniscono le entalpie di dissociazione da 298 K (ΔH298). Questi metodi descrivono una routine EI-IM-MS in grado di determinare la termochimica e le costanti di equilibrio per una gamma di complessi ternari di ioni metallici.

Introduzione

Questo studio descrive una nuova tecnica che utilizza uno spettrometro di mobilità ionica-massa disponibile in commercio che consente la determinazione della termochimica relativa per la dissociazione di un complesso metallico ternario alternativo legante il metallo (amb) [amb + M (II) + NTA], dove M = Zn o Ni e NTA = acido nitrilotriacetico (Figura 1). Queste reazioni modellano la dissociazione della proteina ricombinante amb-tagged attaccata al metallo immobilizzato NTA durante la cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC)1,2. Ad esempio, questo metodo è descritto utilizzando i tag eptapeptide amb di amb A e H (Figura 2) (scelti dagli studi precedenti 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ) che presentano proprietà leganti lo Zn(II) e il Ni(II) e, pertanto, hanno potenziali applicazioni come etichette di purificazione. Tuttavia, il processo descritto può essere utilizzato per valutare le energie termochimiche in qualsiasi sistema organometallico. Questi peptidi amb hanno siti di legame dei metalli nelle posizioni Aa 1-Aa2 e Aa6-Aa 7 che competono con i siti carbossilato e amminico della NTA. I tre amminoacidi amb centrali forniscono un distanziatore (Gly3), la cerniera per i due bracci (Pro4) e un'interazione cationica π-metallo a lunga distanza (Tyr5).

Lo stato di carica 1− complessivo dei complessi [amb+M(II)+NTA]- è determinato dallo stato di protonazione dei loro potenziali siti di legame. Poiché esiste Ni(II) o Zn(II) con lo stato di ossidazione 2+, deve esserci una rete di tre siti deprotonati caricati negativamente. La modellazione molecolare dei complessi [amb+M(II)+NTA]- prevede che questi siano due protoni dell'NTA e un protone dell'amb (cioè [amb-H+M(II)+NTA-2H]-). I canali del prodotto contengono una specie ionica e una specie neutra (cioè [NTA-3H+M(II)]- + amb o [amb-3H+M(II)]- + NTA). Nel manoscritto, "-3H" è escluso nei nomi dei complessi, ma il lettore dovrebbe sapere che il -3H è implicito. Lo strumento misura le intensità relative delle due specie ioniche di massa-carica (m/z). Una delle principali caratteristiche delle analisi ES-IM-MS è che consente l'esame della reattività di una specifica specie m/z, come utilizzato qui e nei precedenti studi amb 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.

L'acquisizione di dati termochimici per grandi complessi utilizzando la dissociazione indotta da collisione è un argomento di notevole interesse13,14. Le metodologie, incluso il metodo cinetico, non sono favorevoli all'adattamento dei dati su un intervallo di energie, né tengono conto degli ambienti multi-collisione15,16,17,18. Qui, il metodo CID di soglia (TCID), sviluppato utilizzando la spettrometria di massa tandem a fascio ionico guidato da Armentrout, Ervin e Rodgers viene applicato19 a una nuova piattaforma di strumenti ES-IM-MS che utilizza guide ioniche a onda viaggiante. Il metodo TCID consente l'analisi termochimica relativa della dissociazione dei complessi ternari nei loro due canali di prodotto e include una legge di soglia che descrive il trasferimento di energia di collisione tra l'energia traslazionale del reagente (complesso ternario in questa ricerca) e un gas bersaglio inerte (argon in questo caso). Il metodo include l'integrazione sulla distribuzione interna dell'energia del reagente20, le distribuzioni di energia traslazionale tra il reagente e il gas target 21 e le distribuzioni del momento angolare totale22,23. Sono incluse una probabilità di dissociazione e una correzione statistica Rice-Ramsperger-Kassel-Marcus (RRKM) degli spostamenti cinetici risultanti dalla finestra temporale limitata per l'osservazione dei prodotti24. Per due canali di prodotto indipendenti, il metodo TCID competitivo consente l'adattamento simultaneo dei due canali di prodotto concorrenti. La dissociazione del complesso avviene attraverso uno stato di transizione orbitante, che ha le proprietà dei prodotti ma è tenuto insieme da un dipolo25 bloccato. Il metodo TCID è incorporato nel programma CRUNCH26, e il funzionamento dell'interfaccia utente è descritto qui per valutare la termochimica dei due canali di dissociazione dei complessi ternari [amb+M(II)+NTA]-. Il programma CRUNCH è disponibile su richiesta presso gli sviluppatori26.

Protocollo

NOTA: nella Figura 1 viene illustrata una panoramica del protocollo.

1. Preparazione dei reagenti

  1. Acquistare peptidi amb liofilizzati (purezza >98%) e conservarli in un congelatore a -80 °C.
  2. Acquistare nitrato di zinco (II) esaidrato di purezza >99% e nitrato di nichel (II) esaidrato.
    ATTENZIONE: Il nitrato di nichel(II) esaidrato presenta un rischio per l'ambiente e la salute.
  3. Acquista l'acido nitrilotriacetico, i polimeri poli-DL-alanina, l'acetato di ammonio ultrapuro / in tracce, l'idrossido di ammonio, l'acido acetico glaciale e l'acetonitrile di grado HPLC.

2. Preparazione delle soluzioni madre

  1. Peptide amb soluzione madre
    1. Preparare una soluzione acquosa di concentrazione di 12,5 mM amb pesando 10-20 mg del peptide liofilizzato utilizzando non meno di tre cifre significative e ponendolo in una provetta da microcentrifuga in polipropilene da 1,7 ml.
    2. Aggiungere il volume appropriato di acqua deionizzata (>17,8 MΩ cm) alla provetta della microcentrifuga. Chiudere il coperchio e mescolare bene con almeno 20 inversioni.
    3. Creare aliquote da 50 μL dalla soluzione amb da 12,5 mM e inserirle in provette da microcentrifuga marcate da 1,7 ml. Conservare le aliquote a -80 °C.
  2. Soluzioni stock di ioni metallici
    1. Preparare le soluzioni acquose di Zn(II) e Ni(II) con concentrazione di 12,5 mM pesando 10-30 mg di nitrato metallico esaidrato utilizzando non meno di tre cifre significative e ponendolo in una provetta da microcentrifuga in polipropilene da 1,7 ml.
    2. Aggiungere la quantità appropriata di acqua DI al tubo della microcentrifuga. Chiudere il coperchio e mescolare bene con almeno 20 inversioni. Conservare 50 μL di soluzioni madre aliquote a -80 °C.
  3. Soluzioni stock ioniche NTA
    1. Preparare una soluzione acquosa di NTA pesando 10-30 mg di NTA utilizzando non meno di tre cifre significative e mettendola in una provetta da microcentrifuga da 1,7 ml.
    2. Aggiungere la quantità appropriata di acqua DI all'NTA nel tubo della microcentrifuga per ottenere una concentrazione finale di 12,5 mM. Chiudere il coperchio e mescolare bene con almeno 20 inversioni. Conservare 50 μL di soluzioni madre aliquote a -80 °C.
  4. Soluzioni madre di acetato di ammonio: pesare 30,8 mg di acetato di ammonio e aggiungere a 40 ml di acqua DI per ottenere una soluzione da 10 mM. Regolare il pH della soluzione di acetato di ammonio a pH 7,7 con 1 mM di idrossido di ammonio.
  5. Soluzione madre di poli-DL-alanina: preparare una soluzione madre di poli-DL-alanina (PA) da 1 mL, 1.000 ppm, sciogliendo 1,0 mg di PA in acqua DI. Mescolare in modo completo. Creare aliquote da 50 μL e inserirle in provette per microcentrifuga etichettate individualmente. Conservare la soluzione da 1.000 ppm a -80 °C.

3. Analisi elettrospray-ion mobility-mass spectrometry (ES-IM-MS) di dissociazione indotta da collisione (CID)

  1. Preparare lo strumento pulendo il tubo di ingresso ES e il capillare metallico iniettando 500 μL di acido acetico glaciale 0,1 M, seguiti da 500 μL di idrossido di ammonio 0,1 M e infine 500 μL di soluzione di acetato di ammonio pH 7,7.
  2. Liquefare la soluzione madre amb da 12,5 mM portandola a temperatura ambiente. Creare una concentrazione finale di 0,125 mM amb effettuando due diluizioni successive con acqua DI. Mescolare abbondantemente dopo ogni diluizione.
  3. Liquefare la soluzione madre di ioni metallici da 12,5 mM portandola a temperatura ambiente. Creare una concentrazione finale di 0,125 mM di ioni metallici effettuando due diluizioni successive con acqua DI. Mescolare abbondantemente dopo ogni diluizione.
  4. Liquefare la soluzione madre NTA da 12,5 mM. Creare una concentrazione finale di 0,125 mM NTA effettuando due diluizioni successive con acqua DI. Mescolare abbondantemente dopo ogni diluizione.
  5. Per ottenere un campione di 2 ml del complesso ternario, aggiungere 800 μL di soluzione NTA 0,125 mM e 400 μL di soluzione di ioni metallici 0,125 in una provetta da microcentrifuga da 2 ml e mescolare accuratamente con almeno 20 inversioni. Aggiungere 400 μL di soluzione di acetato di ammonio (pH 7,7) e 400 μL di soluzione amb 0,125 mM, mescolare accuratamente con almeno 20 inversioni e lasciare equilibrare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente.
  6. Caricare il campione da 2 mL in una siringa a naso smussato da 2,5 mL e iniettare il campione nell'ES dello strumento utilizzando la pompa a siringa dello strumento con un flusso di 10 μL/min.
  7. Posizionare lo strumento in modalità IM-MS negativa. Utilizzare le condizioni operative tipiche dello strumento27 per questi esperimenti come segue.
    1. Iniettare il campione ad una portata di 10 μL/min nel capillare ES mantenuto a -2 kV con una portata di desolvatazione di azoto di 500 L/h. Impostare le temperature della sorgente ES e della desolvatazione rispettivamente su 130 °C e 263 °C. Impostare i coni di campionamento ed estrazione rispettivamente su 25 V e 3 V.
    2. Per gli esperimenti CID, utilizzare l'analizzatore di massa quadrupolo per selezionare il pattern isotopico del complesso ternario [amb+M(II)+NTA]- usando il m/z del picco monoisotopico con impostazioni di risoluzione di massa bassa = 4,5 e massa elevata = 16,5.
      NOTA: Gli ioni [amb+M(II)+NTA]- vengono fatti passare sulle guide ioniche sequenziali a tre onde viaggianti (T-wave ).
    3. Assicurarsi che l'onda T trappola abbia un flusso di gas argon di 3 ml/min e una pressione di 2,83 x 10-2 mbar. Impostare l'energia di collisione (CE) sulla trappola a 5 V per evitare qualsiasi dissociazione del complesso ternario. Lasciare che la trappola raccolga gli ioni del complesso ternario prima di rilasciarli (tempo di rilascio di 200 μs) nella guida ionica dell'onda T di mobilità ionica (IM) usando una polarizzazione DC trappola di 14 V, che mantiene al minimo la dissociazione del complesso all'ingresso IM.
    4. Assicurarsi che la guida ionica IM abbia una pressione di 0,507 mbar utilizzando una portata di 20 mL/min di gas tampone ultrapuro N2 . Rampare le onde T nel GI con altezze da 7 V a 30 V e con velocità da 290 m/s a 801 m/s per ogni sweep iniziale e finale della guida ionica IM.
    5. Impostare il flusso di argon e la pressione dell'onda T di trasferimento come l'onda T della trappola. L'onda T di trasferimento è stata utilizzata per la dissociazione indotta dalla collisione del complesso ternario [amb+M(II)+NTA]- utilizzando il trasferimento CE.
  8. Selezionare il modello isotopico m/z del complesso [amb+M(II)+NTA]- caricato negativamente usando il quadrupolo di trasmissione in modalità risolutiva.
    1. Identificare il modello isotopico m/z aprendo il programma di spettrometria di massa e selezionando Spettro. Selezionare Strumenti > modello isotopico. Nella finestra pop-up, elenca la formula molecolare del complesso, seleziona la casella Mostra ione carico, inserisci 1 per la carica di uno negativo e fai clic su OK.
    2. Nel modello isotopico visualizzato del complesso, notare il picco di massa più basso. Nel software dello strumento, selezionare Setup > Quad Profile. Nella finestra visualizzata, selezionare Fisso manuale e immettere la massa del picco del pattern isotopico più basso. Fare clic su Aggiorna e quindi su Chiudi.
    3. Selezionare nuovamente Setup , quindi fare clic su Resolving Quad. Raccogli gli spettri ES-IM-MS degli ioni negativi in modo incrementale attraverso una gamma di energie di collisione di trasferimento utilizzando una durata di 5 minuti e un tempo di scansione di 2 s.
      NOTA: Le energie di trasferimento preliminari possono essere testate da 26-60 V a intervalli di 2 V. L'intervallo finale di energie di collisione di trasferimento esaminate dovrebbe dimostrare l'assenza di dissociazione del complesso ternario alla più bassa energia e la completa dissociazione nei prodotti alla massima energia. Per un'analisi statistica di alta qualità, questa analisi ES-IM-MS dovrebbe essere eseguita per ciascun complesso antropologico almeno 3 volte da persone diverse e in giorni diversi per determinare le medie e le deviazioni standard.

4. Analisi della sezione trasversale di collisione (CCS) ES-IM-MS

  1. Pulire il tubo di ingresso ES e il capillare metallico con 500 μL di acido acetico glaciale 0,1 M, seguiti da 500 μL di idrossido di ammonio 0,1 M e infine 500 μL di soluzione di acetato di ammonio pH 7,7.
  2. Liquefare la soluzione madre PA da 1.000 ppm a temperatura ambiente ed eseguire due diluizioni seriali; diluire a 100 ppm PA con acqua DI, quindi diluire in soluzione PA 10 ppm diluendo con un rapporto 1: 1 di acqua DI e acetonitrile di grado HPLC.
  3. Raccogliere gli spettri IM-MS dello ione negativo del campione PA da 10 ppm per 10 minuti utilizzando condizioni operative strumentali.
    NOTA: La portata di iniezione e le condizioni della sorgente ES erano le stesse degli esperimenti CID (fase 3.). Per le misurazioni del CCS, l'analizzatore di massa a quadrupolo era in modalità non risolutiva e passava tutti gli ioni sulle tre guide ioniche sequenziali a onda T. Il funzionamento delle guide ioniche ad onda T trappola e ad onda T IM è stato lo stesso degli esperimenti CID. L'energia di collisione della cella a onda T di trasferimento era a 4 V per consentire agli ioni di passare attraverso senza dissociazione.
  4. Preparare ciascuno dei complessi ternari come descritto nei punti 3.2.-3.6.
  5. Raccogliere gli spettri IM-MS di ciascun complesso ternario per 5 minuti.
    NOTA: Utilizzare le stesse condizioni strumentali del punto 4.3.
  6. Raccogliere gli spettri IM-MS degli ioni negativi del campione PA da 10 ppm per 10 minuti.
    NOTA: La media dei tempi di arrivo dei calibranti PA raccolti prima e dopo i complessi amternari viene utilizzata nella determinazione della CCS.

5. Analisi dei dati CID ES-IM-MS

  1. Identificare la specie abbinando i modelli isotopici teorici m/z del complesso ternario e dei suoi prodotti agli spettri sperimentali IM-MS.
    1. Aprire il programma di spettrometria di massa e selezionare Cromatogramma per aprire una nuova finestra.
    2. Nella finestra Cromatogramma , fare clic su File > Apri per trovare e aprire il file di dati IM-MS desiderato.
    3. Fare clic con il pulsante destro del mouse, trascinare sul cromatogramma e rilasciare. Lo spettro MS verrà visualizzato in una finestra separata dello spettro .
    4. Nella nuova finestra che visualizza gli spettri, selezionare Strumenti > Modello isotopico. Apparirà una piccola finestra. Immettere la formula molecolare della specie amb, selezionare la casella Mostra ione carico e immettere lo stato di carica desiderato. Fare clic su OK.
    5. Per distinguere tutte le specie nello spettro IM-MS, ripetere questo processo nella finestra Spettro e registrare il loro intervallo di isotopi m/z .
  2. Per il complesso ternario amb e i suoi prodotti, utilizzare il loro intervallo di isotopi m / z per identificarli ed estrarre le loro distribuzioni del tempo di arrivo (ATD).
    1. Aprire il software di separazione della mobilità ionica e selezionare File > Apri per trovare e aprire il file di dati.
    2. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinare con il mouse per ingrandire l'intervallo isotopico m/z del complesso ternario [amb+M(II)+NTA]-.
    3. Con lo strumento selezione , fate clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinate per selezionare l'intervallo di isotopi specifico per [amb+M(II)+NTA]- come indicato al punto 5.1. Fare clic sul pulsante Accetta selezione corrente .
    4. Per eliminare qualsiasi specie m /z casuale o segnale di fondo, utilizzare lo strumento Selezione per scegliere l'ATD associato al complesso ternario. Fare clic sul pulsante Accetta selezione corrente .
    5. Per esportare il file ATD nel software di spettrometria di massa, andare su File > Export, quindi fare clic su Retain Drift Time. Rinominare il file, se lo si desidera, e salvarlo nella cartella appropriata.
  3. Determinare mediante integrazione dell'area sotto la curva ATD estratta l'intensità relativa della specie.
    1. Nella finestra Cromatogramma, aprire il file esportato salvato dal software di separazione della mobilità ionica. Selezionare Elabora, quindi Integra. Utilizzare un'impostazione di ampiezza picco-picco pari a 20 e fare clic su OK.
    2. Registrare l'area integrata come mostrato nella finestra Cromatogramma. Ripetere i passaggi 5.2.2.-5.2.5. per i due prodotti, vale a dire [NTA+M(II)]- e [amb+M(II)]-.
    3. Ripetere i passaggi 5.2.1.-5.3.2. per ogni energia di collisione di trasferimento registrata.
  4. Utilizzare le aree ATD integrate per il complesso ternario [amb+M(II)+NTA]- e due prodotti [NTA+M(II)]- e [amb+M(II)]- in ogni punto di energia di collisione di trasferimento per normalizzare a una scala percentuale relativa.
    1. Crea un foglio di calcolo inserendo le identità del complesso ternario e dei suoi prodotti e il loro ATD integrato ad ogni energia di collisione.
    2. Per ogni energia di collisione, utilizzare la somma degli ATD integrati per [amb+M(II)+NTA]-, [NTA+M(II)]-, e [amb+M(II)]- per normalizzare i loro singoli ATD su una scala percentuale relativa.
    3. Dalle misurazioni TCID replicate, trova la media e le deviazioni standard di ciascun punto dati. Convertire l'energia di collisione di trasferimento lab-frame (E lab) nell'energia di collisione del centro di massa (E cm) utilizzando le masse medie del gas di collisione argon (m Ar) e del complesso ternario (complesso m): E cm = Elab (m Ar)/(m Ar + m complesso).
      NOTA: Ecm rappresenta l'energia massima dalla collisione con il gas argon, che è disponibile per la dissociazione del complesso ternario.
    4. Tracciare la media e la deviazione standard delle singole intensità percentuali di [amb+M(II)+NTA]-, [NTA+M(II)]-, e [amb+M(II)]- in un grafico di intensità relativa (%) rispetto all'energia di collisione del centro di massa (eV) per mostrare come cambiano le intensità relative della specie in funzione dell'energia di collisione.

6. Analisi dei tempi medi di arrivo per la determinazione delle sezioni trasversali di collisione (CCS)

  1. Aprire il software di separazione della mobilità ionica e il file contenente lo spettro IM-MS del campione PA di 10 ppm raccolto con l'energia di collisione di trasferimento impostata a 4 V. Estrarre l'ATD di ciascuna delle singole specie di PA caricate negativamente ed esportare i file nel software di spettrometria di massa utilizzando l'opzione Retain Drift Time (vedere il passaggio 5.2.5.). Ripetere l'operazione per il secondo file di calibranti PA.
  2. Aprire il software di separazione della mobilità ionica. Utilizzare File > Apri per aprire uno dei file contenenti gli spettri IM-MS dei complessi ambternari registrati tra i calibranti PA. Estrarre l'ATD di ciascuno dei complessi ternari ed esportare i loro file nel software di spettrometria di massa utilizzando l'opzione Retain Drift Time (vedere il passo 5.2.5.).
  3. Utilizzare un metodo di calibrazione della sezione trasversale28 per calcolare il CCS del complesso ternario e dei suoi prodotti.
    1. In un foglio di calcolo, calcolare il CCS corretto (Ω c) per ciascuna delle singole specie di PA caricate negativamente dal loro CCS (Ω)29,30 misurato in gas tampone elio31 utilizzando l'equazione 1, dove z = carica del complesso ternario, ec = 1,602 x 10−19 C; m N2 = massa di azoto (u) e ione m = massa del complesso ternario28.
       figure-protocol-17428(1)
    2. Trovare i tempi di deriva (tD) dei calibranti PA e dei complessi ternari ottenendo prima i tempi medi di arrivo (tA) dai massimi delle corrispondenti curve ATD e quindi applicando l'equazione 2, dove c = coefficiente di ritardo del rivelatore (1,41 ms; controllare lo strumento in quanto può variare tra gli strumenti) e m / z = rapporto massa-carica del calibrante PA o complesso ambternario.
      tD =tA figure-protocol-18043 (2)
    3. Creare un grafico tracciando il t D dei calibranti PA rispetto a Ωc. Quindi, usando l'equazione 3, adatta i dati con una regressione dei minimi quadrati per trovare le costanti A 'e B, dove A' corregge il campo elettrico, la temperatura e la pressione nello strumento e B corregge il comportamento non lineare del dispositivo IM a onda T.
      Ωc = A' tDB (3)
    4. Utilizzando le costanti A' e B e il valore tD dei complessi ambternari, calcolare il loro Ωc usando l'equazione 3 e il loro Ω usando l'equazione 1. I valori CCS stimati con questo metodo hanno errori assoluti di circa il 2%29.

7. Metodi computazionali

  1. Utilizzare il metodo semi-empirico PM632 implementato nella modellazione strutturale e nel software computazionale33 per individuare i conformatori ottimizzati per la geometria dei complessi ternari [amb+M(II)+NTA]- e le coppie di prodotti ionici e neutri: [amb+M(II)]- + NTA e [NTA+M(II)]- + amb osservati dagli esperimenti CID. Fare riferimento all'utilizzo del visualizzatore di calcolo nel file supplementare per informazioni specifiche su come sviluppare e inviare calcoli.
    NOTA: Per i sistemi attuali, il metodo PM6 ha riprodotto correttamente i dati sperimentali, ma in generale, qualsiasi metodo di chimica quantistica affidabile e computazionalmente fattibile può essere utilizzato.
  2. Esegui ottimizzazioni geometriche e calcoli di frequenza su più strutture di partenza diverse per esplorare diverse conformazioni, stati di protonazione e potenziali siti di legame. Registrare le energie elettroniche + punto zero di ciascuno dei punti stazionari localizzati per ciascuno dei complessi ternari e dei loro prodotti.
    NOTA: le strutture di partenza per le ottimizzazioni geometriche devono esaminare diverse possibili combinazioni di siti di legame e disposizioni conformazionali. Le strutture di partenza erano basate sui precedenti conformi B3LYP34 [amb+M(II)] 3,4,6. Per [amb+M(II)+NTA]-, NTA è stato posizionato per competere con i siti sostituenti dell'amb in corrispondenza dell'Aa1-Aa 2-Aa 6-Aa 7 e del terminale carbossilato per lo stato di spin singoletto di Zn(II) o lo stato di spin della tripletta di Ni(II).
  3. Utilizzare un programma in grado di eseguire misurazioni accurate della sezione trasversale di collisione misurate in gas tampone di elio (CCSHe) utilizzando le coordinate atomiche di questi calcoli chimici quantistici35.
    NOTA: I programmi sviluppati per il calcolo accurato di CCSHe da strutture peptidiche localizzate mediante calcoli chimici quantistici includono MobCal 36 e HPCCS37,38.
  4. Scegli il conformatore a più bassa energia che esibisce ilCCS He di Lennard-Jones che concorda con ilCCS He misurato IM-MS per selezionare le strutture dei complessi ternari e dei prodotti di dissociazione da includere nel modello CRUNCH qui sotto.

8. Modellazione CRUNCH

  1. Creare un file di testo nel formato descritto nella sezione di discussione ("Formato del file di testo di input CRUNCH").
    NOTA: il file include le seguenti colonne: (−1) energia di collisione del centro di massa (Ecm), (1) media dell'intensità relativa del prodotto [amb+M(II)], (2) deviazione standard dell'intensità [amb+M(II)], (3) media dell'intensità relativa del prodotto [NTA+M(II)] e (4) deviazione standard dell'intensità [NTA+M(II)]-.
  2. Modellare il Ecentimetro-intensità dipendenti dei due canali di reazione [amb+M(II)+NTA]-a [amb+M(II)]- + NTA e [amb+M(II)+NTA]- a [NTA+M(II)]- + amb utilizzando la tecnica TCID nel programma CRUNCH.
    NOTA: Utilizzare le frequenze vibrazionali e rotazionali PM6 per il complesso ternario e i due canali del prodotto ionico e neutro. Utilizzare masse medie del complesso ternario, gas di collisione argon e prodotti ionici e neutri. Utilizzare i valori dei calcoli PM6 o del database NIST per le polarizzabilità (Å3) e momenti di dipolo (Debye) per i prodotti neutri.
    1. Dal menu principale di CRUNCH, apri il file di testo (. GB5) contenente le intensità relative dipendenti da Ecm dei prodotti. Risposta No ai parametri di lettura.
    2. Dal menu principale di CRUNCH, selezionare Modellazione > Imposta tutti i parametri. Dalle opzioni del modello di reazione, scegliere l'opzione CID soglia predefinita seguita da RRKM con integrazione sulla distribuzione di trasferimento di energia del complesso ternario20, immettere 2 per i canali di prodotto indipendenti modellati e selezionare Calcola sezioni trasversali. Immettere No per Due canali di prodotto hanno la stessa massa ionica?
    3. Per Product Channel # 1, immettere la colonna [1] per i dati sperimentali del prodotto [amb+M(II)]-, la colonna [2] per le deviazioni standard del prodotto [amb+M(II)], la colonna [5] per la sezione trasversale del modello non contorta e la colonna [6] per la sezione trasversale del modello contorto. Immettete 0 per i residui di adattamento.
      Nota : questi numeri di colonna corrispondono alle colonne nel file di input nel passaggio 8.1. come descritto nella discussione ("CRUNCH input text file format").
    4. Per Product Channel # 2, immettere la colonna [3] per i dati sperimentali del prodotto [NTA+M(II)], la colonna [4] per le deviazioni standard del prodotto [NTA+M(II)], la colonna [7] per la sezione trasversale del modello non contorta e la colonna [8] per la sezione trasversale del modello contorto. Immettete 0 per i residui di adattamento.
    5. Per il tipo di modello non contorto, scegliere la sezione trasversale 0 K (spostamento cinetico incluso), che include la correzione statistica RRKM degli spostamenti cinetici dovuti alla finestra temporale di 50 μs dalla cella di collisione al rivelatore TOF18.
    6. Per le opzioni di convoluzione, scegliete il doppio integrale di Tiernan, che include la convoluzione sulle distribuzioni di energia traslazionale tra lo ione complesso ternario e il gas di collisione argon21.
    7. Per il metodo di integrazione numerica, scegliere la quadratura gaussiana con sezioni trasversali pre-salvate, seguita dal numero di punti di integrazione = 32, dal numero di deviazioni standard = 3,0 e dal numero di deviazioni standard per il secondo integrale = 3,0.
    8. La massa dello ione complesso ternario (u) viene letta automaticamente da . GB5, seguito dalla massa del gas di collisione (39.948 per l'argon); utilizzare i valori predefiniti di 0,20 eV per il FWHM del fascio ionico e 298,15 K per la temperatura del gas. Il programma legge automaticamente le energie di collisione del centro minimo e massimo del centro di massa da . File di testo GB5; Utilizzare il valore predefinito per l'incremento energetico minimo.
    9. Utilizzare il valore predefinito per il fattore di ridimensionamento Sig0, No per consentire il ridimensionamento dei singoli canali di prodotto e i valori predefiniti per N e M. Per il metodo per il calcolo di g(i), scegliere integrare sulla densità ro-vibrazionale degli stati, che include la distribuzione interna dell'energia20 del complesso ternario [amb+M(II)+NTA]-.
    10. Dalle opzioni per l'inserimento dei parametri molecolari, immettere G per leggere il file di modellazione strutturale33 con le frequenze vibrazionali e rotazionali PM6 del complesso ternario. Risposta Sì alla domanda è uno dei reagenti atomici? Scrivere la posizione e il nome del file di modellazione.
      NOTA: Le altre opzioni per l'immissione delle frequenze vibrazionali e rotazionali includono il file dei parametri di lettura, che leggerà i parametri da un file di testo, o la modifica / immissione delle costanti, che consente l'immissione manuale di ciascun parametro.
    11. Scala le frequenze utilizzando il fattore di scala PM6 raccomandato dal NIST (1,062). Per maggiori dettagli sul ridimensionamento, vedere la discussione ("fattori di scala per le frequenze vibrazionali"). Il numero di atomi nel complesso ternario viene letto dal file. Risposta No a la molecola è lineare? Inserisci la descrizione dei reagenti (ad esempio, H+Zn+NTA- + Ar).
    12. Immettete 1 per la carica sullo ione e 1,664 per la polarizzabilità del gas argon39. La massa dello ione e la massa del bersaglio sono rispettivamente per il complesso ternario e l'argon e vengono lette automaticamente da . File di testo GB5. Immettete 0 per le vibrazioni armoniche.
      NOTA: le seguenti opzioni consentono di scegliere diversi fattori di scala per le frequenze vibrazionali alte o basse. Inserire 1.062 per le alte frequenze e 0.0 per le basse frequenze (vedi discussione: fattori di scala per le frequenze vibrazionali). Vengono mostrate le frequenze scalate. Scegliere 0 per selezionare Nessuna modifica.
    13. Premere Invio per leggere le costanti di rotazione 1D e 2D dal file di modellazione strutturale33 immesso nel passaggio 8.2.10. Selezionare i valori di default 0 per i trattamenti del rotore ostacolato e 1 per la simmetria della molecola.
      NOTA: il programma mostra i dati immessi; premi Invio per Nessuna modifica.
    14. Scegliere il valore predefinito 300 K per la temperatura del reagente. Selezionare Integrazione per il metodo per la riduzione della densità della matrice di stati. Selezionare Sì per troncare la distribuzione dell'energia. Immettere 40000 cm−1 per l'energia massima per la distribuzione, 2,0 cm−1 per la dimensione del contenitore e 32 per il numero di punti nella distribuzione dell'energia.
      NOTA: premere Invio 2x e verificare che la matrice troncata di 32 pt abbia una popolazione >0,9. Se >0,9, immettete No per cambiare i contenitori o il fattore di condensazione. Se <0,9, immettete Sì e modificate l'energia massima per la distribuzione e/o la dimensione del contenitore.
    15. Per i parametri per il modello TCID/RRKM, scegliete Sì per Modifica (Yes for Change), immettete 0 per il tempo fisso e 0,000050 s per il limite superiore della finestra di rilevamento. Per lo strumento utilizzato, questo è il tempo impiegato dagli ioni per viaggiare dalla cella di collisione di trasferimento al rivelatore TOF e viene calcolato utilizzando l'equazione 2.
    16. Per la molecola energizzata, immettere C per copiare i valori dai reagenti già inseriti. Immettere −1 per lo stato di transizione di origine (TS), 0 per il TS di destinazione e P per procedere.
    17. Per il canale di prodotto 1, selezionare 1 per singolo stato di transizione dalle opzioni del canale di dissociazione e 0 per nessuno per la dissociazione sequenziale. Per il tipo di stato di transizione, scegliete 1 per l'orbita.
    18. Selezionare G per leggere i file di programma di modellazione che contengono i parametri di rotazione e vibrazionali PM6 per i prodotti [amb+M(II)]- + NTA. Inserisci No per una delle specie PSL TS è atomica? Immettere la posizione e il nome del file [amb+M(II)]- . Usa 1.062 per le frequenze di scala, premi Invio per il numero di atomi e inserisci No per la molecola è lineare?
    19. Immettere la posizione e il nome del file di modellazione che contiene le frequenze vibrazionali e rotazionali per il prodotto NTA. Usa 1.062 per le frequenze di scala, premi Invio per il numero di atomi e inserisci No per la molecola è lineare? Inserisci la descrizione del TS orbitante, ad esempio H+Zn-... NTA.
    20. Immettete 1 per la carica dello ione [amb+M(II)], e inserite la polarizzabilità (16,12 Å3) e il momento di dipolo (4,6183 Debye) di NTA. Selezionare 0 K per la temperatura di rotazione e il dipolo bloccato per il trattamento dello stato di transizione orbitale. Immettere le masse medie (u) dello ione [amb+M(II)]- e dell'NTA.
    21. Immettete 0 per le vibrazioni armoniche. Immettete 1.062 per le alte frequenze e 0.0 per le basse frequenze. Vedere la sezione di discussione per ulteriori dettagli sulle frequenze di scala; Vengono mostrate le frequenze scalate. Scegliere 0 per selezionare Nessuna modifica. Premere Invio per leggere le costanti di rotazione 1D e 2D dai file di modellazione. Selezionare 0 per i rotori ostacolati, 1 per la simmetria molecolare e 1 per la degenerazione di reazione. Immettere l'opzione Nessuna modifica.
    22. Per il canale prodotto 2, selezionare 1 per il singolo stato di transizione, 0 per nessuno per la dissociazione sequenziale e 1 per l'orbita per il tipo di stato di transizione.
    23. Selezionare G per leggere i file di modellazione che contengono i parametri rotazionali e vibrazionali PM6 per i prodotti [NTA+M(II)]- e amb. Inserisci No per una delle specie PSL TS è atomica? Scrivere la posizione e il nome del file di modellazione [NTA+M(II)].
    24. Usa 1.062 per le frequenze di scala, premi Invio per leggere il numero di atomi e inserisci N per la molecola è lineare? Scrivere la posizione e il nome del file di modellazione amb. Usa 1.062 per le frequenze di scala, premi Invio per il numero di atomi e inserisci N per la molecola è lineare?
    25. Inserire la descrizione del TS orbitante (ad esempio, NTA+Zn-... H). Immettete 1.0 per la carica dello ione [NTA+M(II)], e inserite la polarizzabilità (Å3) e il momento di dipolo (Debye) dell'amb. Selezionate 0,0 K per la temperatura di rotazione e il dipolo bloccato per il trattamento dello stato di transizione orbitale. Immettere le masse medie (u) dei prodotti [NTA+M(II)]- e amb.
      NOTA: il file di output contiene la polarizzabilità e i momenti di dipolo dell'amb. La polarizzabilità è in unità di Bohr 3 e deve essere convertita nelle unità di Å3.
    26. Immettete 0 per le vibrazioni armoniche. Immettete 1.062 per le alte frequenze e 0 per le basse frequenze. Vedere la discussione per ulteriori dettagli sulle frequenze di scala. Vengono mostrate le frequenze scalate. Scegliere 0 per selezionare Nessuna modifica. Premere Invio per leggere le costanti di rotazione 1D e 2D dai file di modellazione. Selezionare 0 per i rotori ostacolati, 1 per la simmetria molecolare e 1 per la degenerazione di reazione. Immettere Nessuna modifica.
    27. Per gestire le rotazioni 2D inattive, selezionate le opzioni di default distribuzione statistica del momento angolare e integrate P(E,J) sulla distribuzione J. Utilizzare il valore predefinito 32 nel numero di punti nell'integrazione.
      NOTA: Queste selezioni scelgono il metodo per l'integrazione sui livelli J del momento angolare totale16,17. L'output risultante consente allo sperimentatore di verificare che tutti gli input siano corretti.
    28. Selezionare le energie di attivazione relative all'opzione della molecola energizzata e immettere l'energia relativa (eV) per il canale di prodotto 1 che è vicina all'energia di soglia osservata nel grafico dell'intensità relativa rispetto all'energia di collisione del centro di massa del prodotto [amb+M(II)]- (Figura 4).
    29. Per il canale di prodotto 2, immettere l'energia relativa (eV) vicina all'energia di soglia osservata nel grafico dell'intensità rispetto all'energia di collisione del centro di massa del prodotto [NTA+M(II)]. Per calcolare il numero di stati per ogni canale di prodotto, utilizzare una dimensione del contenitore pari a 2,0. Premere Invio e quindi No per continuare.
    30. Dal menu Modello, selezionate Ottimizza parametri per adattare i dati e immettete rispettivamente l'energia minima e l'energia massima per iniziare e terminare l'adattamento dei dati.
      NOTA: utilizzare un intervallo di energia ridotto che includa le soglie di entrambi i canali. Per ulteriori dettagli, vedere discussione: gamma di energia per adattare il modello TCID selezionato ai dati sperimentali.
    31. Selezionare -1 per le deviazioni standard sperimentali dei modi di ponderazione. Sulla base dei dati, selezionare una deviazione minima accettabile da 0,01 a 0,001. Selezionare No per il ridimensionamento ottimizzato dei singoli canali e 0 per il numero di iterazioni.
      NOTA: un'alternativa all'utilizzo di deviazioni standard è l'opzione statistica .
    32. Utilizzare il valore di default per il limite di convergenza E0 e selezionare No per mantenere qualsiasi parametro al valore corrente. Immettere 0,5 e 2,0 eV per i limiti inferiore e superiore per evitare errori di ottimizzazione e selezionare la differenza finita centrale per il metodo di valutazione delle derivate. Utilizzate il valore di default per la precisione numerica e selezionate No per modificare le dimensioni dei passi delle derivate.
      Nota : un metodo alternativo consiste nel selezionare Sì per mantenere qualsiasi parametro al valore corrente. Questo metodo è descritto ulteriormente nella discussione: ottimizzazione dei parametri.
    33. Dal menu Ottimizzazione , selezionare Inizia ottimizzazione. Il programma CRUNCH ottimizzerà il modello TCID selezionato in base ai dati sperimentali.
      NOTA: se l'ottimizzazione non trova adattamenti soddisfacenti, dal menu delle modifiche , provare a modificare l'intervallo di energia per coprire solo le prime intensità che salgono dalle soglie. Quando si trova un adattamento ragionevole, aumentare l'intervallo di energia e adattarsi di nuovo. Altre opzioni che possono aiutare a trovare adattamenti ai dati includono la scelta di mantenere qualsiasi parametro al valore corrente nei parametri ottimizzati e la modifica delle opzioni di ponderazione nei pesi. Vedere la discussione per queste opzioni.
    34. Quando viene trovato un modello adatto ai dati, premere Invio finché non viene visualizzato il menu Modello . Se solo una parte dell'intervallo di energia dei dati sperimentali è dotata del modello TCID, selezionare Calcola e convoluta modello per estendere l'adattamento del modello a tutte le energie di collisione sperimentali.
    35. Nel menu Modello , selezionate Delta H e S at T.
      NOTA: Il modello CRUNCH non contorto mette in relazione le energie di soglia 0 K con le entalpie 0 K (ΔH0) di dissociazione del complesso ternario nei due canali di prodotto indipendenti (Tabella 2). Le 298 K entalpie (ΔH 298) e le energie libere di Gibbs (ΔG298) di dissociazione sono anche derivate con correzioni termiche ed entropiche della meccanica statistica utilizzando il reagente e le frequenze rotazionali e vibrazionali PM6.

Risultati

La dissociazione indotta da collisione competitiva dei complessi ternari [amb+M(II)+NTA]- di A e H in [amb+M(II)]- + NTA o [NTA+M(II)]- + amb, è mostrata nella Figura 3. L'amb è mostrato come A o H e M = Zn o Ni. Il complesso ternario [A+Zn(II)+NTA] (Figura 3A) mostra soglie apparenti di circa 0,7 eV di energia di collisione (CE) per produrre [A+Zn(I...

Discussione

Passaggi critici
Analisi ES-IM-MS threshold collision-induced dissociation (TCID). Il TCID ha utilizzato la cella di trasferimento dell'onda T in presenza di argon come cella di collisione. Prima della dissociazione, gli ioni precursori vengono termicizzati da collisioni a bassa energia con azoto gassoso mentre passano attraverso la cellula di mobilità ionica (IM). Ciò si traduce in un TCID risoluto in energia più riproducibile di quanto si ottenga utilizzando la trappola

Divulgazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

Riconoscimenti

Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dalla National Science Foundation nell'ambito di 1764436, programma NSF REU (CHE-1659852), supporto per strumenti NSF (MRI-0821247), Physics and Astronomy Scholarship for Success (PASS) NSF project (1643567), Welch Foundation (T-0014) e risorse di calcolo del Dipartimento dell'Energia (TX-W-20090427-0004-50) e L3 Communications. Gli autori ringraziano Kent M. Ervin (University of Nevada - Reno) e Peter B. Armentrout (University of Utah) per aver condiviso il programma CRUNCH e per i consigli sul fitting da parte di PBA. Gli autori ringraziano il gruppo di Michael T. Bower presso l'Università della California - Santa Barbara per aver condiviso il programma Sigma.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile HPLC-gradeFisher Scientific (www.Fishersci.com)A998SK-4
Alternative metal binding (amb) peptidesPepmicCo (www.pepmic.com)designed peptides were synthized by order
Ammonium acetate (ultrapure)VWR97061-014
Ammonium hydroxide (trace metal grade)Fisher Scientific (www.Fishersci.com)A512-P500
Driftscope 2.1 software programWaters (www.waters.com)software analysis program
Gaussian 09GaussianElectronic Structure Modeling Software
GaussViewGaussianGraphical Interface to Visualize Computations
Glacial acetic acid (Optima grade)Fisher Scientific (www.Fishersci.com)A465-250
Ion-scaled Lennard-Jones (LJ) methodSigmaMichael T. Bowers’ group of University of California at Santa Barbara
MassLynx 4.1Waters (www.waters.com)software analysis program
Microcentrifuge TubesVWR87003-2941.7 mL, polypropylene
Microcentrifuge TubesVWR87003-2982.0 mL, polypropylene
Ni(II) nitrate hexahydrate (99% purity)Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)A15540
Poly-DL-alanineSigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)P9003-25MG
Waters Synapt G1 HDMSWaters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
Zn(II) nitrate hexahydrate (99%+ purity)Alfa Aesar (www.alfa.com)12313

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